Artykuł metodologiczny

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

DOI:

10.3791/51446

⸱

27 sierpnia 2014

 ,  ,  ,  , 
1LENS - European Laboratory for Non-linear Spectroscopy, University of Florence, 2Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 3Department of Biology, University of Florence, 4Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 5National Institute of Optics-National Research Council, Italy, 6International Center of Computational Neurophotonics

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje połączenie pęsety optycznej i wykrywania fluorescencji pojedynczej cząsteczki w celu zbadania interakcji białko-DNA. Metoda daje możliwość badania oddziaływań zachodzących w roztworze (unikając w ten sposób problemów związanych z bliskimi powierzchniami, jak w innych metodach jednocząsteczkowych), kontrolowania wydłużania DNA i śledzenia dynamiki oddziaływań w funkcji zarówno parametrów mechanicznych, jak i sekwencji DNA. Przedstawiono metody skutecznego pułapkowania optycznego i nanometrowej lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Przedstawiono warunki doświadczalne pozwalające na badanie oddziaływania represora laktozy (lacI), znakowanego Atto532, z cząsteczką DNA zawierającą specyficzne sekwencje docelowe (operatory) do wiązania LacI. Metoda pozwala na obserwację określonych oddziaływań u operatorów, a także jednowymiarową dyfuzję białka w trakcie procesu poszukiwania celu. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniu oddziaływań białko-DNA, ale także w silnikach molekularnych, w których pożądana jest kontrola napięcia przyłożonego do polimeru ścieżki partnerskiej (na przykład aktyny lub mikrotubul).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki pojedynczej cząsteczki (SM) znacznie się rozwinęły w ciągu ostatnich trzydziestu lat, aby odpowiedzieć na potrzebę przezwyciężenia niektórych ograniczeń tradycyjnych, masowych pomiarów roztworów 1-3. Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami biologicznymi stworzyła możliwość pomiaru właściwości mechanicznych biopolimerów4 oraz kontroli parametrów mechanicznych oddziaływań białko-białko5 i białko-DNA6,7. Z drugiej strony detekcja fluorescencji SM stanowi niezwykle wszechstronne narzędzie do badania aktywności białek in vitro i in vivo, co daje możliwość lokalizacji i śledzenia pojedynczych cząsteczek z nanometrową precyzją. Dzięki dopasowaniu funkcji rozproszenia punktowego do obrazu SM, można uzyskać lokalizację z precyzją zależną głównie od stosunku sygnału do szumu (SNR) i osiągając granicę około jednego nanometra8,9. Metodologie te znajdują potężne zastosowania w badaniach dynamiki białek motorycznych, a także procesów dyfuzji leżących u podstaw poszukiwania celu w białkach wiążących DNA. Zdolność do wyznaczania stałych dyfuzji w funkcji sekwencji DNA, czasu przebywania na celu i dokładnego pomiaru długości DNA badanej podczas jednowymiarowych zdarzeń dyfuzji stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki interakcji białko-DNA oraz do badania mechanizmów poszukiwania określonego celu.

Niedawno, połączenie tych dwóch technik stworzyło nową generację eksperymentalnychkonfiguracji 10-14, umożliwiających jednoczesną manipulację biologicznym substratem (na przykład filamentem aktynowym lub cząsteczką DNA) oraz wykrywanie/lokalizację oddziałującego enzymu partnerskiego (na przykład miozyny lub białka wiążącego DNA). Zalety tych technik polegają głównie na możliwości wywierania mechanicznej kontroli nad uwięzionym polimerem, umożliwiając w ten sposób badanie dynamiki oddziaływań w zależności od sił lub momentów obrotowych. Metodyka pozwala również na pomiar reakcji biochemicznych z dala od powierzchni, unikając jednego z głównych ograniczeń klasycznych metod SM, tj. konieczności unieruchomienia badanych cząsteczek na powierzchni (szkiełko lub mikrosfery).

Połączenie technik dwóch pojedynczych cząsteczek wymaga pokonania kilku trudności technicznych, głównie wynikających z wymagań stabilności mechanicznej i odpowiedniego SNR (zwłaszcza gdy wymagana jest lokalizacja z precyzją nm)15. Szczególnie w przypadku sprzężenia detekcji fluorescencji SM z pęsetą optyczną niezwykle ważna jest redukcja szumów i fotowybielania powodowanego przez pułapkujące lasery na podczerwień16 oraz kontrola biochemicznych do składania kompleksów biologicznych i wykonywanie pomiarów eksperymentalnych11. W tym miejscu opisujemy metody wykonywania udanych pomiarów w konfiguracji podwójnej lokalizacji pułapkowania/fluorescencji SM. Metodologia jest zilustrowana przykładem białka represorowego laktozy (LacI) znakowanego fluorescencyjnie (za pomocą Atto532) i wykrywanego podczas wiązania się z cząsteczką DNA (uwięzioną między dwiema pęsetami optycznymi) zawierającą określone sekwencje wiążące LacI (tj. operatory). Wykazano skuteczność metody w wykrywaniu wiązania LacI z DNA i dyfuzji wzdłuż jego konturu w procesie poszukiwania celu. Metodę stosuje się do dowolnej kombinacji sekwencji DNA i białka wiążącego DNA, a także do innych układów (mikrotubul lub filamentów aktynowych i oddziałujących z nimi białek motorycznych).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja pęsety optycznej ze stabilnością nanometrową

Konfiguracja eksperymentalna musi zapewniać dwie pęsety optyczne o stabilności celowania na poziomie nanometrów i fluktuacjach intensywności lasera pułapkującego poniżej 1%. Połączenie tych warunków zapewni nanometrową stabilność hantli przy typowym naprężeniu (1 pN - kilkadziesiąt pN), sztywność pułapki (0,1 pN/nm) oraz szerokość pasma pomiarowego (szybkość akwizycji obrazu 20 sek-1). Schemat konfiguracji eksperymentalnej przedstawiono na rysunku 1.

  1. Projektowanie i budowa pęset optycznych15,17:
    1. Zamontuj aparaturę doświadczalną na stole optycznym z aktywnymi izolatorami w celu zmniejszenia drgań mechanicznych. Zamontuj konstrukcję mikroskopu na izolatorach elastomerowych, aby pochłonąć szum akustyczny i rezonanse mechaniczne konstrukcji mikroskopu.
    2. Umieść izolator optyczny na drodze lasera pułapkowego, w pobliżu źródła lasera, aby zmniejszyć losowe wahania amplitudy spowodowane optycznym sprzężeniem zwrotnym.
    3. Zmniejsz długość ścieżki lasera pułapkującego tak bardzo, jak to możliwe i zamknij całą ścieżkę w szczelnym pudełku, aby zmniejszyć wahania celowania laserowego spowodowane prądami powietrza i turbulencjami.
    4. Utwórz podwójną pęsetę optyczną, dzieląc pojedyncze źródło lasera w bliskiej podczerwieni (laser Nd:YAG, długość fali 1,064 nm) na dwie wiązki o polaryzacji ortogonalnej. Nie używaj pułapek z podziałem czasu, ponieważ powodują one oscylacje hantli pod napięciem12.
    5. Używaj deflektorów akustyczno-optycznych (AD) napędzanych przez bezpośrednie syntezatory cyfrowe (DDS), aby umożliwić precyzyjne ruchy (co najmniej) jednej pułapki i precyzyjną regulację napięcia DNA. DDS zapewniają lepszą stabilność pułapki niż oscylatory sterowane napięciem (VCO).
    6. Włóż dwie fotodiody detektora kwadrantowego (QDP) w tylną płaszczyznę ogniskową kondensatora, aby wykryć położenie uwięzionych kulek z dokładnością poniżej nm.
  2. Sprawdź, czy fluktuacje intensywności lasera pułapkującego przy wejściu do mikroskopu są poniżej 1%, używając fotodiody o szerokości pasma większej niż szybkość akwizycji obrazu.
  3. Sprawdź stabilność celowania dwóch laserów pułapkujących:
    1. Przygotować kulki krzemionkowe w buforze fosforanowym: Rozcieńczyć 20 μl kulek krzemionkowych (1,54 μm, 10% ciał stałych) w 1 ml acetonu, poddać sonikacji przez 30 sekund, krótko wirować i odwirować przez 2 minuty przy 19 000 x g. Ponownie zawiesić w 1 ml acetonu i powtórzyć mycie. Zawiesić ponownie w 1 ml 50 mM buforu fosforanowego, przemyć 2 razy, a na koniec ponownie zawiesić w 100 μl 50 mM buforu fosforanowego.
    2. Kalibruj pęsetę optyczną za pomocą kulek krzemionkowych: przygotuj komórkę przepływową, przymocowując szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego za pomocą podwójnie klejącej taśmy klejącej (o grubości około 60 μm). Przepłynąć 1 mg/ml BSA i odczekać 3 min. Przepływać kulki krzemionkowe rozcieńczone w stosunku 1/1,000 w buforze fosforanowym i uszczelnić komorę przepływową smarem silikonowym. Uwięzić jeden koralik w każdej pułapce i skalibrować pułapki za pomocą metody widma mocy 18.
    3. Przygotuj kulki krzemionkowe w octanie pentylu i nitrocelulozie: Rozcieńczyć 20 μl kulek krzemionkowych (1,54 μm, 10% ciał stałych) w 1 ml acetonu, poddać sonizacji przez 30 sekund, krótko odwirować i odwirować 2 minuty przy 19 000 x g. Ponownie zawiesić w 1 ml acetonu i powtórzyć mycie. Zawiesić ponownie w 1 ml octanu pentylu i przemyć 2 razy. Na koniec zawiesić je ponownie w octanie pentylu z 0,1% nitrocelulozą rozpuszczoną w octanie pentylu.
    4. Rozprowadzić 2 μl kulek krzemionkowych o średnicy 1,54 μm rozpuszczonych w octanie pentylu + 0,1% nitrocelulozy na powierzchni szkiełka nakrywkowego (24 x 24 mm) za pomocą drugiego szkiełka nakrywkowego (24 x 60 mm). Przymocuj szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego za pomocą dwóch kawałków taśmy dwustronnej, aby utworzyć komórkę przepływową. Napełnij komorę przepływową buforem fosforanowym o pojemności 50 mM i uszczelnij ją smarem silikonowym.
    5. Wyobraź sobie jedną kulkę krzemionki w mikroskopii jasnego pola w powiększeniu 2,000x. Pole widzenia powinno wynosić 7 x 5 μm uzyskane przy pikselu 768 x 576, tak aby obraz koralika miał średnicę 190 pikseli. Kompensuj dryfty termiczne za pomocą oprogramowania do sprzężenia zwrotnego, które, podobnie jak w odnośniku 17, oblicza pozycję x-y na podstawie środka ciężkości obrazu i z na podstawie pierścieni dyfrakcyjnych oraz koryguje dryfty poruszające się po stoliku piezoelektrycznym z dokładnością nm lub lepszą.
    6. Nałóż na siebie środek lewej pułapki ze środkiem koralika (poziomy sygnału x-y z QDP muszą być takie same, jak zmierzone podczas kalibracji) i zmierz szum położenia oraz jego odchylenie standardowe od QDP. Powtórz pomiar dla prawej pułapki.

2. Lokalizacja pojedynczej cząsteczki z nanometrową dokładnością

  1. Projektowanie i budowa mikroskopii fluorescencyjnej15,19
    1. Użyj wysokiej wydajności kwantowej i zwielokrotnionej elektronami matrycy CCD, aby osiągnąć wysokie proporcje sygnału do szumu niezbędne do dokładności lokalizacji w nanometrach.
    2. Wybierz optykę, aby uzyskać rozmiar piksela obrazu ~80 nm (na przykład powiększenie obrazu ~200X przy rozmiarze piksela aparatu 16 μm). Jest to wystarczająco mało, aby zignorować błąd lokalizacji spowodowany pikselacją8, ale wystarczająco duży, aby zebrać znaczną liczbę fotonów na piksel.
    3. Jako źródło wzbudzenia użyj światła laserowego, które jest niespolaryzowane (przechodząc przez światłowód nieutrzymujący polaryzacji) lub spolaryzowane kołowo (przechodząc przez płytkę falową λ/4), aby zmaksymalizować wzbudzenie pojedynczych chromoforów, niezależnie od ich orientacji.
    4. Wybierz filtry pasmowoprzepustowe emisji, które skutecznie odcinają zarówno wzbudzenie, jak i zatrzymywanie światła laserowego. Uwaga: W naszych eksperymentach oznaczyliśmy nasze białko barwnikiem Atto532 i użyliśmy filtra emisyjnego pasmowoprzepustowego wyśrodkowanego na 600 nm z szerokością pasma 100 nm.

3. Mikrofluidyka

Aby osiągnąć precyzyjną kontrolę nad wymianą i montażem 'hantli', tj. zakotwiczeniem pojedynczej cząsteczki DNA pomiędzy dwoma optycznie uwięzionymi mikrosferami, musi zostać opracowany specjalnie zbudowany system wielokanałowego przepływu laminarnego. Składa się on z komory przepływowej, zbiornika ciśnieniowego i systemu kontroli ciśnienia (rysunek 2).

  1. Przygotowanie komory przepływowej
    UWAGA: Komora przepływowa używana do eksperymentów jednocząsteczkowych dotyczących interakcji białko-DNA ma korzystnie 4 wloty i 1 wylot, aby umożliwić do 4 równoległych przepływów buforowych, z których każdy zawiera jeden z różnych składników wymaganych w eksperymencie: kulki, DNA, białko znakowane fluorescencyjnie i bufor do obrazowania. Oddzielenie elementów w kanałach przepływowych pozwala na sprawny montaż hantli. Co więcej, kanał obrazowania jest przydatny do uniknięcia fluorescencji tła od dyfuzji białek i osiągnięcia wysokiego stosunku sygnału do szumu wymaganego do lokalizacji białka wiążącego DNA z dokładnością rzędu kilku nanometrów.
    1. Wywierć otwory o średnicy 1 mm w szkiełku mikroskopu (76 x 76 x 1 mm) za pomocą diamentowej końcówki, aby utworzyć 4 wloty i jeden wylot.
    2. Oczyść szkiełka mikroskopu etanolem i wyśrodkuj port z włożonym O-ringiem i pierścieniem samoprzylepnym w szkiełku otaczającym otwory dostępowe. Na tym etapie należy nosić rękawiczki, aby uniknąć odcisków palców, które mogłyby zakłócić proces klejenia.
    3. Clamp NanoPorts do szkiełka i umieść go w piekarniku nagrzanym do 180 °C na 1 godzinę, aby umożliwić pełne przymocowanie.
    4. Narysuj kontur komórki przepływowej na kartce papieru. Kanały powinny mieć szerokość ~3 mm i pasować do położenia otworów na szkiełku mikroskopu.
    5. Umieść rysunek na dwóch kawałkach Parafilmu i za pomocą skalpela wykonuj ostre i ciągłe nacięcia wzdłuż narysowanego konturu. Usuń wszelkie powstałe wypukłości. Wyrzuć dolną warstwę Parafilmu, która jest używana tylko w celu zagwarantowania czystego podparcia.
    6. Umieść szkiełko mikroskopu zawierające dołączone nanoporty do góry nogami w metalowym wsporniku.
    7. Ostrożnie wyrównaj obrys komory Parafilm z otworami, upewniając się, że parafilm nie zasłania wlotów i wylotów komory.
    8. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym z oczyszczonego mikroskopu (62 x 56 x 0,15 mm) i ostrożnie usuń nadmiar Parafilmu otaczającego komorę.
    9. Umieść dwa bloki grzewcze, uprzednio podgrzane w temperaturze 120 °C, na górze komory przepływowej, aby wywierać na nią stały nacisk. Pozwól Parafilmowi stopić się przez około 25 minut.
  2. Zbiornik ciśnieniowy i zbiorniki buforowe
    Zbiornik ciśnieniowy powinien być wykonany z pleksiglasu (lub podobnego) i umożliwiać umieszczenie sześciu zbiorników buforowych. Możliwość posiadania co najmniej dwóch dodatkowych pojemników buforowych poprawia elastyczność urządzenia. Należy pamiętać, że przezroczyste pojemniki i rurki znacznie pomagają w obsłudze systemu przepływu i rozwiązywaniu problemów z uwięzionymi pęcherzykami powietrza. Sterylne i jednorazowe strzykawki typu luer lock (2,5 ml), z których wcześniej usunięto tłoki, są dobrymi pojemnikami buforowymi i umożliwiają łatwe połączenie z rurką dopływową. Upewnij się, że całkowita objętość płynu jest mała w porównaniu z objętością powietrza w zbiorniku ciśnieniowym, co jest warunkiem niezbędnym do uzyskania płynnego i stabilnego przepływu.
    1. Podłączyć zawory odcinające na wyjściu z pojemników buforowych, aby włączyć lub wyłączyć przepływ bufora podczas eksperymentów.
    2. Zamontuj komorę przepływową na stoliku mikroskopu. Podłączyć zawory odcinające do wlotów komory przepływowej za pomocą rurki polieteroeteroketonowej (średnica wewnętrzna ~150 μm) i złączek bezkołnierzowych. Dodaj ~3 cm rurki z fluorowanego etylenu i propylenu (średnica wewnętrzna ~500 μm) jako połączenie między rurką a zespołami NanoPort komory przepływowej. Ten krok jest niezbędny do zmniejszenia przepływu bufora przy wejściu do studzienki, aby uniknąć pęknięcia komory przepływowej lub odłączenia NanoPort od szkła. Z drugiej strony, samo użycie rurek o dużej średnicy wewnętrznej wymagałoby ogromnych ilości próbek biologicznych.
    3. Podłącz wylot komory przepływowej do otwartej rurki Falcon pod ciśnieniem atmosferycznym. Rura ta służy jako utylizacja bufora wypływającego z komory przepływowej.
  3. System kontroli ciśnienia
    1. Zbuduj system kontroli ciśnienia zdolny do precyzyjnej regulacji ciśnienia powietrza wewnątrz zbiornika ciśnieniowego. Można to zrobić za pomocą dwóch sterowanych komputerowo zaworów elektromagnetycznych, jednego podłączonego do źródła ciśnienia +0,5 atm (sprężarki), a drugiego do ciśnienia atmosferycznego. Zawory elektromagnetyczne są wielokrotnie otwierane na około 7 ms w celu zwiększenia lub zmniejszenia ciśnienia w przewodzie, aż do osiągnięcia żądanej wartości. UWAGA: to podejście zostało zaadaptowane z Carlosa Bustamante20 i zapewnia płynniejszy przepływ niż przy użyciu pompy strzykawkowej z silnikiem krokowym21.
    2. Dodaj przetwornik ciśnienia sterowany przez specjalnie napisane oprogramowanie, aby monitorować efektywne ciśnienie wywierane na zbiornik ciśnienia. Typowe ciśnienia robocze wynoszą około 20 mBar do montażu hantli i 200 mBar do mycia elementów układu przepływowego.

4. Ogonowanie DNA za pomocą biotynylowanego trifosforanu deoksycytydyny (biotyna-dCTP)

Cząsteczka DNA powinna być dłuższa niż 1 μm, aby ułatwić jej rozciągnięcie pod przepływem i zakotwiczenie się w uwięzionych koralikach. Co więcej, długie DNA zapobiegnie oświetlaniu białka wiążącego DNA przez światło pułapkujące promieniowanie podczerwone. Ma to szczególne znaczenie, ponieważ absorpcja światła podczerwonego ze wzbudzonego chromoforu powoduje zwiększone fotowybielanie. UWAGA: W niniejszym badaniu cząsteczka DNA miała długość 3,7 μm. Cząsteczka zawierała trzy kopie pierwszorzędnego operatora O1 i po jednej kopii każdego z dwóch operatorów pomocniczych, O2 i O3. Sekwencje te zostały umieszczone w środku cząsteczki, w wyniku czego znajdują się w przybliżeniu w równej odległości od uwięzionych kulek i promieni laserowych IR.

  1. Zmieszać 1 pmol liniowych końców 3' DNA z 60 pmol biotyny-14-dCTP, 4 μl 5x końcowego buforu deoksynukleotydylotransferazy (TdT) (1 M kakodylan potasu, 125 mM Tris, 0,05% (v/v) Triton X-100, 5 mM CoCl2 (pH 7,2 w 25°C)) i 1,5 μl TdT i ddH2O do całkowitej objętości 20 μl. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 ° C przez 15 min. Spowoduje to dodanie do 60 nukleotydów na kończynę DNA. Należy zauważyć, że zwisy DNA 3' są ogoniaste z większą wydajnością niż zagłębione lub końce.
  2. Oczyść ogoniasty DNA za pomocą kolumn wirowych lub ekstrakcji fenolem/chloroformem, a następnie wytrącania etanolu w celu usunięcia CoCl2 z buforu reakcyjnego TdT.
  3. Po oczyszczeniu DNA można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas, ale należy unikać wielokrotnego rozmrażania i ponownego zamrażania.

5. Znakowanie grup tiolowych białek za pomocą ATTO532

Etykietowanie poprzez modyfikację reszt cysteiny nie może zmieniać aktywności białka. Aby przezwyciężyć ten problem, użyliśmy mutanta LacI, LacIQ231C, który zawiera tylko jedną cysteinę na monomer w pozycji 231. Mutant ten zachowuje te same cechy typu dzikiego i wykazano, że modyfikacje chemiczne w pozycji 231 nie zakłócają stabilności białka 22. UWAGA: Oznaczyliśmy białko ATTO532 maleimidem.

  1. Upewnij się, że białko jest rozpuszczone w buforze o pH w zakresie od 7,0 do 7,5 i stężeniu w zakresie od 2 do 10 mg/ml. UWAGA: w tych doświadczeniach LacI rozpuszczono w fosforanie potasu 0,3 M, 5% glukozy, pH 7,5 (bufor A).
  2. Rozpuścić chlorowodorek tris-(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) do końcowego stężenia 100 mg/ml wH2O. Roztwór TCEP musi być przygotowany świeży przed użyciem.
  3. Wymieszaj 100 μl białka z 3 μl TCEP i dokładnie odwiruj.
  4. Rozpuścić barwnik w N,N-dimetyloformamidzie (DMF) do końcowego stężenia 10 mg/ml pracując w warunkach słabego oświetlenia. Wirować aż do całkowitego rozpuszczenia.
  5. Mieszanina reakcyjna: Dodać 33 μl barwnika do białka + TCEP i ostrożnie odwirować. Szybkie wirowanie, aby zebrać jak najwięcej roztworu.
  6. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 2 godziny w wytrząsarce (8 000 obr./min) w temperaturze 20 °C (lub w temperaturze 4 °C O/N), chroniąc przed światłem.
  7. Rozpuść L-glutation zredukowany (GSH) do końcowego stężenia 100 mg/ml wH2O. Dodać 3 μl do mieszaniny reakcyjnej i inkubować na wytrząsarce z prędkością 8 000 obr./min przez 15 min. GSH zatrzyma reakcję poprzez zablokowanie reaktywności grup tiolowych.
  8. Oczyść znakowane białko za pomocą standardowych żelowych kolumn filtracyjnych, koncentratorów do dializy lub wirowania. UWAGA: W tych eksperymentach znakowany LacI został oczyszczony przy użyciu koncentratorów spinowych o odcięciu 10 kDa.
    1. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną do 12 ml buforu A, nanieść ją na urządzenie koncentratujące i odwirować w temperaturze 8 000 x g, 1 godz., 4 °C. Oznakowany LacI jest w ten sposób zagęszczany do końcowej objętości około 500 μl, a nadmiar barwnika przechodzi przez membranę w przepływie. Odrzucić przepływ i powtórzyć krok 5.8.1 co najmniej trzy razy.
  9. Podziel znakowane białko na małe porcje i przechowuj w temperaturze -80 °C. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

6. Połączone eksperymenty z pułapkowaniem optycznym i obrazowaniem fluorescencji pojedynczych cząsteczek

  1. Dodać 1 ml buforu A do pojemników buforowych i zastosować ciśnienie 200 mBar w celu umycia rurek łączących i komory przepływowej. Aby zmaksymalizować dyfuzję białka wiążącego na DNA, tutaj i w kolejnych krokach, bufor A można zastąpić buforem o niskiej sile jonowej. UWAGA: W tych eksperymentach użyliśmy TBE 0,5x.
  2. Sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócić płynność przepływu. Delikatne pociągnięcie rurki wylotowej pomoże usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki.
  3. Zmniejszyć ciśnienie do 20 mBar i sprawdzić, czy wszystkie kanały i rurki są wolne od pęcherzyków powietrza, a bufor przepływa z podobnymi prędkościami we wszystkich kanałach.
  4. Przygotować próbki do końcowej objętości 300 μl: kulki polistyrenowe pokryte streptawidyną 1,87 μm; 20 pM liniowego DNA, biotynylowane na obu końcach zgodnie z sekcją 4; 300 pM tetrameru LacI znakowanego ATTO532 zgodnie z sekcją 5.
  5. Dodać każdą próbkę do jednego z pojemników strzykawkowych w następującej kolejności: kulki w pierwszym kanale, DNA w drugim, trzecim kanale tylko z buforem do obrazowania (bufor A + system pochłaniacza tlenu) i znakowane białko w czwartym kanale.
  6. Włącz przepływ przy ciśnieniu 200 mBar na 3 minuty, aby próbki dotarły do kanału przepływowego. Następnie zmniejsz ciśnienie do 20 mBar.
  7. Podczas obrazowania pierwszego kanału w jasnym oświetleniu pola włącz dwie pęsety optyczne i złap polistyrenowy koralik w każdej pułapce.
  8. Przejdź szybko do drugiego kanału, aby uniknąć wpadnięcia innych koralików w pułapki. Zauważ, że przybycie do kanału DNA jest łatwo zauważalne pod koniec przepływu kulek.
  9. Używając jednego AOD, przesuwaj jedną pułapkę (koralik) do przodu iz powrotem w pobliżu drugiego koralika, aby umożliwić przyczepienie rozszerzonego przepływowo DNA między dwoma optycznie uwięzionymi koralikami. Kiedy powstaje hantle DNA, koralik statyczny zaczyna podążać za ruchem koralika, który jest aktywnie poruszany do przodu iz powrotem przez pułapkę.
  10. Przejdź szybko do kanału buforowego i wyłącz przepływ bufora. Przeprowadzić analizę krzywej siły i wydłużenia4,23-25 w celu sprawdzenia obecności pojedynczej cząsteczki DNA. Jeśli obecna jest więcej niż jedna cząsteczka (tj. entalpiczna, wznosząca się faza krzywej siła-wydłużenie występuje na długości krótszej niż długość konturu DNA), wyrzuć hantle i zacznij od kroku 6.7.
  11. Po uzyskaniu pojedynczego hantla DNA ponownie włącz przepływ i przenieś hantle do kanału białkowego. Przełącz się na mikroskopię fluorescencyjną o szerokim polu, aby monitorować interakcję znakowanego LacI z DNA. Wyłącz przepływ i rozpocznij pobieranie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W udanym eksperymencie, jedno (lub więcej) znakowane białka ulega wiązaniu/rozwiązywaniu i/lub jednowymiarowej dyfuzji wzdłuż cząsteczki DNA (Rysunek 3A). Lokalizacja białek wzdłuż cząsteczki DNA pozwala na ilościowe określenie parametrów kinetycznych w funkcji sekwencji DNA. Gdy zastosujesz warunki buforowe powodujące dyfuzję 1D, możliwe jest śledzenie trajektorii białek i wyznaczenie np. współczynnika dyfuzji D1D.

Dokładna pozycja pojedynczego punktu w każdej klat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady w technikach manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania nastąpił ogromny postęp pod względem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Połączenie technik manipulacji i obrazowania leży u podstaw potężnych instrumentów, które obecnie umożliwiają kontrolę warunków mechanicznych pojedynczego polimeru biologicznego, takiego jak DNA, RNA lub filamenty cytoszkieletu, oraz jednoczesną lokalizację pojedynczych białek oddziałujących z tym samym polimerem. Szczególnie interesujące jest kontrolowani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Gijsowi Wuite, Erwinowi J.G. Petermanowi i Peterowi Grossowi za pomoc w mikrofluidyce oraz Alessii Tempestini za pomoc w przygotowaniu próbki. Badania zostały sfinansowane ze środków Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 284464 oraz z włoskiego Ministerstwa Edukacji, Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, a także w ramach projektu flagowego NANOMAX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izolatory elastomeroweNewportNewdampWybierz odpowiedni elastomer Newdamp w zależności od wagi mikroskopu i częstotliwości rezonansowych
Izolator optycznyOptyka do badańIO-3-YAG-VHP
Laser Nd:YAG, długość fali 1,064 nmSpectra-PhysicsMillennia IR
Deflektory akustyczno-optyczne (AOD)A& A optoelektroniczneDTS-XY 250
Bezpośrednie syntezatory cyfroweUrządzenia
Detektor kwadrantowy fotodiodyOSI optoelektronikaSPOT-15-YAG
DIO i płyta FPGANational InstrumentsNI-PCI-7830R
Lampa halogenowaSchottKL 1500
OlympusU-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
ObiektywNikonCFI Plan Apochromat 60x 1.2NA zanurzenie
532 nm laserCoherentSapphire
CCD 200X i 2000XHamamatsu XC-ST70 CE
Przetwornik CCD zwielokrotniony elektronemHamamatsu C9100-13
Stolik piezoelektryczny z dokładnością nmPhysik InstrumenteP-527.2CL 
Filtr emisyjnyChroma Technologies600/100m
Koraliki krzemionkowe (1,54 mm)Bangs LaboratoriesSS04N/5303
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichB4287
Octan pentylu Sigma Aldrich46022Łatwopalna ciecz i para (Nr 1272/2008)
NitrocelulozaSigma AldrichN8267-5EAŁatwopalna substancja stała  (nr 1272/2008)
Blok grzewczyMPM Instruments SrlM502-HBDz 2 wyjmowanymi blokami; wstępnie podgrzany do 120 &; C
NanoPort montujeUpchurch Scientific Inc.N-333
Rurki z polieteroeteroketonu Upchurch Scientific Inc.1535
Domowy metalowy uchwyt do montażu zbiornika ciśnieniowego komory przepływowej wykonany z plexi
Strzykawki Luer lock-tip 2,5 mlTerumoSS 02LZ1
Zawory odcinające Upchurch Naukowy, Inc.P-732
Złączki bezkołnierzowe Upchurch Naukowy, Inc.LT-111
Rurki fluorowane etylenowo-propylenowe Upchurch Naukowy, Inc.1549
Dwa sterowane komputerowo zawory elektromagnetyczneClippard, Cincinnati, USAET-2-H-M5
Przetwornik ciśnieniaDruck LTDPTX 1400
biotyna-14-dCTP Life Technologies19518-018
Końcowa deoksynukleotydylotransferaza (TdT)ThermoscientificEP0161
ATTO532 maleimidSigma Aldrich68499
N,N-dimetyloformamid (DMF) Sigma Aldrich227056Ciecz palna, szkodliwa przez wchłanianie przez skórę. Działa drażniąco, teratogenowo. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280; P305; P351; P338; P311
Chlorowodorek tris-(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) Sigma AldrichC4706
Redukcja L-glutationu (GSH)Sigma AldrichG4251Ostra toksyczność, Doustnie (kategoria 5), H303
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrana, 10  Koncentratory spinowe odcinające kDa MerckMilliporeUFC901024
Koraliki polistyrenowe powlekane streptawidyną 1,87 i mikro; mSpherotech, Inc.Zobacz materiał SVP-15-5
analogowe Kondensator LCD w wodzie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
  2. Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
  3. Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
  4. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  5. Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
  6. Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
  7. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
  8. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
  9. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
  10. Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
  11. Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
  13. Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
  14. van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
  15. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).
  16. Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
  17. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
  18. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
  19. Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
  20. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
  21. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
  22. Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
  23. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
  24. van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
  25. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
  26. Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
  27. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protein DNA InteractionsOptical TweezersSingle Molecule FluorescenceDNA Force ExtensionLactose RepressorFlow Cell AssemblyNanometer LocalizationTarget Search DynamicsMechanical ControlFluorescence Microscopy

Powiązane artykuły