Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster

Muszki owocowe, Drosophila melanogaster, były używane jako cenny organizm modelowy do badania mechanizmów leżących u podstaw złożonych zachowań, takich jak uczenie się i pamięć, interakcje społeczne, agresja, nadużywanie narkotyków, sen, funkcje sensoryczne, zaloty i kojarzenie^{się 1,2}. Jednym z zachowań, które zostało zbadane za pomocą wielu protokołów, jest spontaniczna aktywność lokomotoryczna. Geotaksja ujemna była jedną z pierwszych metod opracowanych do pomiaru aktywności Drosophila, a protokół ten polega na pomiarze odsetka much, które osiągają określoną wysokość fiolki po tym, jak muchy zostały wstrząśnięte na dno pojemnika^1,3. Ta metoda ma tę zaletę, że jest prosta, niedroga, a ponieważ nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu, można ją wykonać w dowolnym laboratorium. Został on wykorzystany jako cenne narzędzie przesiewowe do badania wpływu różnych manipulacji genetycznych na mobilność much³. Jest to jednak czasochłonne i pracochłonne oraz może być stronnicze ze względu na zmienne potrząsanie fiolkami i nagrania z udziałem ludzi.

Metoda negatywnej geotaksji została ulepszona przez rozwój metody Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING)^4,5, która wykonuje zdjęcia fiolek z muchami po potrząśnięciu muchami na dnie. Zaletą tego protokołu jest jego czułość i możliwość testowania dużej liczby fiolek muchowych w tym samym czasie. Jednak protokół ten nadal ma potencjał błędu ludzkiego i mierzy tylko ujemne geotaksje. Inne laboratoria wykorzystały prostą obserwację w fiolkach hodowlanych w celu określenia aktywności lokomotorycznej⁶.

Ostatnio opracowano kilka systemów rejestracji wideo do pomiaru aktywności lokomotorycznej much. Jeden protokół monitoringu wideo zapewnia czas na dostosowanie przed nagraniem⁷. Metoda opisana przez Slawsona i in. również wykorzystuje impuls powietrza do zatrzymania ruchu do rozpoczęcia nagrywania, co potencjalnie może być stresorem dla zwierząt⁷. Metoda ta dostarcza informacji o średniej prędkości, prędkości maksymalnej, czasie spędzonym w ruchu itp. Inny trójwymiarowy system śledzenia mierzy maksymalną prędkość poszczególnych much podczas ~0,2 sekundy swobodnego startu^{z lotu 8}. Trójwymiarowy protokół monitoringu wizyjnego wykorzystuje muchy wykazujące GFP i wiele kamer wyposażonych w filtry pozwalające na detekcję fluorescencji w celu określenia ruchliwości much⁹. Muchy w tym protokole mają tendencję do wykazywania cylindrycznych wzorców lotu, co jest potencjalnie spowodowane kształtem fiolek z kulturą Drosophila ¹⁰. Metoda ta została ulepszona poprzez zastosowanie kopuły, która pozwala na pomiar spontanicznego ruchu dwóch much¹¹. Opisano również metodę o wysokiej przepustowości, która wykorzystuje kamerę do automatycznego monitorowania i ilościowego określania indywidualnych i społecznych zachowań Drosophila ¹². Zou i in. opracowali system monitorowania behawioralnego (BMS), który wykorzystuje dwie wspomagane komputerowo kamery do rejestrowania zachowań i ruchów w ciągu całego życia, takich jak odpoczynek, poruszanie się, latanie, jedzenie, picie lub śmierć poszczególnych^muszek owocowych z rodziny tephritidae.. Opracowano kilka innych systemów wideo do monitorowania aktywności behawioralnej much^14,15.  

Tutaj opisujemy metodę ilościowego określania aktywności Drosophila, która wykorzystuje monitory populacji. Monitory te są umieszczone w inkubatorach o kontrolowanej temperaturze i wilgotności w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światła dzień-noc. Każdy monitor populacji ma wiązki podczerwieni umieszczone w pierścieniach umieszczonych na trzech różnych wysokościach. Za każdym razem, gdy mucha porusza się po pierścieniach, przerywa wiązkę podczerwieni, która jest rejestrowana przez mikroprocesor, który niezależnie rejestruje i zlicza aktywność much w fiolce. Mikroprocesor przesyła do komputera całkowitą aktywność w fiolce w zdefiniowanych przez użytkownika odstępach czasu, które mogą wynosić od 1 sekundy do 60 minut. Opisana tu metoda daje muszkom wystarczająco dużo czasu na przystosowanie się do nowego środowiska i pozwala na jednoczesny pomiar spontanicznej aktywności lokomotorycznej aż 120 populacji muszek. Ponadto opisujemy przygotowanie pokarmu, utrzymanie much, ustawienie monitorów populacji mobilności w inkubatorach o kontrolowanej temperaturze oraz potencjalne czynniki, które mogą mieć wpływ na wyniki. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób różne modyfikacje środowiskowe lub genetyczne wpływają na spontaniczną aktywność lokomotoryczną muszek.

Uwaga: Szczep Canton-S to standardowa linia tła typu dzikiego uzyskana z Bloomington Stock Center.

1. Przygotowanie potrawy i przepis na 1 000 ml jedzenia

Uwaga: Ta sekcja opisuje protokół przygotowywania posiłków. Duże metalowe garnki służą do przygotowania jednorazowo około 18 litrów jedzenia. Opisany tutaj protokół jest zmniejszony i wykorzystuje 1,000 ml_H2O. Żywność jest dwukrotnie sterylizowana w autoklawie.

1. Wymieszaj 113 g sacharozy i 28 g drożdży piwnych w 643 ml wody. Pozostaw składniki na gorącym talerzu ustawionym na 25 °C z mieszadłem i mieszaj przez 15 minut.
2. Autoklaw roztworu spożywczego przez 20 minut.
3. Wymieszaj 49 g mąki kukurydzianej i 8,1 g agaru w 268 ml wody i dodaj do autoklawowanej mieszanki spożywczej opisanej w kroku 1.2. Dobrze wymieszaj dużą łyżką lub trzepaczką.
4. Autoklaw mieszanki spożywczej przez kolejne 20 minut.
5. Ułóż jedzenie na talerzu i pozostaw do ostygnięcia, ciągle mieszając z mieszadłem. Jeśli do żywności należy dodać dodatkowe roztwory, takie jak mifepriston (RU486), przechowuj żywność na gorącej płycie ustawionej na 60 °C i dodaj roztwór, gdy żywność osiągnie wymaganą temperaturę.
6. Rozpuścić 2,4 g tegoseptu w 10,7 ml 100% EtOH i trzymać na zimnej płytce z mieszadłem do całkowitego rozpuszczenia i mieszać przez około 15 minut.
7. Dodać roztwór tegoseptu do żywności, gdy temperatura żywności wynosi 60 °C i dobrze wymieszać.
8. Za pomocą pompki lub dozownika żywności wlej około 10 ml jedzenia do szerokiej fiolki. Za pomocą dozownika do żywności można jednocześnie nalewać żywność do 100 szerokich, plastikowych fiolek (1 taca) na raz.
9. Przykryj fiolki chusteczkami Kimwipes i gazą serową i pozostaw żywność w temperaturze pokojowej na 12-24 godziny do ostygnięcia. Przechowywać żywność w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3-4 tygodni. Podgrzej żywność do temperatury pokojowej przed użyciem do pracy w locie.

2. Przygotowanie szklanych fiolek

1. Przygotuj jedzenie zgodnie z protokołem wymienionym w kroku 1.
2. Do każdej wąskiej, szklanej fiolki należy podać 5 ml pokarmu, co odpowiada odpowiedniej wielkości dla monitorów populacji. Ta ilość pokarmu powinna być na tyle niska, aby znajdowała się poniżej najniższego pierścienia monitora populacji.
3. Po ostygnięciu żywności do temperatury pokojowej przykryj fiolki zatyczkami z gąbki i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Ponieważ ilość pokarmu w fiolce jest raczej niska, najlepiej zużyć pokarm w ciągu tygodnia lub dwóch, aby zapobiec wysuszeniu.
4. Przed użyciem rozgrzać fiolki do temperatury pokojowej.

3. Utrzymanie rodzicielskich much

1. Hoduj muchy w szerokich plastikowych fiolkach ze standardowym pokarmem laboratoryjnym i przechowuj fiolki w wilgotnej komorze środowiskowej o kontrolowanej temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Okres światła dziennego zaczyna się o 6:00 rano w tym laboratorium.
2. Rano usuń dorosłe muchy z fiolek, z których zostaną zebrane muchy rodzicielskie.
3. Zbierz nowo zamknięte muchy i oddziel je według płci na podkładce CO₂ w ciągu 8 godzin po eklozji, aby upewnić się, że samice much są dziewicami. Muchy zaczynają kojarzyć się 8 godzin po zamknięciu.
4. Gdy dziewicze samce i samice much osiągną wiek od 5 do 10 dni, umieść 10 samców i 10 samic much w fiolce ze standardowym pokarmem i kilkoma ziarnami aktywnych drożdży na wierzchu.
   Uwaga: Kontroluj gęstość larw, używając tej samej liczby much i trzymając je w fiolce przez dwa dni. Dodatek aktywnych drożdży wspomaga produkcję jaj.
5. Trzymaj muchy do łączenia się w pary i składaj jaja w komorze środowiskowej o kontrolowanej temperaturze 25 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności przez 2 dni. Ustaw 5-10 fiolek much rodzicielskich.
6. Muchy należy przenosić do nowej plastikowej fiolki co drugi dzień i przechowywać fiolki z jajami w inkubatorze w temperaturze 25 °C.

4. Kolekcja eksperymentalnych much

1. Po 9 dniach muchy zaczną zamykać się z fiolek, w których muchy rodzicielskie złożyły jaja (opisane w kroku 3.6.). Usunąć i wyrzucić muchy, które zamknęły się w ciągu pierwszego dnia, a następnie umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze. Większość much zamkniętych w pierwszym dniu to samice. Bardziej zsynchronizowana populacja much zamknie się w dniu 2.
2. W ciągu 24 godzin umieść nowo zamknięte muchy na podkładkach CO₂ i zbierz 25 samców i 25 samic much w fiolkach za pomocą pędzla lub metalowej łyżki. Trzymaj muchy na podkładkach CO₂ przez krótki okres czasu, aby zminimalizować wszelkie skutki CO₂ . Zapisać dzień zaniku na fiolce. Zebrać co najmniej 5 fiolek z kontrpróbami dla grup doświadczalnych i kontrolnych.
3. Przechowywać fiolki w komorach środowiskowych o kontrolowanej temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
4. Muchy należy przenosić do nowej plastikowej fiolki co drugi dzień za pomocą lejka.
5. Starzej muchy, aż osiągniesz pożądany wiek do eksperymentowania.

5. Konfiguracja monitorów mobilności

1. Monitory populacji należy umieścić w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze.
2. Podłącz każdy monitor za pomocą 4-żyłowego telefonicznego do modułu interfejsu zasilacza (PSIU) za pomocą 5-drożnych rozdzielaczy (wieloliniowych), które mogą podłączyć do 5 pojedynczych monitorów do jednego otworu w zasilaczu. Zobacz rysunki 1A i 2B.
3. Podłącz zasilacz PSIU do gniazdka sieciowego (100-240 V). Podłącz złącze wyjściowe zasilacza do jednego z 2 pasujących gniazd PSIU. Sąsiednie zielone światło świeci na zielono po prawidłowym podłączeniu.
4. Podłącz zasilacz PSIU do sprzętu uniwersalnej magistrali szeregowej (USB). Podłącz USB między sprzętem USB a komputerem Macintosh lub komputerem z systemem Windows w celu nagrywania danych. Najlepiej byłoby mieć komputer przeznaczony tylko do zbierania danych, ponieważ zbieranie trwa kilka dni.
5. Pobierz oprogramowanie USB (PSIUdrivers.zip). Oprogramowanie sterownika USB jest używane przez interfejs zasilacza i należy je pobrać tylko raz. Syntetyzuje on łącze danych między programem komputerowym a monitorami PSIU/aktywności. W przypadku komputerów PC należy użyć portu COM, a w przypadku komputerów Macintosh należy użyć prostego portu szeregowego.
6. Pobierz program komputerowy dla komputerów Macintosh OSX (Intel) lub dla komputerów PC z systemem Windows (XP/Vista/7), postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta Uwagi 308.pdf.
7. Uruchom program komputerowy i skonfiguruj program, klikając Preferencje, Światła lub Monitory. Program będzie działał, dopóki użytkownik nie wybierze opcji "zakończ", aby zatrzymać program. Jeśli program komputerowy lub komputer zostanie wyłączony, monitory będą nadal zliczać przerwy w wiązce, ale zliczenia nie będą rejestrowane, dopóki program nie zostanie ponownie uruchomiony. W takim przypadku pierwszy odczyt będzie zawierał wszystkie zliczenia od ostatniego wysłania danych do komputera przez PSIU.
8. Wybierz kartę Preferencje i wybierz port szeregowy, PSIU dla komputerów Macintosh i COM dla komputerów PC.
9. Wybierz interwał odczytu, który mieści się w zakresie sekund, minut lub godziny.
10. Wybierz monitory: Każdy monitor ma swój unikalny numer, który jest nadawany przez producenta. Wybierz zakres monitorów, który odpowiada numerom nadanym monitorom przez producenta.
11. Pole Światła: Upewnij się, że wszystkie monitory są prawidłowo podłączone, co jest oznaczone zielonym światłem obok numeru monitora w oprogramowaniu. Czerwone światło oznacza, że połączenie zostało utracone, a skrzynka wskazuje, że system jest wyłączony lub nieprawidłowo skonfigurowany.

6. Przygotowanie eksperymentu

1. Wyjąć szklane fiolki zawierające żywność z temperatury 4 °C i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej.
2. Oddziel samce i samice much w tym samym wieku na podkładce CO₂. W przypadku badań nad starzeniem się możliwe jest rozpoczęcie badań nad mobilnością już w 3 dniu życia.
3. Umieścić 10 samców lub 10 samic much w każdej szklanej fiolce zawierającej pokarm. Należy użyć co najmniej trzech fiolek dla każdej linii doświadczalnej i kontrolnej much i dla każdej płci.
4. Trzymaj fiolki na boku, dopóki muchy nie zregenerują się z CO₂ , aby upewnić się, że muchy nie utkną w jedzeniu. Oddziel muchy około godziny 8:00 i pozostaw je na około 2 godziny w temperaturze pokojowej, aby odzyskały CO₂ .
5. Umieścić fiolki w monitorach populacji umieszczonych w inkubatorach.
6. Odrzuć dane zebrane w ciągu pierwszych 24 godzin po umieszczeniu muszek w inkubatorze, aby umożliwić im dostosowanie się do nowego środowiska.
7. Muchy należy przekazać po 3 lub 4 dniach do nowych fiolek, aby uniknąć wysuszenia pokarmu. Jeśli muchy są podatne na śmierć lub są w wieku 40 dni lub starsze, przekaż muchy po 2 dniach i wykorzystaj dane zebrane dla 2 dnia. Należy również użyć więcej niż trzech fiolek na grupę, aby zapewnić odpowiednie kontrpróby. Dane z fiolek z martwymi muchami powinny być ignorowane i nie uwzględniane w analizie.

7. Uruchamianie monitorów aktywności i obliczanie całkowitej spontanicznej aktywności

1. Wybierz preferencje - interwał zbierania danych.
   Uwaga: Program komputerowy umożliwia zbieranie danych w odstępach od 1 sekundy do 60 minut. Stwierdzono, że okresy 10- i 30-minutowe dostarczają odpowiednich informacji na temat mobilności bez przytłaczającej liczby punktów czasowych. W wybranym przedziale czasu program wyśle do komputera aktualną łączną liczbę dla każdego monitora i rozpocznie liczenie od zera. Program komputerowy przechowuje dane w nowym folderze utworzonym przez komputerowy system danych. Dane zgromadzone w każdym monitorze są przechowywane oddzielnie, a dla każdej fiolki tworzone są indywidualne dokumenty tekstowe. Dane są zbierane w sposób ciągły tak długo, jak długo działa program.
2. Na koniec eksperymentu zeskanuj dane za pomocą programu FileScan110X dla komputerów Macintosh OSX (Intel) lub SystemMB108 dla komputerów PC z systemem Windows (XP/Vista/7).
   Uwaga: Program Scan eliminuje zduplikowane odczyty i upewnia się, że nagrania są kompletne.
3. Zapisz dane zebrane w określonym czasie i okresie dni. Wybierz nazwę eksperymentu i skopiuj pliki z folderu danych komputera do analizy.
   Uwaga: W tej chwili interwały aktywności można zmieniać i konwertować na inne. Oryginalne dane pozostaną przechowywane w folderze danych komputera i będzie można je odzyskać, o ile nie zostaną usunięte.

8. Analiza danych

1. Skopiuj dane zebrane w plikach tekstowych do kolumn arkuszy kalkulacyjnych Excel w celu analizy danych. Dane zbierane przez to oprogramowanie znajdują się w kolumnach, które zawierają liczby reprezentujące całkowitą aktywność na jednym monitorze w wybranym przez badacza okresie czasu.
   Uwaga: Dane zebrane dla każdego monitora znajdują się w osobnych plikach tekstowych. Na każdy monitor przypadają 32 kolumny. Pierwsze sześć kolumn jest pustych i zawiera tylko 0; Kolejne trzy zawierają dane zebrane w dolnym pierścieniu, w środku i w górnym pierścieniu. Pozostałe kanały można usunąć, ponieważ nie zawierają one żadnych danych. Każdy pierścień generuje pojedynczą wartość na czas. Zobacz zrzut ekranu nieprzetworzonych danych na rysunku 2.
2. Oblicz całkowitą aktywność w żądanym okresie czasu dla każdego monitora, która reprezentuje sumę aktywności zebranej na trzech różnych wysokościach wiązek podczerwieni.
   Uwaga: Okres ten może wynosić od kilku godzin, 24 godzin lub kilku dni.
3. Określ średnią aktywność lokomotoryczną i odchylenie standardowe między 3 monitorami, które reprezentują 3 kontrpróby biologiczne.
   Uwaga: Dane mogą być analizowane pod kątem istotności statystycznej za pomocą wielu testów. Dwustronny test t-Studentsa, jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA) i test post-hoc HSD Tukeya mogą być wykorzystane do określenia wpływu kilku manipulacji środowiskowych lub genetycznych na 24 godziny spontanicznej aktywności lokomotorycznej¹⁶. Istnieje wiele innych programów, które mogą być używane i zostały wcześniej opublikowane¹⁷.

Spontaniczna aktywność lokomotoryczna u Drosophila zależy od płci muchy (Rysunek 3A), zawartości kalorii w pożywieniu (Rysunek 3B) i cyklu światło/ciemność. Po wyłączeniu światła aktywność much drastycznie spada. Rycina 3A ilustruje 24-godzinne zapisy aktywności lokomotorycznej samców i samic much. Gwiazdka na osi x oznacza czas, w którym światło zostało wyłączone i przejście do cyklu ciemności. Rycina 3B ilustruje odchylenie standardowe między średnią spontaniczną aktywnością lokomotoryczną zebraną w trzech monitorach populacji dla samców much w wieku 3 dni po spożyciu pokarmu kukurydzianego. Dane zebrane dla spontanicznej aktywności fizycznej w ciągu 24 godzin mogą być również wyrażone jako całkowita aktywność na muchę w okresie 24 godzin, Rysunek 3C.

Rysunek 1: Zestaw monitora populacji do monitorowania spontanicznej aktywności lokomotorycznej much. A) Kilka monitorów populacji jest podłączonych 4-żyłowym telefonicznym do 5-drożnych rozgałęźników i umieszczonych w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze. B) Większe powiększenie dwóch monitorów populacji, które pokazują rozmieszczenie fiolek w monitorach populacji i trzech pierścieniach z wiązkami podczerwieni umieszczonymi na trzech różnych wysokościach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Rysunek 2: Zrzut ekranu przedstawiający nieprzetworzone dane wygenerowane przez oprogramowanie przedstawiające datę, godzinę i dane zebrane w pierścieniach 1, 2 i 3. R oznacza pierścień. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rycina 3: A) Średnia spontaniczna aktywność lokomotoryczna samców (czarnych) i samic (magenta) much w ciągu 24 godzin na standardowej diecie laboratoryjnej. Dane są zbierane w 10-minutowych pojemnikach i reprezentują średnią aktywność na muchę obliczoną jako średnia aktywność między trzema fiolkami, z których każda zawiera 10 much. B) Średnia spontaniczna aktywność lokomotoryczna samców much w ciągu 24 godzin na standardowej diecie laboratoryjnej. Dane są zbierane w 10-minutowych pojemnikach i reprezentują średnią aktywność na muchę obliczoną jako średnia aktywność między trzema fiolkami. Odchylenia standardowe są zaznaczone na zielono. C) Całkowita aktywność 20-dniowych samców much na niskokalorycznym (0,5X) (zielonym) i wysokokalorycznym (1,5X) (brązowym) pokarmie przez 24 godziny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Nie mamy nic do ujawnienia.