Artykuł metodologiczny

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

DOI:

10.3791/51454

⸱

3 czerwca 2014

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Interdisciplinary NanoPhysics, Department of Physics, University of Ottawa, 2University of Ottawa Heart Institue, University of Ottawa, 3Libin Cardiovascular Institute of Alberta, University of Calgary, 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia, które pozwalają na zastosowanie sił mechanicznych do komórek i tkanek lub które mogą określić ilościowo właściwości mechaniczne tkanek biologicznych, znacznie przyczyniły się do zrozumienia podstaw mechanobiologii. Techniki te były szeroko stosowane w celu pokazania, w jaki sposób na początek i postęp różnych chorób duży wpływ mają sygnały mechaniczne. W artykule przedstawiono wielofunkcyjną platformę do rozciągania dwuosiowego (BAXS), która może mechanicznie stymulować pojedyncze komórki lub określać ilościowo sztywność mechaniczną tkanek. Platforma BAXS składa się z czterech silników z cewkami drgającymi, które mogą być sterowane niezależnie. Pojedyncze komórki mogą być hodowane na elastycznym podłożu, które można przymocować do silników, co pozwala na wystawienie komórek na złożone, dynamiczne i przestrzennie zmieniające się pola odkształceń. I odwrotnie, włączając ogniwo obciążnikowe siłowe, można również określić ilościowo właściwości mechaniczne tkanek pierwotnych, gdy są one narażone na cykle deformacji. W obu przypadkach należy zaprojektować odpowiedni zestaw zacisków i zamontować je na silnikach platformy BAXS, aby mocno utrzymać elastyczne podłoże lub tkankę będącą przedmiotem zainteresowania. Platforma BAXS może być zamontowana na mikroskopie odwróconym w celu jednoczesnego obrazowania w świetle przechodzącym i/lub fluorescencji w celu zbadania odpowiedzi strukturalnej lub biochemicznej próbki podczas eksperymentów rozciągania. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe informacje eksperymentalne dotyczące projektowania i wykorzystania platformy BAXS oraz przedstawia wyniki badań nad pojedynczymi komórkami i całymi tkankami. Platforma BAXS została wykorzystana do pomiaru deformacji jąder w pojedynczych komórkach mioblastów myszy w odpowiedzi na odkształcenie substratu oraz do pomiaru sztywności izolowanych aort myszy. Platforma BAXS to wszechstronne narzędzie, które można łączyć z różnymi mikroskopiami optycznymi w celu uzyskania nowatorskich informacji mechanobiologicznych na poziomie subkomórkowym, komórkowym i całych tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko mechaniczne odgrywa ważną rolę w wielu funkcjach komórek, takich jak proliferacja, migracja i różnicowanie, które mają ogromny wpływ na rozwój i homeostazę tkanek, a także na choroby1-6. Na przestrzeni lat wykorzystano wiele narzędzi eksperymentalnych do mechanicznej stymulacji komórek lub tkanek oraz pomiaru właściwości mechanicznych tkanek biologicznych w celu poszerzenia naszej wiedzy na temat podstawowej mechanobiologii oraz zbadania wystąpienia i postępu chorób6-17. Często jednak trzeba polegać na kilku różnych urządzeniach eksperymentalnych, aby osiągnąć cele konkretnego badania. W artykule przedstawiono pojedynczą, wielofunkcyjną platformę do rozciągania dwuosiowego (BAXS), która pozwala na badania badające rolę, jaką właściwości mechaniczne i siły mechaniczne odgrywają w biologii w skali długości subkomórkowej i całej tkanki. Platforma BAXS nie tylko pozwala na ilościowe określenie właściwości mechanicznych izolowanych tkanek, ale także ułatwia zastosowanie prostych, złożonych i dynamicznych pól odkształceń do żywych komórek w celu zrozumienia ich reakcji na rozciąganie zachodzące in vivo. Platforma BAXS utrzymuje również zdolność do wykonywania mikroskopii żywych komórek podczas testów mechanicznych i zaburzeń na komórkach i tkankach.

Platforma BAXS to specjalnie skonstruowane urządzenie, które może być używane do badania wpływu deformacji podłoża na poziomie komórkowym i przeprowadzania prób rozciągania na tkankach biologicznych (Rysunek 1A). Aluminiowa grzałka została wyprodukowana tak, aby pomieścić standardową 10-centymetrową szalkę Petriego i utrzymywać wszelkie roztwory fizjologiczne w temperaturze 37 °C za pomocą regulatora temperatury i grzałek kaptonowych (rysunek 1B). Ta platforma BAXS może być zintegrowana z mikroskopem kontrastowym i/lub fluorescencyjnym z odwróconą fazą i umożliwia jednoczesne obrazowanie (ryc. 1C). Krótko mówiąc, platforma BAXS składa się z czterech liniowych silników cewkowych, których ruchome części są zamontowane na miniaturowych prowadnicach kulkowych o ruchu liniowym zorientowanych wzdłuż dwóch prostopadłych osi (ilustracja 1D). Do każdego z czterech silników zamontowany jest liniowy stopień pozycjonujący, aby umożliwić pionowy ruch systemu mocowania, który będzie używany (ilustracja 1E). Położenie każdego silnika jest monitorowane przez enkoder optyczny o rozdzielczości 500 nm (ilustracja 1F). Wszystkie cztery silniki są niezależnie sterowane za pomocą sterownika ruchu wykorzystującego sprzężenie zwrotne enkodera optycznego do wykonywania poleceń ruchu (ilustracja 1G). Interfejs LabVIEW zapewnia pełną kontrolę nad wielkością przemieszczenia, prędkością i przyspieszeniem każdego silnika w celu generowania w pełni konfigurowalnych, statycznych i dynamicznych deformacji komórek lub próbek tkanek.

Technika używana do wywoływania deformacji w komórkach jest po prostu poprzez umożliwienie komórkom mocnego przylegania do elastycznego i przezroczystego podłoża, a następnie rozciąganie tego podłoża za pomocą czterech silników platformy BAXS. Platforma BAXS umożliwia montaż dowolnego, specjalnie zaprojektowanego zestawu zacisków do mocowania podłoża na silnikach cewek drgających. W tym celu zaprojektowaliśmy zestaw zacisków, do których można przymocować elastyczne i przezroczyste podłoże, wykonane z polidimetylosiloksanu (PDMS) (rys. 2A-C i rys. 3). Ponieważ zaciski będą narażone na działanie roztworów fizjologicznych, wszystkie części zostały obrobione ze stali nierdzewnej, aby umożliwić sterylizację. Zaciski te zostały starannie zaprojektowane, aby zbliżyć podłoże jak najbardziej do obiektywu mikroskopu, aby poprawić jakość obrazu przy jednoczesnym zminimalizowaniu naprężeń na podłożu podczas rozciągania (ryc. 2D).

Ta sama platforma BAXS może być również używana do ilościowego określania sztywności małych próbek tkanek, używając odpowiedniego zestawu zacisków z dostosowanymi podporami dla próbek tkanek i ogniwa obciążnikowego do monitorowania sił. Można zastosować kilka podejść do zamontowania tkanki do silników platformy BAXS; w tym przypadku szpilki do miężania owadów ze stali nierdzewnej mogą zaczepić się o otwór tkanek naczyniowych w celu przeprowadzenia prób rozciągania (rysunki 4A-B). Alternatywnie, w przypadku grubych tkanek bez naturalnego otworu, krawędzie tkanek mogą być utrzymywane w odpowiedniej pozycji za pomocą zacisków przymocowanych do silników cewki drgającej lub przyklejone do małych szkiełek szklanych za pomocą kleju biologicznego i przymocowane do silników za pomocą zacisków. Do przeprowadzenia prób rozciągania wymagane jest miniaturowe ogniwo obciążnikowe, które można łatwo zintegrować z silnikami platformy BAXS i wykorzystać do pomiaru siły działającej na tkankę podczas cyklu rozciągania (rysunek 4C). Ponieważ platforma BAXS składa się z czterech silników, wprowadzenie drugiego ogniwa obciążnikowego pozwala na przeprowadzenie próby rozciągania w dwóch ortogonalnych kierunkach. Ta zdolność pozwala na ilościowe określenie sztywności mechanicznej pojedynczej tkanki wzdłuż dwóch prostopadłych kierunków podczas tego samego eksperymentu.

Ważne, we wszystkich konfiguracjach, komórki lub próbki tkanek będące przedmiotem zainteresowania są zawsze przechowywane w łaźni o kontrolowanej temperaturze, która jest dostępna dla użytkownika. Zdolność ta pozwala na wprowadzenie środków farmakologicznych podczas rozciągania próbki w celu zbadania czasowej reakcji próbki. Dodatkowo, ponieważ oś optyczna mikroskopu odwróconego pozostaje niezakłócona, wszystkie formy mikroskopii są nadal dostępne dla użytkownika. Wreszcie, ponieważ wszystkie cztery silniki platformy BAXS są niezależne, możliwe jest zastosowanie wysoce konfigurowalnych pól odkształceń do badanej próbki. Komórki i tkanki in vivo są narażone na złożone i anizotropowe rozciąganie, które można bardziej odpowiednio naśladować na tej platformie, w przeciwieństwie do tradycyjnej jednoosiowej platformyrozciągania 7,13,15,18,19. Co więcej, fizyczne cechy pola odkształcenia mogą być zmieniane w locie podczas eksperymentu. Możliwości te pozwalają użytkownikowi badać odpowiedź na poziomie komórkowym i tkankowym na szeroką gamę wysoce złożonych, anizotropowych, czasowo i przestrzennie zmiennych pól odkształceń. W tym artykule opisano zalety i ograniczenia platformy BAXS, a także jej konstrukcję, zasady działania oraz szczegóły eksperymentalne dla eksperymentów na pojedynczych komórkach i całych tkankach.

figure-introduction-1
Rysunek 1. Przegląd platformy BAXS. A) Widok z góry platformy BAXS przedstawiający cztery silniki z cewkami drgającymi. B) Szczegółowy obraz podgrzewacza szalki Petriego używanej do utrzymywania komórek i tkanek w temperaturze 37 °C. C) Platforma może być zamontowana na mikroskopie odwróconym w celu wykonywania obrazowania żywych komórek podczas eksperymentów rozciągających. D) Szczegółowy obraz silnika cewki drgającej; ruchoma część platformy. E) Szczegółowy obraz stopnia pozycjonowania liniowego umożliwiający pionowe przemieszczenie systemów mocujących. F) Szczegółowy obraz enkodera optycznego, który zapewnia kontrolerowi ruchu położenie silnika w czasie rzeczywistym. G) Szczegółowy obraz kontrolera ruchu pokazujący cztery wejścia enkodera optycznego i wyjścia mocy do czterech silników cewki drgającej.

figure-introduction-2
Rysunek 2. System zaciskowy do eksperymentów z rozciąganiem komórek. A-B) Zdjęcia przedstawiające szczegóły zacisków używanych do mocowania podłoża PDMS do silników cewki drgającej w celu rozciągnięcia. C) Podłoże jest owinięte wokół cylindrycznej części zacisku, a jego elementy kotwiące znajdują się w rowku u góry. Następnie podłoże jest zabezpieczane za pomocą wkrętów dociskowych, które wciskają podłoże/elementy kotwiące w górny rowek. D) Ilustracja platformy BAXS z zaciskami przytrzymującymi podłoże na miejscu. Wstawka przedstawia szczegółowy widok podłoża z przymocowanymi do niego komórkami znajdującymi się tuż nad szkiełkiem nakrywkowym i obiektywem mikroskopu.

figure-introduction-3
Rysunek 3. Zestawienie materiałów membrany i jej systemu mocowania. Rysunki przedstawiające wymiary głównych części zintegrowanych z platformą dwuosiową w celu przeprowadzenia eksperymentów rozciągania komórek.

figure-introduction-4
Rysunek 4. Przykład systemu mocowania do oceny sztywności statków małego kalibru. A-B) Szczegółowe zdjęcia systemu zaciskowego używanego do wywoływania deformacji w aorcie myszy o średnicy 1 mm. Kołki ze stali nierdzewnej zostały starannie ukształtowane w otwarte trójkąty, aby umożliwić przesuwanie się naczynia na obu kołkach. C) Ilustracja platformy BAXS z zaciskami przytrzymującymi statek i ogniwem obciążnikowym przymocowanym między nieruchomym silnikiem a lewym zaciskiem. Wstawka przedstawia szczegółowy widok z góry naczynia zamontowanego na kołkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mechaniczne odkształcenie pojedynczych komórek

  1. Wytwarzanie podłoża PDMS z osadzonymi koralikami fluorescencyjnymi
    Przed wytworzeniem podłoża mikrosfery fluorescencyjne w roztworze wodnym są ponownie zawieszane w izopropanolu w celu zwiększenia mieszania kulek w PDMS ze względu na jego hydrofobowy charakter.
    1. Pobrać pipetę z 500 μl mikrosfer fluorescencyjnych do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przy sile 16 200 x g przez 10 minut.
    2. Odrzucić supernatant i dodać 500 μl izopropanolu, a następnie przez 5 minut wirować. Odłożyć fiolkę na noc w ciemności, aby umożliwić osadzanie się dużych cząstek.
    3. Następnego ranka ostrożnie przenieść supernatant do czystej fiolki z mikrowirówką. To rozwiązanie ściegu może być używane do wytwarzania więcej niż 5 podłoży. UWAGA: Roztwór kulki będzie nadal osadzał się przez następne 3 dni. Uważaj, aby nie zawiesić granulatu ponownie.
    4. Wlać 0,5 g utwardzacza dostarczonego z zestawem PDMS do fiolki z mikrowirówką o pojemności 1,5 ml za pomocą wagi naukowej. W kolejnych krokach dodaj łącznie 90 μl kulek (w sześciu dodatkach po 15 μl), wirując przez 1 minutę między każdym dodawaniem. Uchylenie.
    5. Odważyć 10 g PDMS i mieszać przez co najmniej 12 minut z 0,5 g utwardzacza uzupełnionego kulkami fluorescencyjnymi.
    6. Wykonaj formę w kształcie krzyża SU-8 2050 przy użyciu standardowych technik fotolitografii, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zastosowana forma ma wysokość 320 μm i powierzchnię 13,4cm2 (rysunek 3). Pleśń może zawierać 428 μl lub 440 mg PDMS.
    7. Wlać 400 mg PDMS z kulkami do formy w kształcie krzyża za pomocą pipety transferowej i utwardzać przez 2 godziny w temperaturze 80 °C. Po utwardzeniu oderwij podłoże od formy (rysunek 5A). Podłoże można przechowywać na szalce Petriego w temperaturze pokojowej przez 2 tygodnie, nie wykazując znaczących zmian w swoich właściwościach mechanicznych.
    8. Wlać kropelki PDMS (utwardzacz: PDMS w stosunku 1:20) na szalkę Petriego o ostatecznej średnicy około 4 mm i utwardzić je do góry nogami przez 2 godziny w temperaturze 80 °C (ryc. 5B). Te cechy zakotwiczenia mogą być przechowywane na szalce Petriego przez tygodnie. UWAGA: Trzymaj naczynie do góry nogami, aby zapobiec spłaszczaniu się kropli podczas procesu utwardzania.
    9. Obróbka plazmą powietrzną (30 sekund przy 30 W) podłoża i 8 elementów kotwiących. Zwiąż elementy na każdym końcu podłoża w odległości 4 mm od kwadratowego wgłębienia znajdującego się na podłożu (Rysunek 5C).
  2. Membrana montażowa na zaciskach
    1. Owiń każdy koniec podłoża wokół rowkowanej cylindrycznej części clamps i zabezpiecz go na miejscu za pomocą 2 ustalających od góry (Rysunek 2B i Rysunki 5D-E).
    2. Przykręć 4 zaciski do uchwytu zacisku i wlej PDMS (stosunek 1:20) za pomocą jednorazowej pipety transferowej na styku podłoża i rowkowanej cylindrycznej części zacisków. Rozprowadź nieutwardzony PDMS wokół rowkowanej cylindrycznej części za pomocą klucza imbusowego 1,5 mm.
    3. Wlać PDMS (1:20) do rowków, aż do całkowitego wypełnienia przez działanie kapilarne i utwardzić zespół w temperaturze 80 °C przez 2 godziny (rysunek 5F).
  3. Wysiewanie komórek na błonie
    1. Potraktuj plazmą powietrzną (30 sekund przy 30 W) cały zespół w celu sterylizacji i funkcjonalizacji podłoża, aby umożliwić pokrycie kolagenem.
    2. Funkcjonalizować obszar podłoża, w którym komórki zostaną wysiane, 1 ml 0,02 M kwasu octowego uzupełnionego 16 μg/ml kolagenu ze szczurzego ogona w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Pożądana końcowa gęstość kolagenu wynosi 5 μg/cm2.
    3. Przepłukać podłoże 3x buforem fosforanowym i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut.
    4. Dodać 40 μl pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną zawierającą 2 000 komórek w środkowej części substratu, aby pokryć obszar 1cm2 (gęstość komórek: 20 komórek/mm2). Gęstość komórek można zmieniać zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi.
    5. Umieść cały zespół w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z substratem skierowanym do góry, tak aby kropla pożywki hodowlanej zawierającej komórki znajdowała się na nim. UWAGA: Zespół musi być przechowywany z podłożem skierowanym do góry przez co najmniej 3 godziny, aby komórki mogły go mocno przymocować. Aby zapobiec parowaniu, co 45 minut przez 3 godziny do kropli na podłożu dodaje się 30 μl ciepłej pożywki hodowlanej.
    6. Po 3 godzinach przełóż cały zespół na szalkę Petriego wypełnioną świeżą pożywką hodowlaną, aby zanurzyć substrat i inkubować przez noc, aby umożliwić namnażanie się komórek.
    7. Następnego dnia przygotuj buforowany przez HEPS roztwór soli (HBSS; 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mMMgSO4, 1,8 mM CaCl2 i 11,1 mM dekstrozy). Dostosować pH do 7,4. UWAGA: Roztwór HBSS musi być przygotowywany codziennie i przechowywany w temperaturze 37 °C podczas eksperymentów. To fizjologiczne rozwiązanie służy do utrzymania komórek na etapie mikroskopu poprzez naśladowanie normalnego środowiska tkankowego / krwionośnego.
    8. Zamontuj zestaw na mikroskopie z odwróconym kontrastem fazowym lub mikroskopie fluorescencyjnym Zamontuj zespół clamp-podłoże na platformie BAXS i silnikach. Napełnij szalkę Petriego wewnątrz podgrzewacza szalki Petriego buforem HEPES (Rysunek 2D).

2. Pomiar sztywności statków małego kalibru

  1. preparat
    1. Roztwór fizjologiczny Krebsa: Przygotować roztwór 118,1 mM NaCl, 11,1 mM D-glukozy, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4 i 2,5 mM CaCl2. Doprowadzić pH do 7,4 i natlenić roztwór karbogenicznym gazem medycznym (95% O2/5% CO2) przez 30 minut. UWAGA: Roztwór Krebsa należy przygotowywać codziennie i przechowywać w temperaturze 37 °C podczas eksperymentów. To fizjologiczne rozwiązanie służy do utrzymania tkanek przy życiu poprzez naśladowanie normalnego środowiska tkanek / krwi.
    2. Zgromadź przyrządy do preparacji i oceny mechanicznej naczyń aorty: nożyczki chirurgiczne, pęsetę zgiętą, mikronożyczki, chirurgiczny mikroskop preparacyjny, probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml i pipety serologiczne o pojemności 10 ml. Zabieg chirurgiczny i eksperymentalny nie wymaga żadnych sterylnych warunków. Wcześniej zamontuj zaciski platformy BAXS wraz z ogniwem obciążnikowym.
  2. Izolacja i rozwarstwienie tkanek
    Wszystkie procedury doświadczalne z udziałem zwierząt laboratoryjnych muszą zostać zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania w instytucji użytkownika, który jest zgodny z Przewodnikiem zdrowotnym dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania w kraju użytkownika.
    1. Przeprowadzić eutanazję myszy z wdychaniem 99% CO2 (7 psi) w komorze z pleksiglasu (ryc. 6A).
    2. Otwórz brzuch myszy i przetnij aortę piersiową, aby odkrwawić mysz.
    3. Usuń przeponę, klatkę piersiową i płaty płuc (ryc. 6B). UWAGA: Aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia tkanki, utrzymuj serce przyczepione do aorty i unikaj bezpośredniego dotykania naczynia, ale manipuluj nim za pomocą serca.
    4. Usuń serce, korzeń aorty i aortę piersiową, delikatnie przecinając naczynie a kręgosłupem. UWAGA: Nie należy wywoływać żadnego wydłużenia naczynia podczas wycinania, aby utrzymać wewnętrzną strukturę tkanki w stanie nienaruszonym (ryc. 6C).
    5. Natychmiast zanurz i trzymaj serce i aortę w roztworze Krebsa.
    6. Przeciąć i ostrożnie umyć aortę w roztworze Krebsa, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi. Usuń tkankę łączną za pomocą mikronożyczek, pęsety i chirurgicznego mikroskopu preparacyjnego (ryc. 6D-E). UWAGA: Zachowaj całą długość naczynia i użyj korzenia aorty, aby określić orientację naczynia.
  3. Określanie i montaż wymiarów zbiornika
    Aby określić sztywność naczynia, wymagane są wymiary niezaładowanego naczynia, które można określić za pomocą skalibrowanego mikroskopu.
    1. Wytnij pierścień aorty o długości około 2 mm i dokładnie zmierz jego długość za pomocą skalibrowanego ustawienia mikroskopu (ryc. 6F-G). Odłóż ten segment na bok w roztworze Krebsa.
    2. Wytnij kolejny pierścień aorty tak mały, jak to możliwe między każdym z 2 mm segmentów (Rysunek 6F). Umieść ten mały segment na szkiełku mikroskopowym światłem skierowanym do góry i zmierz grubość ścianki za pomocą skalibrowanego ustawienia mikroskopu (Rysunek 6H).
    3. Napełnij szalkę Petriego na platformie BAXS roztworem Krebsa i włóż segment pierścienia aorty o średnicy 2 mm na kołki do ciągnięcia (wstawka na rysunku 4C).

figure-protocol-1
Rysunek 5. Produkcja i montaż podłoża PDMS. A) Po utwardzeniu podłoże ostrożnie odkleja się od formy SU-8 2050 i odkłada na szalkę Petriego. B) Elementy kotwiące wykonane z PDMS i pomagają zabezpieczyć podłoże na zaciskach. C) Podłoże z elementami kotwiącymi gotowe do montażu. D) Podłoże jest montowane na 4 zaciskach, które są następnie montowane na uchwycie zaciskowym (patrz wkładka). E) Szczegółowy obraz podłoża zamontowanego na 4 zaciskach. F) Procedura wylewania PDMS w rowek pod podłożem. Strzałka pokazuje, że PDMS powoli wypełnia rowek przez kapilarność.

figure-protocol-2
Ryc. 6. Przygotowanie i izolacja aorty piersiowej. A) Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i uśpionej myszy. B) Poprzez podłużne nacięcie brzucha usuwa się klatkę piersiową i płaty płuc. C) Aorta jest ostrożnie usuwana za pomocą serca do manipulowania tkanką. D) Serce i aortę umieszcza się w roztworze fizjologicznym Krebsa. Aorta jest oczyszczana poprzez usunięcie wszystkich tkanek łącznych. E) Szczegółowy obraz przedstawiający serce i aortę. F) Segment aorty używany do oceny sztywności wraz z małymi segmentami służącymi do pomiaru grubości. G-H) Dokładna długość (G) i grubość (H) każdego segmentu naczynia są oceniane za pomocą mikroskopu odwrotnego i programu analitycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozciąganie komórek

Platforma BAXS została wykorzystana do zbadania mechanicznej odpowiedzi jądra w pojedynczych mysich komórkach mioblastów (C2C12) narażonych na deformację substratu o 25%. Komórki mioblastów znajdują się w tkance mięśniowej i są stale narażone na mechaniczne rozciąganie i ściskanie in vivo. Wykazano, że kształt i właściwości mechaniczne jądra komórkowego odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów i aktywności transkrypcyjnej20,21, a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowana tu platforma BAXS ułatwia prowadzenie licznych eksperymentów w zakresie mechanobiologii, od badań pojedynczych komórek po całe tkanki. Ponadto platforma jest bardzo elastyczna i konfigurowalna, co pozwala na liczne eksperymenty ze stymulacją mechaniczną i wieloosiowe próby rozciągania. Platforma umożliwia również utrzymanie komórek i tkanek w warunkach fizjologicznych oraz pozwala na jednoczesną mikroskopię podczas eksperymentów rozciągających. Dwa eksperymenty opisane w poprzednich rozdziałach pokazują wsze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DT było wspierane przez staż podoktorski od le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) oraz stypendium strategiczne MITACS Elevate. CMC było wspierane przez stypendium podoktorskie z le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) oraz stypendium badawcze Ernesta i Margaret Fordów z University of Ottawa Heart Institute. EOB był wspierany przez granty operacyjne MOP80204 z Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) oraz T6335 z Fundacji Serca i Udaru Mózgu w Ontario. CIHR i Medtronic wspólnie zapewniają EOB recenzowaną Katedrę Badań (URC #57093). AEP jest finansowany przez Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Discovery Grant, NSERC Discovery Accelerator Supplement i z wdzięcznością dziękuje za wsparcie programu Canada Research Chairs (CRC) oraz Early Researcher Award od prowincji Ontario.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PDMSEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0,5 KGStosunek podstawy do sieciownika zastosowany w tym protokole wynosi 20:1. Wymieszaj w okapie laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu kurzu 
Mikrosfery fluorescencyjne FluoSpheresInvitrogenF8810Przechowywać z dala od światła.
Cewka liniowaMoticontLVCM-051-051-01Motro składa się z dwóch części (magnes i cewka). Aby działał, musi być zamontowany na łożysku kulkowym.
Prowadnica kulkowaEdmund OpticsNT37-360Miniaturowe i małe prowadnice kulkowe o ruchu liniowym
Stolik pozycjonowania liniowegoEdmund Optics38-960Napęd centralny 1,25 "Kwadratowe stoliki translacji liniowej
Enkoder optycznyGSI microEsystemy Merkury II 1600S -refleksyjny enkoder inkrementalny
Kontroler ruchuGalilDMC-2143(DIN)-DC48 z AMP-20440Sterownik 4-osiowy ze wzmacniaczem 4-osiowym
Ogniwo obciążnikoweHoneywell31 niskieminiaturowe ogniwo obciążnikowe o zakresie 0-150 g
Szpilki do minizacji owadów (0,20 mm)Serwis sworzni Austerlitz SzpilkiKołki ze stali nierdzewnej, które są wygięte w kształcie otwartego trójkąta
SU-8 2050Micro ChemSU-8 2050Trwały fotorezystor epoksydowy negatywowy. Przechowywać z dala od źródeł ciepła i światła
System obróbki plazmą powietrznąGlowresearchAutoglow Oxygen Plasma System
Kolagen ze szczurzego ogonaInvitrogenA10483-01Kolagen I, Rat Tail 5 mg / ml
Hoechst 33342InvitrogenR37605Barwnik fluorescencyjny specyficzny dla DNA. Przechowywać w lodówce.
Elastyczne grzejniki izolowane kaptonem (folia poliimidowa)omega.caKHLV-0504/(10)-P28 V; mogą być dostarczane z regulatorami temperatury i procesu 24 V
1/16 DIN Autotuneomega.caCN63200-R1-LV; zasilanie 24 V.
Pożywka hodowlana DMEMHycloneSH3024301Dulbecco" s Zmodyfikowany 30 Eagle Medium. Trzymaj się 4 ° C
Hyklonpenicyliny-streptomycynySV30010Przechowywać zapasy w stanie zamrożonym. Utrzymuj roztwór roboczy w temperaturze 4 °C.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyklonSH3039603Cprzechowywać w stanie zamrożonym.
Trypsyna 0,05%HyclonSH30236,02Przechowywać w stanie zamrożonym. Trawienie białek przyłączających do komórek do subhodowli
HepesBisent Inc330-050-ELHEPES-buforowany roztwór soli 
NaClFisher ScientificBP358-1HEPES-buforowany roztwór soli / roztwór fizjologiczny Krebsa
KClFisher ScientificBP366-500HEPES buforowany roztwór soli / Krebs roztwór fizjologiczny
MgSO4Fisher ScientificM65-500HEPS - buforowany roztwór soli / roztwór fizjologiczny Krebsa
CaCl2Fisher ScientificC614-500HEPS buforowany roztwór soli / roztwór fizjologiczny Krebsa
DekstrozaFisher ScientificBP220-1HEPES buforowany roztwór soli / Fizjologiczny roztwór Krebsa
NaHCO3Fisher ScientificBP328-1Fizjologiczny roztwór Krebsa
KH2PO4Fisher ScientificBP362-500Roztwór fizjologiczny Krebsa
Karbogen 95% O2/5% CO2LindleDIN:02154749Natlenienie roztworu fizjologicznego Krebsa
NocodazoleSigmaM1404Środek depolimeryzujący mikrotubul
Cytochalazyna-DSigmaC8273Środek depolimeryzujący włókna aktynowe
Anty-&alfa;- SMA-FITCSigmaF3777Służy do barwienia i ilościowego oznaczania zawartości komórek mięśni gładkich
Czerwona plama PicrosiriusFluka43665Służy do barwienia i ilościowego określania zawartości kolagenu
o rozdzielczości 0,5um. do owadów Elastyczne grzejniki regulatorem temperatury

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
  2. Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
  3. Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
  4. Ingber, D. E. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Ann Med. 35, 564-577 (2003).
  5. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
  6. Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
  7. Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
  8. Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
  9. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
  10. Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
  11. Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
  12. Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
  13. Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
  14. Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
  15. Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
  16. Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
  17. Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
  18. Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
  19. Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
  20. Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
  21. Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
  22. Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
  23. Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
  24. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
  25. Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. , (2013).
  26. Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
  28. Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
  29. Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
  30. Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
  31. Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
  32. Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
  33. Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
  34. Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
  35. Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Platforma do rozci gania dwuosiowegodeformacja mechanicznamechanobiologia kom rkipomiar sztywno ci tkankisilniki cewkoweelastyczny pod o emikroskopia odwr conafluorescencyjne mikrosferywytwarzanie PDMSanaliza tkanki aorty

Powiązane artykuły