Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji małych RNA z ludzkiej surowicy. Zastosowaliśmy tę metodę do wyizolowania mikroRNA z surowicy nowotworowej do zastosowania w macierzach DNA, a także w ilościowym PCR singleplex. W protokole wykorzystuje się odczynniki tiocyjanianu fenolu i guanidyny z modyfikacjami w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.

Streszczenie

Analiza RNA i jego ekspresji jest powszechną cechą w wielu laboratoriach. Istotne jest pojawienie się małych RNA, takich jak mikroRNA, które znajdują się w komórkach ssaków. Te małe RNA są silnymi regulatorami genów kontrolującymi ważne szlaki, takie jak wzrost, rozwój i śmierć, a duże zainteresowanie skierowano na ich ekspresję w płynach ustrojowych. Wynika to z ich rozregulowania w chorobach człowieka, takich jak rak, i ich potencjalnego zastosowania jako biomarkerów w surowicy. Problematyczna może być jednak analiza ekspresji miRNA w surowicy. W większości przypadków ilość surowicy jest ograniczona, a surowica zawiera niewielkie ilości całkowitego RNA, z czego małe RNA stanowią tylko 0,4-0,5%¹. W związku z tym wyizolowanie wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA z surowicy jest obecnie głównym wyzwaniem dla naukowców. W tym dokumencie technicznym przedstawiamy metodę, która wykorzystuje tylko 400 μl ludzkiej surowicy do uzyskania wystarczającej ilości RNA do macierzy DNA lub analizy qPCR. Zaletą tej metody jest jej prostota i możliwość uzyskania wysokiej jakości RNA. Nie wymaga specjalistycznych kolumn do oczyszczania małych RNA i wykorzystuje ogólne odczynniki i sprzęt, które można znaleźć w zwykłych laboratoriach. Nasza metoda wykorzystuje żel Phase Lock w celu wyeliminowania zanieczyszczenia fenolem, jednocześnie uzyskując wysokiej jakości RNA. Wprowadzamy również dodatkowy krok, aby jeszcze bardziej usunąć wszystkie zanieczyszczenia na etapie izolacji. Protokół ten jest bardzo skuteczny w izolowaniu wydajności całkowitego RNA do 100 ng/μl z surowicy, ale może być również dostosowany do innych tkanek biologicznych.

Wprowadzenie

W ostatnich latach coraz częściej dąży się do odkrycia nowych biomarkerów do wczesnego wykrywania chorób ludzkich. Wiele uwagi poświęcono wykorzystaniu małych RNA, takich jak mikroRNA2 (miRNA lub miR) jako potencjalnych markerów. Te małe RNA znajdują się w płynach ustrojowych, takich jak surowica, a badania wykazały, że są odporne na degradację i są stabilne w różnych warunkach środowiskowych³. Biorąc pod uwagę te cechy, surowica lub krążące miRNA są idealnym biomarkerem ^4,5. Obecnie istnieją dwa główne podejścia do izolacji małego RNA z płynów biologicznych. Pierwsze podejście wykorzystuje technologię opartą na kolumnach do wiązania i elucji małych RNA⁶, podczas gdy drugie podejście wykorzystuje długotrwały protokół z odczynnikami tiocyjanianu fenolu i guanidyny⁷. Opracowaliśmy prosty, skuteczny, pozbawiony kolumn protokół izolowania małych RNA z ludzkiej surowicy. Wyizolowane RNA nadaje się do natychmiastowego wykorzystania w dalszych zastosowaniach, w tym w macierzach oligonukleotydowych DNA i sekwencjonowaniu RNA.

Ten protokół został opracowany, ponieważ napotkaliśmy kilka problemów podczas korzystania z metod opartych na fenolu do izolowania RNA z surowicy. Tradycyjne podejście Chomczyńskiego jest często stosowane w większości laboratoriów z szeregiem odczynników dostępnych u większości komercyjnych dostawców. Jednak biorąc pod uwagę ich powszechne stosowanie, nie opracowano rygorystycznych wytycznych dotyczących konsekwentnego wytwarzania wysokiej jakości RNA z płynów ustrojowych, w szczególności krwi lub surowicy.

Częste problemy związane z izolacją RNA z surowicy obejmują niską wydajność RNA i zanieczyszczenie odczynnikami używanymi podczas izolacji, szczególnie fenolem. Nasze podejście eliminuje te zanieczyszczenia fenolowe, aby zapewnić wysokiej jakości RNA do dalszych analiz, takich jak ilościowy PCR (qPCR) i sekwencjonowanie RNA. Przeprowadziliśmy dalsze testy tego RNA na macierzach miRNA.

Protokół

Uwaga: Próbki ludzkiej surowicy od zdrowych pacjentów lub pacjentów z rakiem zostały uzyskane za świadomą zgodą zgodnie z zatwierdzonymi ludzkimi protokołami etycznymi z Royal Prince Alfred Hospital Sydney (numer protokołu X10-0016 i HREC/10/RPAH/24) oraz University of Technology w Sydney. Próbki surowicy pobrano od pacjentów przed operacją z różnych szpitali w Sydney i umieszczono w magazynie w temperaturze -80 °C.

1. Izolacja małego RNA z surowicy

Całkowite RNA zostało przygotowane z ludzkiej surowicy przy użyciu zmodyfikowanej wersji protokołu Tri-Reagent RT LS.

1. Rozmrozić zamrożoną próbkę surowicy na lodzie, a następnie przenieść 400 μl świeżo rozmrożonej surowicy do znakowanej probówki do mikrowirówki.
2. Rozcieńczyć surowicę 100 μl_H2Owolnego od RNaz i dodać proteinazę K w stężeniu 1 mg/ml.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby umożliwić trawienie białek przez proteinazę K.
4. Aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność, dodaj 1,5-krotność objętości Tri-Reagent RT LS i 100 μl 4-bromoanizolu.
5. Na krótko odwrócić homogenat, wykonywać powtarzalne pipetowanie przez 5 sekund i przenieść do oznakowanej probówki o pojemności 2 ml z ciężkim zamkiem fazowym.
6. Wirować homogenat w temperaturze 12 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
7. Ostrożnie zdekantować co najmniej 1 ml otrzymanego roztworu wodnego do świeżej probówki Lobind DNA. Substancja organiczna i interfaza powinny być uwięzione pod białym żelem rurki Phase Lock.
8. Dodać 5,0 μl glikogenu (5 mg/ml) i 500 μl 100% izopropanolu do roztworu wodnego, wymieszać przez inwersję i inkubować O/N w temperaturze -20 °C.
9. Po inkubacji O/N odwirować próbkę przez 20 minut pod ciśnieniem 12 000 × g w wirówce o temperaturze 4 °C.
10. Odrzucić klarowny supernatant i wirować przez 2 minuty pod ciśnieniem 16 000 × g w wirówce o temperaturze 4 °C.
11. Ostrożnie usunąć klarowny roztwór otaczający osad za pomocą pipety.
12. Przemyć granulat 1 ml 70% etanolu i odwirować przy 10 000 × g przez 10 minut. Zdekantować roztwór płuczący i powtórzyć etap mycia.

2. Ponowne zawieszenie RNA do roztworu

1. Zawiesić osad w 10 μl H₂O wolnego od RNaz, upewniając się, że osad jest całkowicie rozpuszczony. Aby upewnić się, że RNA jest całkowicie rozpuszczone, próbkę można podgrzać do 55 °C przez 5 minut. W tym czasie wymieszać próbkę, wielokrotnie pipetując. Aby uzyskać wyższą całkowitą wydajność RNA, połącz dwa preparaty RNA od tego samego pacjenta.
2. Określ ilościowo ponownie zawieszony RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis i oceń jakość RNA za pomocą bioanalizatora 2100. Zbiorcze próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w dalszych zastosowaniach.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia typowe widmo UV/Vis RNA wyizolowanego z surowicy. Na podstawie tego profilu odnotowano zanieczyszczenie białkami przy 280 nm, a także zanieczyszczenia fenolem i związkami organicznymi odpowiednio przy 270 nm i 230 nm. Przy 260 nm odnotowano również pozostałości tiocyjanianu guanidyny. Aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń, wprowadzono szereg kroków optymalizacyjnych w standardowej procedurze Tri-Reagent RT-LS. Dodano 5 mg/ml glikogenu, aby zwiększyć całkowitą wydajność RNA oraz zreduk...

Dyskusja

Populacja mikroRNA stanowi około 0,4-0,5% całkowitego RNA znajdującego się w surowicy. Ponadto w surowicy ludzkiej znajduje się również wysoka zawartość białka. Aby poprawić RNA i zmniejszyć zanieczyszczenie zarówno białkami, jak i fenolami, zmodyfikowaliśmy tradycyjne podejście Chomczynskiego⁹ , dodając kilka kroków.

Całkowite RNA wyizolowano z surowicy przy użyciu standardowego Tri-Reagent RT-LS (Centrum Badań Molekularnych), jednak metoda ta przeprowadzona w naszym laboratorium d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tri-Reagent RT LS	Molecular Research Center, USA	TR 118
Wolne od RNaz H2O	GIBCO Invitrogen	10977-023
Proteinaza K	Finnzymes, Finlandia	EO0491
Rurka z blokadą ciężkiej fazy	5PRIME	2302830	pojemność 2 ml
Probówka DNA Lobind	Eppendorf	0030 108.078	1.5 ml pojemność
Glycogen	Invitrogen, USA	10814-010	5 mg / ml
Izopropanol klasy RNA	Sigma Aldrich, USA	I9516	100%
Wirówka z chłodzeniem	John Morris
Nanodrop Spektrofotometr UV-Vis	Thermo Fisher Scientific, USA
klasy RNA	Sigma Aldrich, USA	E7023	70%
Bioanalizator Agilent 2100	Agilent, Stany Zjednoczone