Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Podsumowanie

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Streszczenie

Testy oparte na transferze energii rezonansu bioluminescencji (BRET) dostarczają czułego i niezawodnego sposobu monitorowania interakcji białko-białko w żywych komórkach. BRET to nieradiacyjny transfer energii z enzymu lucyferazy "donora" do "akceptorowego" białka fluorescencyjnego. W najczęstszej konfiguracji tego testu dawcą jest lucyferazy Renilla reniformis, a akceptorem jest żółte białko fluorescencyjne (YFP). Ze względu na to, że efektywność transferu energii jest silnie zależna od odległości, obserwacja zjawiska BRET wymaga, aby dawca i akceptor znajdowali się w bliskiej odległości. Aby przetestować interakcję między dwoma białkami będącymi przedmiotem zainteresowania w hodowanych komórkach ssaków, jedno białko ulega ekspresji jako fuzja z lucyferazy, a drugie jako fuzja z YFP. Interakcja między dwoma białkami będącymi przedmiotem zainteresowania może zbliżyć donora i akceptora do siebie na tyle, aby nastąpił transfer energii. W porównaniu z innymi technikami badania interakcji białko-białko, test BRET jest czuły, wymaga niewiele czasu i niewiele odczynników, a także jest w stanie wykryć interakcje, które są słabe, przejściowe lub zależne od środowiska biochemicznego znajdującego się w żywej komórce. Jest to zatem idealne podejście do potwierdzania przypuszczalnych interakcji sugerowanych przez badania proteomiczne drożdży z dwiema hybrydami lub spektrometrią mas, a ponadto dobrze nadaje się do mapowania oddziałujących regionów, oceny wpływu modyfikacji potranslacyjnych na interakcje białko-białko oraz oceny wpływu mutacji zidentyfikowanych w DNA pacjenta.

Wprowadzenie

Zarówno klasyczne powiązania, jak i sekwencjonowanie nowej generacji badań nad ludzkimi zaburzeniami ujawniają kliniczne znaczenie białek zaangażowanych w szereg szlaków biologicznych. Często zdarza się, że przed ich identyfikacją w takich badaniach nie prowadzono prawie żadnych badań nad biologiczną rolą tych białek. Jednym z owocnych sposobów na rozpoczęcie badania biologicznej funkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania jest określenie, z jakimi innymi białkami oddziałuje ono w swoim kontekście fizjologicznym. Scharakteryzowanie sieci molekularnych w ten sposób zapewnia wgląd w szlaki biologiczne leżące u podstaw ludzkiego fenotypu.

Najczęściej stosowanymi metodami badań przesiewowych na dużą skalę do identyfikacji potencjalnych partnerów interakcji dla interesujących białek są badania przesiewowe drożdży z dwiema hybrydami¹ i proteomika oparta na spektrometrii mas². Metody te mogą być bardzo skuteczne w sugerowaniu potencjalnych oddziałujących białek, ale są podatne na fałszywie dodatnie wyniki. W związku z tym potwierdzenie interakcji zidentyfikowanej za pomocą badań przesiewowych drożdży z dwiema hybrydami lub spektrometrii mas wymaga walidacji interakcji przy użyciu drugiej techniki. Zazwyczaj w tym celu stosuje się test koimmunoprecypitacyjny lub pull-down³. Jedną z wad stosowania takich technik do walidacji jest wymóg lizy komórek, która niszczy warunki wewnątrzkomórkowe, które mogą być niezbędne do utrzymania pewnych interakcji białkowych. Drugą wadą jest to, że słabe lub przejściowe interakcje białek mogą zostać zakłócone podczas etapów mycia. Co więcej, testy te wymagają znacznego czasu pracy praktycznej, mają ograniczoną liczbę próbek, które można przetwarzać jednocześnie, i często wymagają czasochłonnej optymalizacji odczynników i protokołów.

Aby przezwyciężyć niektóre problemy związane z eksperymentami z koimmunoprecypitacją, opracowano kilka testów opartych na białkach fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych, które mogą być stosowane w żywych komórkach. Pierwsze takie testy opierały się na fluorescencyjnym (lub Försterowskim) rezonansowym transferze energii (FRET), nieradiacyjnym transferze energii między dwoma białkami fluorescencyjnymi o nakładających się widmach emisji i wzbudzenia⁴. Efektywność transferu energii jest silnie zależna od odległości, dlatego obserwacja zjawiska FRET wymaga, aby fluorofory donorowe i akceptorowe znajdowały się w bliskiej odległości. Aby przetestować interakcję między dwoma białkami będącymi przedmiotem zainteresowania, jedno białko wyraża się jako fuzję z fluoroforem donorowym (zwykle cyjanowym białkiem fluorescencyjnym; CFP), a drugi jako fuzja z akceptorem fluoroforu (zwykle żółte białko fluorescencyjne; YFP). Interakcja między dwoma białkami będącymi przedmiotem zainteresowania może zbliżyć fluorofory donorowe i akceptorowe na tyle blisko, aby nastąpił transfer energii, co spowoduje mierzalny wzrost emisji światła z akceptora YFP w stosunku do donora CFP. W ramach projektu FRET udało się wykryć interakcje białko-białko w żywych komórkach⁴. Główną wadą stosowania FRET do wykrywania oddziaływań białko-białko jest wymóg zewnętrznego oświetlenia w celu wzbudzenia fluoroforu dawcy. Oświetlenie zewnętrzne powoduje wysokie tło w sygnale emisyjnym, niepożądane wzbudzenie akceptora oraz fotobielenie zarówno fluoroforów donorowych, jak i akceptorowych. Efekty te zmniejszają czułość testu w wykrywaniu interakcji białko-białko.

Modyfikacja testu FRET, która rozwiązuje problem wysokiego tła z zewnętrznego oświetlenia, to test BRET, test rezonansu bioluminescencji (BRET)^5,6. W systemie BRET fluorofor donorowy jest zastępowany przez enzym lucyferazy. W ten sposób energia potrzebna do wzbudzenia fluoroforu akceptorowego jest generowana w systemie przez utlenianie substratu lucyferazy, co sprawia, że oświetlenie zewnętrzne nie jest potrzebne. W najczęstszej konfiguracji tego testu dawcą jest lucyferazy Renilla reniformis, a akceptorem YFP (w celu omówienia alternatywnych białek donorowych i akceptorowych patrz Pfleger i wsp.⁵). W związku z tym w tym systemie białko będące przedmiotem zainteresowania jest łączone z lucyferazy, a potencjalnie oddziałujące białko z YFP lub odwrotnie. Test BRET wymaga dodania celelenterazyny jako substratu lucyferazy. Ponieważ koelenterazyna jest przepuszczalna dla komórek, możliwe jest wykonanie testów BRET na żywych komórkach. Jednak natywna koelenterazyna jest niestabilna w roztworze wodnym, a niezależny od enzymu rozkład koelenkterazyny zarówno zmniejsza stężenie substratu dostępnego do testu, jak i generuje autoluminescencję, co zmniejsza czułość pomiarów aktywności lucyferazy. Zastosowanie BRET w żywych komórkach zostało ułatwione dzięki opracowaniu chronionych koelenterazyn, które są stabilne w roztworze wodnym, ale po dyfuzji przez błonę komórkową są rozszczepiane przez esterazy cytozolowe w celu wytworzenia aktywnej koelenkterazyny wewnątrz komórki⁷.

Po dodaniu substratu do komórek wyrażających białka fuzyjne lucyferazy i YFP, transfer energii wynikający z interakcji białko-białko jest określany ilościowo poprzez monitorowanie emisji z lucyferazy i YFP. Ponieważ interakcje białek mogą być monitorowane bezpośrednio w żywych komórkach na płytkach wielodołkowych, test BRET stanowi prostą, skalowalną metodę walidacji przypuszczalnych interakcji, która jest efektywna kosztowo i czasowo.

Oprócz walidacji domniemanych interaktorów zidentyfikowanych w proteomicznych badaniach przesiewowych, system BRET może być również używany do testowania potencjalnych interaktorów wynikających z wcześniejszych badań biochemicznych i strukturalnych na interesującym nas białku. Po ustaleniu istnienia interakcji białko-białko (za pomocą testu BRET lub innych technik), istnieje możliwość dalszego zastosowania testu BRET w celu scharakteryzowania interakcji. Na przykład, oddziałujące regiony można mapować, generując skrócone wersje białek, a udział określonych reszt w interakcji można wykazać, tworząc mutacje punktowe. Ponadto można badać modulacyjny wpływ modyfikacji potranslacyjnych lub małych cząsteczek (takich jak leki lub ligandy) na interakcje białko-białko^8-10.

Test BRET ma również duży potencjał do badania mutacji zidentyfikowanych w DNA pacjenta. W przypadkach, w których ustalono przyczynową rolę mutacji, badanie wpływu mutacji na interakcje białko-białko za pomocą BRET może ujawnić więcej informacji na temat etiologii molekularnej fenotypu¹¹. Od czasu pojawienia się metodologii sekwencjonowania nowej generacji coraz częściej zdarza się, że u danej osoby identyfikuje się kilka potencjalnie szkodliwych mutacji, w którym to przypadku nie jest jasne, które są istotne dla fenotypu¹². W tej sytuacji test BRET może być cenny w ocenie wpływu mutacji na funkcję białek, a tym samym ich znaczenia dla zaburzenia.

Protokół

1. Tworzenie plazmidów

1. Subklonuj cDNA dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania zarówno do wektorów pLuc, jak i pYFP, stosując standardowe techniki biologii molekularnej (ryc. 1). Szczegółowe protokoły można znaleźć w Green i wsp. ¹³.
2. Sekwencjonuj wszystkie konstrukty, aby sprawdzić, czy interesujące białka znajdują się w ramce z sekwencją Luc / YFP bez interweniujących kodonów stop.
3. Wykonaj testy funkcjonalne zgodnie z potrzebami, aby potwierdzić, że białka fuzyjne zachowują aktywność biologiczną. W przedstawionym przypadku subkomórkową lokalizację białek fuzyjnych YFP ustalono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
4. Twórz plazmidy ekspresyjne dla odpowiednich białek kontrolnych Luc i YFP, inżynierując odpowiednie sygnały celujące w wektory ekspresyjne pLuc i pYFP. W przedstawionym tutaj przypadku wygeneruj ukierunkowane na jądro konstrukty Luc i YFP, wstawiając sygnał lokalizacji jądrowej do wektorów pLuc i pYFP.
5. Stwórz konstrukt kontroli pozytywnej, w którym Luc i YFP są połączone w jeden polipeptyd. W przedstawionym tutaj przypadku należy wygenerować kontrolę dodatnią, w której sekwencja kodująca YFP jest wprowadzana do wektora pLuc.
6. Wybierz neutralny plazmid wypełniający, który ma być użyty do wyrównania masy DNA w mieszankach transfekcyjnych. Użyj plazmidu, który nie ma promotora eukariotycznego i dlatego będzie nieaktywny transkrypcyjnie w komórkach ssaków, takiego jak wektor klonowania bakterii.

2. Przygotowanie mieszanek DNA

1. Oszacować stężenie wszystkich plazmidów opisanych w sekcji 1 na podstawie absorbancji przy 260 nm (1 jednostka absorbancji odpowiada 50 μg/ml DNA). Określ masę cząsteczkową każdego plazmidu, mnożąc liczbę par zasad przez 650 Da. Użyj stężenia i masy cząsteczkowej, aby obliczyć stężenie molowe każdego preparatu plazmidowego. Rozcieńczyć preparaty plazmidowego DNA do stężenia 36 nM. Będą to zapasy robocze, które zostaną wykorzystane do przygotowania mieszanek DNA do transfekcji.
2. Przygotować kontrolną mieszaninę DNA zawierającą 1 800 ng plazmidu wypełniającego w końcowej objętości 20 μl wody.
3. Przygotować kontrolną mieszaninę DNA zawierającą 5 μl konstruktu kontrolnego pLuc. Dodaj plazmid wypełniający, aby doprowadzić całkowitą masę DNA do 1,800 ng. Dodaj wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 20 μl.
4. Przygotować kontrolną mieszaninę DNA zawierającą 5 μl konstruktu kontrolnego pLuc i 5 μl konstruktu kontrolnego pYFP. Dodaj plazmid wypełniający, aby doprowadzić całkowitą masę DNA do 1,800 ng. Dodaj wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 20 μl.
5. Przygotować kontrolną mieszaninę DNA zawierającą 5 μl konstruktu kontroli pozytywnej. Dodaj plazmid wypełniający, aby doprowadzić całkowitą masę DNA do 1,800 ng. Dodaj wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 20 μl.
6. Przygotuj następujące mieszaniny DNA do zbadania homodimeryzacji białka będącego przedmiotem zainteresowania, X. Dla każdej mieszaniny DNA należy połączyć 5 μl odpowiedniego konstruktu pLuc i 5 μl konstruktu pYFP. Dodaj plazmid wypełniający, aby doprowadzić całkowitą masę DNA do 1,800 ng. Dodać wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 20 μl.
   A) pLuc-control i pYFP-X
   B) pLuc-X i pYFP-control
   C) pLuc-X oraz pYFP-X
7. Przygotuj następujące mieszanki DNA, aby przetestować interakcję między parą białek będących przedmiotem zainteresowania, X i Y. Dla każdej mieszaniny DNA należy połączyć 5 μl odpowiedniego konstruktu pLuc i 5 μl konstruktu pYFP. Dodaj plazmid wypełniający, aby doprowadzić całkowitą masę DNA do 1,800 ng. Dodać wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 20 μl.
   A) pLuc-control i pYFP-X
   B) pLuc-X i pYFP-control
   C) pLuc-control i pYFP-Y
   D) pLuc-Y i pYFP-control
   E) pLuc-X oraz pYFP-Y
   F) pLuc-Y oraz pYFP-X

3. Transfekcja

1. Zebrać subkonfluentne komórki HEK293 z kolby o średnicy^{75 cm2}. Rozcieńczyć 10% wszystkich komórek w 13 ml pożywki hodowlanej. Dozować 130 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki białej, przezroczystej, 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Hodowla komórek przez 24 godziny.
2. Oblicz liczbę studzienek do transfekcji, mnożąc liczbę mieszanin DNA przez 3. Doprowadź pożywkę hodowlaną bez surowicy do temperatury pokojowej. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 6,3 μl pożywki bez surowicy i 0,18 μl odczynnika do transfekcji na studzienkę. Wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
3. Przygotować mieszaniny do transfekcji, dodając 2 μl mieszanki DNA do 20 μl pożywki bez surowicy/odczynnika do transfekcji. Nie wirować. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Transfekcja trzech studzienek, z których każda miesza transfekcyjna, dozując 6,5 μl mieszanki transfekcyjnej na studzienkę. Hoduj komórki przez kolejne 36-48 godzin.

4. Pomiar sygnału BRET

1. Rozpuścić substrat lucyferazy żywej komórki w stężeniu 34 mg/ml w DMSO przez wirowanie.
2. Rozcieńczyć odtworzony substrat lucyferazy żywej komórki w stosunku 1:1 000 w pożywce do rozcieńczania substratu podgrzanej do temperatury 37 °C. Pozostawić 50 μl pożywki do rozcieńczania substratu na studzienkę. Wirować do mieszania. Może powstać osad, ale nie będzie zakłócał testu.
3. Odessać pożywkę hodowlaną z płytki 96-dołkowej. Dozować 50 μl rozcieńczonego substratu lucyferazy z żywych komórek do każdej studzienki. Hoduj komórki przez co najmniej 2 godziny (do 24 godzin).
4. Zdjąć pokrywkę z płytki 96-dołkowej i inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz luminometru.
5. Mierz emisję z Luc i YFP po jednym odwiercie na raz. Zmierz emisję z Luc za pomocą filtra blokującego fale dłuższe niż 470 nm. Zmierz emisję z YFP za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 500-600 nm. Integracja sygnałów emisyjnych przez 10 sekund.

5. Analiza danych

1. Uśrednij odczyty emisji Luc z 3 studzienek, które otrzymały tylko plazmid wypełniający. Odejmij tę wartość od wszystkich innych odczytów emisji Luc, aby uzyskać wartości emisji Luc odjęte od tła.
2. Uśrednić odczyty emisji YFP z 3 odwiertów, które otrzymały tylko plazmid wypełniający. Odejmij tę wartość od wszystkich innych odczytów emisji YFP, aby uzyskać wartości emisji YFP odjęte od tła.
3. Dla każdego odwiertu należy podzielić wartość emisji YFP odjętą przez wartość emisji Luc odjętą w tle, aby uzyskać nieskorygowany współczynnik BRET.
4. Uśrednić nieskorygowane współczynniki BRET z trzech dołków, które zostały transfekowane tylko plazmidem kontrolnym pLuc. Odejmij tę wartość od wszystkich innych nieskorygowanych współczynników BRET, aby uzyskać skorygowane współczynniki BRET.
5. Dla każdego z pozostałych zestawów skorygowanych współczynników BRET należy uśrednić wartości z trzech transfekowanych studzienek, aby uzyskać ostateczny współczynnik BRET.

Wyniki

Zasada testu BRET jest zilustrowana na rysunku 2. Układ testowy stosowany w przedstawionych tutaj eksperymentach przedstawiono na rysunku 3. Wykrycie silnego sygnału BRET z komórek transfekowanych białkiem fuzyjnym lucyferazy-YFP potwierdziło, że transfer energii był możliwy do zaobserwowania w tym układzie eksperymentalnym (Figura 4).

Nasze badania koncentrują się na roli rodziny represorów transkrypcyjnych FOXP w rozwoju mózgu. Heterozygotyc...

Dyskusja

Opracowanie konstruktów ekspresji białek fuzyjnych jest kluczowym krokiem w tworzeniu testu BRET. W przedstawionych tutaj eksperymentach interesujące białka zostały połączone z C-końcem lucyferazy lub YFP. Możliwe jest również, a nawet może być konieczne, fuzja białek z N-końcem lucyferazy/YFP. W przypadku niektórych białek fuzje mogą być akceptowane tylko na końcu N lub C, aby uniknąć zakłócenia struktury i funkcji białka. Ponadto, w przypadku białek transbłonowych, w których końce N i C znajdują się w różnych przedział...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nanodrop 8000	Nanodrop		Odpowiedni będzie każdy spektrofotometr zdolny do odczytu absorbancji przy 260 nm. Określenie masy cząsteczkowej plazmidu ma kluczowe znaczenie dla obliczenia ilości DNA, które mają być wykorzystane w mieszankach transfekcyjnych.
Płytki 96-dołkowe, płaskie dno, białe	Płytki Greiner Bio One	655098	White zmniejszają przesłuchy między studzienkami i maksymalizują czułość wykrywania luminescencji. Studzienki z czystym dnem umożliwiają monitorowanie gęstości komórek. Płytki muszą być odpowiednie do hodowli komórkowej. W przypadku korzystania z luminometru z górnym odczytem należy zdjąć pokrywę płyty.
Nieskończony czytnik płytek F200Pro z oprogramowaniem sterującym	TECAN		Do pomiaru luminescencji należy używać filtrów "Blue 1" i "Green 1" oraz zestawów filtrów i lustra dychoicznego do GFP. Odpowiedni jest dowolny czytnik płytek odczytowych z możliwością pomiaru dwukolorowej luminescencji i fluorescencji.
pLuc, pYFP, plazmid kontroli dodatniej	N/A	N/A	Plazmidy dostępne u autorów na życzenie.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Plazmid wypełniający do równoważenia masy DNA w mieszankach transfekcyjnych. Każdy plazmid pozbawiony promotora eukariotycznego byłby odpowiedni.
Komórki HEK293	ECACC	85120602	Inne linie komórkowe, które transfekują z rozsądną wydajnością, mogą być odpowiednie.
DMEM, wysoka zawartość glukozy, z czerwienią fenolową	Gibco	41966	Jest to pożywka używana do hodowli komórek HEK293. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem. Jeśli używasz innej linii komórkowej, zastąp opisaną tutaj pożywkę wzrostową pożywką specyficzną dla linii komórkowej.
DMEM, wysoka zawartość glukozy, bez czerwieni fenolowej (podłoże rozcieńczające substrat)	Gibco	21063	Jest to pożywka do rozcieńczania substratu stosowana do rozcieńczania substratu lucyferazy (EnduRen), ponieważ nie zawiera czerwieni fenolowej, co zmniejsza czułość testu. Zawiera HEPES w celu utrzymania prawidłowego pH podczas pomiarów luminescencji, gdy komórki są poza inkubatorem CO2. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM służy do rozcieńczania odczynnika do transfekcji GeneJuice. Odpowiednie byłyby również inne podłoża bez surowicy. Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej.
Surowica bydlęca płodu	Gibco	10270	Do suplementacji pożywek do hodowli komórkowych w stężeniu 10% v/v.
Odczynnik do transfekcji GeneJuice	Novagen	70967	W przypadku korzystania z linii komórkowej innej niż HEK293 może być konieczne dostosowanie stosunku odczynnika do transfekcji Genejuice do DNA w mieszankach transfekcyjnych. Można stosować inne odczynniki do transfekcji. W przypadku korzystania z alternatywnego odczynnika do transfekcji może być konieczne zoptymalizowanie ilości DNA użytego w mieszankach do transfekcji w oparciu o instrukcje producenta.
DMSO	Sigma	D2650	Użyj sterylnego DMSO, który jest odpowiedni do hodowli tkankowej.
Substrat z żywych komórek EnduRen	Promega	E6481	Rozpuszcza EnduRen w stężeniu 34 mg/ml w DMSO. Po rozcieńczeniu EnduRen w pożywce hodowlanej może powstać osad. Nie będzie to kolidować z testem. Przygotowany EnduRen należy przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C i unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Upewnij się, że rozpuszczony EnduRen jest całkowicie rozmrożony przed rozcieńczeniem go w pożywce hodowlanej.