Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj technika mierzy ścieżkę swobodnie pływających mikroskopijnych gatunków za pomocą ekspozycji na pojedynczej długości fali. C. elegans są używane do demonstracji obrazowania cieni jako niedrogiej alternatywy dla kosztownych mikroskopów. Technikę tę można dostosować do różnych orientacji, środowisk i gatunków w celu pomiaru kierunku, prędkości, przyspieszenia i sił.

Streszczenie

To badanie demonstruje tanią i prostą technikę, która pozwala na pomiar właściwości fizycznych, takich jak pozycja, prędkość, przyspieszenie i siły związane z zachowaniem lokomotorycznym nicieni zawieszonych w słupie wody w odpowiedzi na pojedyncze długości fal światła. Pokazujemy, jak ocenić lokomocję mikroskopijnego organizmu za pomocą obrazowania cienia o pojedynczej długości fali (SWSI) na dwóch różnych przykładach.

Pierwszy przykład to systematyczne i statystycznie opłacalne badanie średniego spadku C. elegans w słupie wody. Do tego badania wykorzystaliśmy żywe i martwe dzikie typy C. elegans. Kiedy porównaliśmy prędkość i kierunek aktywnego ruchu nicieni z biernym opadaniem martwych robaków w polu grawitacyjnym, badanie to nie wykazało różnicy w czasie opadania. Średnie opadanie wynosiło 1,5 mm/s ± 0,1 mm/s zarówno dla żywych, jak i martwych robaków przy użyciu spójnego światła 633 nm.

Drugi przykład to studium przypadku wybranych pojedynczych C. elegans zmieniających kierunek podczas opadania w pionowym słupie wody. Przyspieszenie i siła są analizowane w tym przykładzie. To studium przypadku pokazuje zakres innych właściwości fizycznych, które można ocenić za pomocą SWSI, jednocześnie oceniając zachowanie przy użyciu pojedynczych długości fal w środowisku, które nie jest dostępne dla tradycyjnych mikroskopów. Korzystając z tej analizy, oszacowaliśmy, że pojedynczy nicień jest zdolny do pchania z siłą przekraczającą 28 nN.

Nasze odkrycia wskazują, że żywe nicienie wywierają 28 nN, gdy skręcają, czyli poruszają się w kierunku przeciwnym do pola grawitacyjnego. Odkrycia sugerują ponadto, że nicienie pasywnie opadają w słupie wody, ale mogą aktywnie opierać się sile grawitacji, głównie poprzez kierunek skrętu.

Wprowadzenie

Caenorhabditis elegans to wolnożyjący, pożyteczny nicień glebowy, który stanowi potężny organizm modelowy do badania mechanizmów regulacji genów, rozwoju, a w ostatnim czasie także do zrozumienia biologii sensorycznej i zachowania. Mimo posiadania jedynie 302 neuronów, C. elegans są zdolne do złożonych wzorców lokomocyjnych, zachowań rozrodczych, nawigacji, chemotaksji i wielu innych zachowań. C. elegans posiadają mechanoreceptory, chemoreceptory, a nawet wykrywają niebieskie długości fal świetlnych (Ward et al., 2008)¹. Choć wiele wiadomo o obwodach neuronalnych funkcji sensoryczno-motorycznych i ogólnych wzorcach lokomocyjnych u C. elegans, mniej wiadomo o reakcjach na wiele jednoczesnych bodźców lub bardziej złożone warunki środowiskowe, niż te, które można modelować pod mikroskopem. Kilka badań wykazało bardziej złożone wzorce lokomocyjne, które wykazują wysoką plastyczność^2,3,4. Nasze podejście metodologiczne umożliwi badania nicieni w roztworze w czasie rzeczywistym, w którym możemy łatwo zapewnić wiele jednoczesnych warunków środowiskowych. Kwestia ta jest trudna do rozstrzygnięcia przy użyciu konwencjonalnych technik obrazowania opartych na mikroskopie. Opracowaliśmy technikę obrazowania, która pozwala nam umieścić nicienie w kolumnie wody w celu zbadania zachowań lokomocyjnych, a także określenia zdolności nicieni do zmiany lokomocji w odpowiedzi na różne warunki środowiskowe.

W niniejszej pracy po raz pierwszy zaprezentowano obrazowanie cieni w pojedynczej długości fali (SWSI), aby rozwiązać problemy wynikające z ograniczeń tradycyjnych mikroskopów. Tradycyjne mikroskopy ograniczają obserwację organizmów do poziomej płaszczyzny ogniskowania o głębokości zaledwie kilku mikronów^5,6. W odniesieniu do badań w pojedynczej długości fali, większość tradycyjnych mikroskopów wykorzystuje filtry kolorystyczne do bardzo szerokiego filtrowania białego światła, zazwyczaj w zakresie 50-100 nm. Zastosowanie lasera w metodzie SWSI zawęża wybór długości fali do mniej niż 1 nm, przy jednoczesnym zachowaniu znacznej intensywności światła⁷. Podobnie, pojedyncze długości fal były wykorzystywane do pomiaru częstotliwości pływania C. elegans w czasie rzeczywistym⁸.

W ramach pierwszej demonstracji naszej metody monitorujemy pozycję poziomą, x, oraz pozycję pionową, y, swobodnie pływającego nicienia C. elegans w kolumnie wody, na odcinku około jednego centymetra. W szczególności interesuje nas ruch pionowy, ponieważ grawitacja również działa w pionie. Nachylenie dopasowania liniowego do pozycji pionowej określa prędkość pionową, v_y, nicienia podczas opadania w kolumnie wody:
     (1)

Pierwiastek błędu średniokwadratowego (RMSE)⁹ określa jakość dopasowania i wskazuje, czy prędkość opadania jest ogólnie stała. Następnie oblicza się średnie prędkości pionowe dla każdego gatunku oraz dla martwych nicieni. Na podstawie tych wyników można oszacować siłę oporu, jakiej podlegają nicienie.

W ramach drugiej demonstracji naszej metody wybraliśmy osobniki C. elegans, które w przeciwieństwie do większości obserwowanych nicieni nie opadały ze stałą prędkością. Wybrane nicienie albo zawracały i płynęły w górę, albo zawisały w toni na pewien czas przed kontynuowaniem opadania. Pod kątem fizycznym to studium przypadku pokazuje, że można obliczyć siłę ciągu płynącego mikroorganizmu. Prawa Newtona stanowią, że ciało zmieniające kierunek ruchu przyspiesza, co oznacza, że działa na nie wypadkowa siła, ¹⁰:
     (2)

gdzie oznacza pęd liniowy, a t to czas. Przyspieszenie dżdżownicy jest wprost proporcjonalne do siły działającej na dżdżownicę, ponieważ jej masa pozostaje stała. W rezultacie wypadkowa siła w pionie wynosi:
(3)

gdzie m oznacza masę dżdżownicy, a a_y reprezentuje przyspieszenie w pionie. Siła wypadkowa w kierunku pionowym stanowi zatem siłę ciągu dżdżownicy w tym samym kierunku. Całkowity ciąg można obliczyć, uwzględniając składową poziomą.

Protokół

1. Przygotowanie C. elegans

1. Przygotować płytki Petriego młodych dorosłych C. elegans, jak opisano w poprzednich eksperymentach z udziałem zawiesiny C. elegans w kuwecie wypełnionej płynem¹¹.
2. W dniu analizy wideo należy pobrać żywe młode dorosłe nicienie bezpośrednio do kuwety wypełnionej dejonizowaną, destylowaną wodą za pomocą platynowego kilofa, jak opisano w kroku 2.
3. Przygotować martwe C. elegans z ekspozycją na chloroform. Kontynuuj, postępując zgodnie z procedurą opisaną dla zbierania żywych nicieni opisaną w kroku 2.

2. Konfiguracja optyczna do analizy wideo

1. Zmontuj konfigurację eksperymentalną, aby utworzyć obrazy cieni, jak pokazano na rysunku 1. Kamerę można umieścić w dowolnej odległości od ekranu, o ile jest w stanie uchwycić widok ekranu z przodu. Dobre miejsce znajduje się obok kuwety skierowanej w stronę ekranu.
   1. Użycie co najmniej dwóch luster do skierowania przestrajalnego lasera helowo-neonowego do ekspandera wiązki Galileusza, tak aby wiązka została rozszerzona do średnicy 12 mm.
   2. Umieść jeden lub dwa otwory w ścieżce belki tak, aby belka przechodziła przez otwory bez przeszkód. Użyj otworów, aby upewnić się, że wyrównanie jest zachowane.
   3. Skieruj rozszerzoną belkę na zamontowaną kuwetę kwarcową o szerokości 10 mm, głębokości 10 mm i wysokości 4 cm.
   4. Powiększ wiązkę za pomocą soczewki płasko-wypukłej o dodatniej ogniskowej 75 mm.
   5. Umieść ekran projekcyjny w odległości około 120 cm od obiektywu. Odległości większe niż ta spowodują większe powiększenie obrazu w cieniu. Jednak jakość obrazu będzie się pogarszać wraz z mniejszym natężeniem światła i zwiększoną zauważalną interferencją dyfrakcyjną.
   6. Umieść szybką kamerę, która jest w stanie uzyskać co najmniej 60 kl./s, tuż obok kuwety skierowanej w stronę ekranu.
2. Umieść mikroskop preparacyjny w pobliżu układu optycznego, aby szybko przenieść nicienie do kuwety.
3. Tymczasowo zabezpiecz przezroczystą linijkę z podziałkami mm do środka uchwytu kuwety prostopadle do rozszerzonej wiązki, tak aby wiązka rzutowała powiększony obraz linijki na ekran. Ustaw skalę długości dla analizy wideo.
   1. Na ekranie projekcyjnym zaznacz odległość skali za pomocą przezroczystej linijki poza środkiem wyświetlanego obrazu, aby uniknąć zakłóceń projekcji. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
   2. Nagraj ten obraz i zmierz powiększenie. Usuń linijkę z konfiguracji. Powtórz ten krok dla innych długości fal, ponieważ kąt załamania światła dla każdej długości fali przez soczewkę będzie się różnić z powodu aberracji chromatycznych.
4. Wymień kuwetę i napełnij ją wodą destylowaną z dokładnością do 1 mm od obręczy.
5. Rozpocznij nagrywanie, gdy światło w pomieszczeniu jest włączone, tak aby odległość skali była uwzględniona w tym samym materiale filmowym, co wyświetlany obraz. Wyłącz światło.
6. Używając cienkiego, spłaszczonego szpikulca z drutu platynowego, przesuwaj pojedyncze młode dorosłe C. elegans pojedynczo z płytki agarowej do kuwety, dotykając kilofem powierzchni wody. Nicienie staną się widoczne w słupie wody, gdy dostaną się do wiązki z powodu rozproszonego światła. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
7. Sfilmuj wyświetlane obrazy robaków, gdy przechodzą przez rozszerzoną wiązkę laserową. Ważne jest, aby pamiętać, że wyświetlany obraz jest odwrócony, a robaki będą wydawać się poruszać w kierunku przeciwnym do ich rzeczywistego ruchu. Robaki, które opadają z grawitacją, wydają się poruszać w górę na ekranie (Rysunek 2).

3. Przygotowanie danych wideo

1. Zaimportuj wideo do programu do analizy wideo.
2. Ustaw skalę za pomocą wcześniej ustalonego współczynnika powiększenia.
3. Śledź liniowe przemieszczenie głowy nicienia cienistego za pomocą co najmniej 10 punktów danych na całej przebytej ścieżce.
4. Znajdź prędkość w kierunku pionowym, biorąc pochodną ("Y", "Czas") i podziel tę wartość przez współczynnik powiększenia określony w kroku 2.2.

4. Analiza danych

1. Przeanalizuj liniowe zejście C. elegans:
   1. Upewnij się, że punkty danych na wykresie pozycji pionowej w funkcji czasu zazwyczaj tworzą linię prostą. Niektóre odchylenia można zignorować ze względu na ruch głowy nicienia. Jeżeli punkty danych zazwyczaj tworzą linię prostą, należy przejść do kroku 4.1.2, w przeciwnym razie spadek jest nieliniowy i analizę należy kontynuować zgodnie z krokiem 5.1 niniejszego protokołu.
   2. Utwórz linię regresji liniowej, dopasowując linię prostą¹² do danych z menu Analiza. Nachylenie tej linii jest wówczas prędkością pionową C. elegans. Nachylenie to zmiana położenia podzielona przez zmianę czasu w określonym przedziale czasu. W ten sposób określ prędkość opadania żywych i martwych robaków (rysunek 3).
   3. Uśrednić pionowe prędkości pływania nicieni. Wystarczająca jest próbka o wielkości około 50 robaków. Porównaj prędkości pływania u żywych robaków z prędkościami dryfu u martwych robaków.

5. Analiza ruchu nieliniowego C. elegans

1. Z sekcji 3 wybierz analizowany plik wideo, który pokazuje nieliniowe opadanie w obrębie słupa wody (rysunek 4). Nieliniowe zejście można zidentyfikować za pomocą kroku 4.1.1 w niniejszym protokole.
2. Wybierz opcję "Dopasowanie krzywej" z menu "Analiza" w oprogramowaniu do analizy wideo. Wybierz wielomian drugiego rzędu (kwadratowy). Dopasuj krzywą.
3. W przypadku obszaru zainteresowania dostosuj dopasowanie na wykresie, przesuwając nawiasy po obu stronach dopasowania na wykresie, aż krzywa znajdzie się bardzo blisko punktów danych w pasowaniu i/lub dobrze w paskach błędów. Program dopasowania podaje wyrażenie matematyczne dla dopasowanej krzywej, które jest położeniem pionowym w funkcji czasu. Należy wziąć pod uwagę błędy dopasowanej krzywej podane przez program związane z właściwościami fizycznymi. Błąd względny wynoszący 15% lub mniej jest zwykle dopuszczalny.
4. Dodaj więcej pasowań krzywych, aby pokryć dodatkowe sekcje danych. Splajn¹³ funkcje zapewniające optymalne pokrycie: upewnij się, że krzywa pasuje do nakładania się i spróbuj wyrównać sąsiednie krzywe tak, aby nachylenia pasowały do nakładających się obszarów.
5. Prędkość dla obszaru zainteresowania należy uzyskać, biorąc pochodną dopasowanej krzywej, korzystając z wyrażenia matematycznego otrzymanego w kroku 5.1.3. Prędkości mogą się zmieniać w czasie. Zauważ, że pochodna jest nachyleniem funkcji. Pochodną można uzyskać matematycznie lub graficznie. W takim przypadku praktyczne jest użycie podanego wyrażenia matematycznego.
6. Weź drugą pochodną dopasowanych krzywych, aby uzyskać przyspieszenie. Przyspieszenie może się zmieniać w czasie.
7. Pomnóż przyspieszenie przez masę ślimaka, aby obliczyć ciąg, jaki wywiera robak. Rozsądna szacowana masa to 3 μg, przy założeniu, że robak składa się głównie z wody.

Wyniki

Równomierne opadanie

Pierwsze badanie nie wykazuje zauważalnej różnicy w prędkościach opadania C. elegans podczas SWSI przy użyciu 633 nm. Stwierdzono, że prędkości opadania były stałe i wynosiły 1,5 mm/sec ± 0,1 mm/sec zarówno dla żywych, jak i martwych C. elegans. Próba 50 osobników pozwoliła uzyskać rozsądną wariancję na poziomie 7% dla nicieni żywych i martwych. Na nicienie nie działa przyspieszenie, ponieważ prędkość opadania jest stała, zatem siła oporu jest równa sile grawitacji pomniejszonej o siłę wyporu. Implikuje to, że gęstość nicienia jest nieco większa niż gęstość wody; niemniej jednak, dla poniższych szacunków nadal praktyczne jest założenie, że gęstość nematody jest w przybliżeniu równa gęstości wody.

Zmiana kierunku

Drugie badanie, będące studium przypadku, wykazuje, że nicienie są zdolne do zmiany kierunku i mogą płynąć w górę przeciwko grawitacji. Do pionowego przemieszczenia nicienia dopasowano dwie krzywe w taki sposób, aby drugie pochodne tych krzywych mogły zostać wykorzystane do wykreślenia zależności przyspieszenia od czasu (Rysunek 5). Zaleca się utrzymywanie możliwie niskiego stopnia wielomianu przy jednoczesnym zachowaniu dobrego dopasowania. Niższy stopień wielomianu oznacza mniejszą zmienność przyspieszenia w czasie. Wyższe stopnie składników wielomianowych będą pomijalne, a zatem niepotrzebne, jeśli stopień wielomianu będzie zbyt wysoki. Ten osobnik zwalnia ze stałą prędkością 0,110 mm/sec² ± 0,002 mm/sec², zawraca i przyspiesza z taką samą prędkością 0,110 mm/sec² ± 0,002 mm/sec² aż do momentu niedługo po punkcie zwrotnym. C. elegans kontynuuje ruch w górę ze zmniejszającym się przyspieszeniem wynoszącym 1,252 - 0,00708 t w mm/sec², aż do spadku przyspieszenia do zera. Biorąc pod uwagę Równanie 3 oraz szacowaną masę nicienia wynoszącą 3 μg, na nicienia działa wypadkowa siła pionowa, F_Ny, o wartości 0,33 pN aż do momentu niedługo po punkcie zwrotnym.

Zstępowanie: Na dżdżownicę do momentu osiągnięcia punktu zwrotnego działają trzy rodzaje sił: grawitacja, opór, wyporność i siła napędowa (Rycina 6a). Siła wypadkowa jest równa sumie wektorowej tych trzech sił. Tutaj rozważamy wyłącznie składowe pionowe:
F_Ny = F_Dy+F_Ty-F_g+F_B     (4)

gdzie F_B jest siłą wyporu. F_g ma taką samą wartość, ale przeciwny kierunek co siła wyporu, zakładając, że gęstość dżdżownicy jest równa gęstości wody. Równanie 4 można zatem zapisać w następujący sposób:
F_Ny = F_Dy+F_Ty     (5)

F_Ny pozostaje stałe podczas opadania. Oznacza to, że suma F_Dy+F_Ty pozostaje stała, dopóki nicień nie dotrze do punktu zwrotnego. F_Dy jest największe na górze, czyli na początku ścieżki, i stopniowo zmniejsza się do zera, aż prędkość osiągnie zero w punkcie zwrotnym, podczas gdy F_Ty musi wzrosnąć, aby utrzymać stałą wartość F_Ny.

Punkt zwrotny: W punkcie zwrotnym w kierunku pionowym nie występuje siła oporu, ponieważ prędkość pionowa w tym punkcie wynosi zero. Jedynymi siłami działającymi w kierunku pionowym są grawitacja, -F_g, siła wyporu, F_B oraz pionowa siła ciągu nicienia, F_Ty, jak przedstawiono na Rysunku 6b. W tym punkcie można wyznaczyć siłę ciągu C. elegans:
F_Ty = F_Ny  (6)

Siła ciągu na dole trajektorii wynosi wówczas w przybliżeniu 0,33 pN, co stanowi około 0,001% masy nicienia. Biorąc pod uwagę, że szacowany ciężar F_g C. elegans wynosi 28 nN,

Wznoszenie: Podobnie, podczas wznoszenia siła oporu wzrasta, ale jest skierowana w dół (Rysunek 6c):
F_Ny = -F_Dy+F_Ty(7)

Siła ciągu wywierana przez dżdżownicę musi teraz być jeszcze większa i równać się sumie siły oporu i ciężaru. Dżdżownica zwalnia po rozpoczęciu płynięcia w górę. Aby płynąć w górę z taką samą prędkością, z jaką dżdżownica opadała, musiałaby ona wywrzeć siłę ciągu w górę wynoszącą co najmniej dwa razy jej ciężar.

Lewitacja

Przykład nicienia, który spowalnia swoje opadanie przez około 3 sec, przedstawiono na Rysunku 7. Wielomian 3^ego stopnia stanowi odpowiednie dopasowanie do całej ścieżki. Błędy przyspieszenia i prędkości wynikające z tego dopasowania są mniejsze niż 15%. Nicień zaczyna od znacznego pchnięcia w górę, zwalnia i zaczyna zawracać w 68 sec; jednak przyspieszenie w górę stale maleje (Rysunek 8) do momentu, gdy wypadkowe przyspieszenie zrówna się z zerem około 68,5 sec. Prowadzi to ostatecznie do wypadkowego przyspieszenia w kierunku w dół, po którym następuje kolejny punkt zerowy prędkości (Rysunek 9) i w 69 sec nicień ponownie zaczyna opadać.

Interesujące jest to, że maksymalne zaobserwowane przyspieszenie pionowe w tym przypadku wynosi 2,7 mm/sec². Przyspieszenia w punktach zwrotnych wynoszą odpowiednio 0,455 mm/sec² oraz - 0,455 mm/sec², co jest wartością około czterokrotnie większą niż w przypadku nicienia, który odwraca się i płynie w górę. Korzystając z równania 6, można oszacować, że siła ciągu skierowana w górę w pierwszym punkcie zwrotnym wynosi około 1,32 pN. W drugim punkcie zwrotnym wypadkowe przyspieszenie jest ujemne, zatem siła ciągu w górę wynosi 1,32 pN.

Rycina 1. Układ doświadczalny. Laser, rozszerzacz wiązki, soczewka i ekran są kluczowe dla układu doświadczalnego. Lustra kierujące i otwory pinowe mogą zostać pominięte, jednak spowoduje to mniejszą stabilnośćy wyrównania optycznego.

Rysunek 2. Obraz cienia o pojedynczej długości fali (SWSI). Przy użyciu światła laserowego o mocy 2 mW i długości fali 543 nm cień nicznia zostaje rzutowany na ekran. Obraz jest odwrócony, przez co niczeń wydaje się spadać w górę.

Rycina 3. Pionowe opadanie pojedynczego dzikiego typu C. elegans w kolumnie wody. Ten nicień był oświetlony spójnym światłem o długości fali 633 nm. Nachylenie dopasowania liniowego wskazuje na prędkość opadania wynoszącą 1.09 mm/sec ± 0.01 mm/sec. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4. Wykres przemieszczenia pojedynczego osobnika typu dzikiego C. elegans płynącego w górę. Dwa dopasowania metodą splajnów śledzą całkowitą ścieżkę nicienia. Druga pochodna dopasowania ujawnia przyspieszenie. Maksymalne przyspieszenie można łatwo wyznaczyć z pierwszego dopasowania: 0,110 mm/sec² ± 0,002 mm/sec². Wyświetlono tylko kilka słupków błędów, aby punkty danych i dopasowanie pozostały widoczne. Nicień ten był oświetlony spójnym światłem o długości fali 633 nm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rycina 5. Wykres przyspieszenia pojedynczego osobnika dzikiego typu C. elegans. Ten nicień utrzymuje stałe przyspieszenie skierowane w górę o wartości 0,110 mm/sec² ± 0,002 mm/sec², co powoduje jego zwolnienie, a następnie ruch w górę. Krótko po punkcie zwrotnym przyspieszenie stale maleje, a wypadkowe przyspieszenie zmniejsza się do zera. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 6. Diagramy sił dla fazy opadania, punktu zwrotnego i fazy wznoszenia. Siła wyporu i siła grawitacji mają taką samą wartość i przeciwne kierunki, zatem ich działanie znosi się wzajemnie. Z tego powodu nie zostały one naniesione na tych diagramach. (a) Robak opada, przy czym siła oporu i siła ciągu są skierowane w górę. (b) Robak znajduje się w najniższym punkcie trajektorii, bez siły oporu. Siła ciągu jest skierowana w górę. (c) Robak wznosi się, przy czym siła oporu jest skierowana w dół, a siła ciągu w górę.

Rysunek 7. Wykres przemieszczenia pojedynczego zawisłego nicienia. Nicień zwalnia i zaczyna zawracać około 68 s, ale zaczyna opadać około 69 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Wykres przyspieszenia pojedynczego zawisającego nicienia. Nicień ten rozpoczyna ruch z przyspieszeniem skierowanym w górę wynoszącym 2,7 mm/sec², które następnie spada do zera, aż w końcu osiąga przyspieszenie skierowane w dół o wartości -2,6 mm/sec². Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 9. Wykres prędkości pojedynczego zawieszonego nicienia. Nicień ten zatrzymuje się w 68 s i zaczyna poruszać się w górę, zwalnia i osiąga prędkość zero w kierunku pionowym w 69 s, po czym następuje opadanie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1. Średnie prędkości opadania N2 C. elegans. Śledzono opadanie 50 żywych i 50 martwych nicieni. Średnia prędkość opadania była taka sama dla osobników żywych i martwych: 1.5 mm/sec ± 0.1 mm/sec.

Dyskusja

Technika SWSI zapewnia dodatkowy sposób na zrozumienie zdolności lokomotorycznych mikroskopijnych organizmów, takich jak wolno żyjące nicienie. W tej technice rozróżniliśmy aktywną lokomocję (pływanie) i bierne dryfowanie z powodu grawitacji działającej na martwe nicienie. Ponadto, gdy nicienie swobodnie pływające zmieniają kierunek podczas poruszania się w wodzie, jesteśmy w stanie zmierzyć siły oporu i siły kątowe, które działają na nicienie i są wywierane przez nicienie.

Nicienie napotykają różne warunki środowiskowe w glebie. W glebie znajdują się kieszenie wodne, a także cząstki stałe i materiały biologiczne o różnych kształtach i teksturach. Ponadto nicienie istnieją w środowisku grawitacyjnym, na które reagują¹⁴. Ponadto nicienie w pobliżu powierzchni gleby są narażone na różne długości fal światła, zmiany temperatury i wilgotności, a także zmienne biologiczne, takie jak bakterie, grzyby drapieżne i inne organizmy glebowe. Nicienie muszą reagować na wszystkie te różne zmienne, pływając i pełzając w różnych mediach, obracając się i zmieniając strategie nawigacyjne. Wszystkie te złożone obliczenia są wykonywane przez zaledwie 302 neurony, z których podzbiór bierze udział w lokomocji, oraz 95 komórek mięśniowych ściany ciała. Pomiary tego rodzaju opisane techniką SWSI dostarczają ważnych informacji na temat tego, w jaki sposób nicienie osiągają tę nawigacyjną złożoność.

W pierwszej części zmierzyliśmy ogólne tempo opadania dzikiego typu C. elegans w świetle 633 nm. Korzystając z tych pomiarów, możemy oszacować siłę oporu, jaką napotyka robak.

W przypadku nicienia przyspieszającego, zaangażowane siły zmieniają się w sposób ciągły, ponieważ siła oporu zmienia się wraz z prędkością. Jest kilka stwierdzeń, które jesteśmy w stanie wypowiedzieć na temat sił działających na robaka. Gdy robak zwalnia i próbuje płynąć w górę, pionowa składowa siły oporu maleje, aż osiągnie zero w najniższym punkcie trajektorii nicienia. W tym momencie robak musi mieć siłę skierowaną w górę, aby podpłynąć.

Ta metoda może być modyfikowana na kilka sposobów. Każdy mikroskopijny gatunek, który porusza się w klarownej cieczy, może być śledzony za pomocą SWSI. Badania można prowadzić na dowolnych długościach fal, które są dostępne dla aparatów cyfrowych. Aparaty cyfrowe zazwyczaj odbierają fale o długości od UV do bliskiej podczerwieni. Ponadto badania poziome można przeprowadzić, kierując laser pionowo do góry. Gatunki można następnie umieścić na poziomej przezroczystej powierzchni, takiej jak szkiełko mikroskopowe. Regulacja ekspandera wiązki lub soczewki powiększającej za ekspanderem wiązki może wyostrzyć rozmyte obrazy. Użytkownik powinien upewnić się, że wszystkie elementy są przymocowane do stołu, aby zapewnić spójne i łatwe wyrównanie belki.

Metoda jest ograniczona dostępnymi długościami fal lasera i rozdzielczością. Zasadniczo zalety tej metody w porównaniu z istniejącymi mikroskopami, którymi są elastyczność w kierunkach i długościach fal, są również słabościami, ponieważ konfiguracja jest prosta. Niewyszukana optyka i plamki lasera ograniczają rozdzielczość. Niektóre z tych wad z pewnością można poprawić w przyszłości, włączając filtr przestrzenny i wyświetlając obraz bezpośrednio na kamerze CCD.

Najbardziej krytycznych kroków w protokole można się łatwo nauczyć, gdy eksperyment jest wykonywany po raz pierwszy. Umieszczenie nicienia w kuwecie bez tworzenia turbulencji ma kluczowe znaczenie. Ponadto wibracje mogą zakłócać konfigurację i zmieniać zachowanie robaków. Pamiętaj, aby ograniczyć moc, która jest używana do cieniowania obrazu. 2 mW dla wiązki laserowej o średnicy 1 mm powinno być maksymalnym, aby uniknąć efektów nagrzewania. Konfiguracja powinna zostać przetestowana pod kątem efektów rozpraszania podczas używania cieczy innych niż woda destylowana.

Obecnie większość mikroskopów działa w płaszczyźnie poziomej przy użyciu światła białego lub filtrów kolorowych, które nadal są bardzo szerokie w zakresie długości fal. Mikroskopy, które naprawdę wykorzystują pojedyncze długości fal i mają elastyczność w scenariuszu oglądania, tj. umieszczeniu poziomym, są zwykle ograniczone do jednej lub drugiej zalety. Ponadto tego typu mikroskopy są zwykle bardzo drogie i nadal ograniczają się do płaszczyzn ogniskowych, w przeciwieństwie do naszej metody. Nasz zestaw można łatwo zbudować przy wyjątkowo niskim budżecie. Metoda ta jest gotowa do wykorzystania przez szkoły, firmy ekologiczne, a także inne podmioty, które działają z niewielkimi funduszami. W przyszłości metoda ta może być wykorzystana w bardzo wyrafinowanym układzie do badania wpływu w czasie rzeczywistym na lokomocję i mechanosensację mikroskopijnych gatunków. Ta metoda sprawia, że badania pojedynczej długości fali w szerokim zakresie kątów i głębokości widzenia są łatwo dostępne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przestrajalny laser helowo-neonowy	Elektrooptyka badawcza	30602	Można wybrać cztery długości fal od 543 nm do 633 nm.
2 Aluminiowe lusterka na przedniej powierzchni	Thorlabs	PF10-03-F01
Szybka kamera Exilim Casio
Kuweta kwarcowa	Starna Cells	21/G/5
LoggerPro (oprogramowanie)	Noniusz		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Wolfram		http://www.wolfram.com/
5x-10x zmienny zoom Ekspander wiązki Galileusza	Thorlabs	BE05-10-A
Plano-wypukły obiektyw o dodatniej ogniskowej 75 mm	Thorlabs	LA1257