Artykuł metodologiczny

Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

DOI:

10.3791/51460

⸱

19 lutego 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Franciscan University of Steubenville, 2Department of Computer Science, Franciscan University of Steubenville

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z kamery internetowej oraz kombinacji darmowych i niedrogich programów, wzorce lokomotyw u Drosophila melanogaster mogą być analizowane w celu wykrycia różnic w prędkości, odległości i czasie różnych aktywności motorycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy śledzenia wideo były szeroko stosowane do analizy ruchów Drosophila melanogaster i wykrywania różnych nieprawidłowości w zachowaniu lokomotywy. Chociaż systemy te mogą dostarczać wielu informacji behawioralnych, koszt i złożoność tych systemów mogą być zaporowe dla wielu laboratoriów. Opracowaliśmy tani test do pomiaru zachowania lokomotywy i ruchu zatarciowego w D. melanogaster. System wykorzystuje kamerę internetową do przechwytywania obrazów, które można przetwarzać za pomocą połączenia niedrogiego i bezpłatnego oprogramowania do śledzenia przebytej odległości, średniej prędkości ruchu i czasu trwania ruchu w określonym przedziale czasu. Aby zademonstrować użyteczność tego systemu, zbadaliśmy grupę D. mutanty melanogastrowe, paralitycy wrażliwi na huk (BS), które są 3-10 razy bardziej podatne na aktywność podobną do napadów padaczkowych (SLA) niż muchy typu dzikiego. Korzystając z tego nowatorskiego systemu, byliśmy w stanie wykryć, że zmutowany BS bang senseless (bss) wykazuje niższy poziom lokomocji eksploracyjnej w nowym środowisku niż muchy typu dzikiego. Ponadto system został wykorzystany do określenia, że lek metformina, który jest powszechnie stosowany w leczeniu cukrzycy typu II, zmniejsza intensywność SLA u mutantów BS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę jego krótką żywotność i solidne narzędzia genetyczne, Drosophila melanogaster jest doskonałym modelowym systemem do badania etiologii różnych chorób i leżącej u podstaw fizjologii różnych procesów biologicznych. W wielu przypadkach korzystne jest zmierzenie wpływu, jaki manipulacje behawioralne, genetyczne lub farmakologiczne wywierają na lokomocję w tych organizmach modelowych1,2.

Istnieje wiele metod, które są powszechnie używane do pomiaru ruchu muchy w dwóch wymiarach3-7. Systemy te mogą obsługiwać śledzenie wielu much jednocześnie i mogą mierzyć prędkość, rejestrować długość ścieżki i rejestrować procent czasu, jaki mucha spędziła w ruchu. Zostały one wykorzystane do badania ruchu w różnych kontekstach, w tym wpływu leków na lokomocję i dymorficznej natury płciowej ruchu muchy6-9. Główną wadą tych systemów jest koszt systemu śledzenia lub odpowiedniego oprogramowania i kamery. W niektórych przypadkach może to być tysiące dolarów. Koszt jest szczególnym problemem dla laboratorium, które potrzebowałoby jedynie ograniczonego wykorzystania takiego systemu, na przykład ilościowego określenia wzorców lokomotyw nowo wyizolowanego mutanta.

Prostszą, ale mniej solidną metodą jest użycie systemów, które rejestrują ruch na podstawie tego, ile razy mucha przecina ścieżkę wiązki światła podczerwonego, która jest umieszczona w środku zamkniętej rury10,11. Chociaż takie systemy mogą dostarczyć cennych informacji na temat ruchu i cykli snu i czuwania, mogą zawyżać lub zaniżać ruch, ponieważ nie są w stanie uchwycić rzeczywistej ścieżki muchy. Na przykład muchy, które wykazują znaczny ruch na końcach rurki, zostaną zarejestrowane jako muchy o niskim ruchu, chociaż zastosowano dodatkowe metody o wysokiej rozdzielczości, aby spróbować obejść te ograniczenia12.

Jeszcze prostsze i tańsze są urządzenia do wspinaczki, które mierzą geotaksję, ruch much w górę, przez pojedynczą rurę lub serię rur2,13. Chociaż takie systemy są tanie i mogą łatwo zidentyfikować wady geotaksji, nie są w stanie uchwycić wielu innych aspektów ruchu, które mogłyby być interesujące dla badaczy.

Dla wielu laboratoriów, tani, solidny system analizy, który jest prosty w konfiguracji i obsłudze, byłby korzystnym narzędziem do charakteryzowania różnic behawioralnych u szczepów D. melanogaster. Tutaj opisujemy test, który można ustawić za mniej niż dwieście dolarów i jest w stanie dostarczyć informacji o ścieżce, prędkości i czasie trwania ruchu muchy. Aby wykazać skuteczność testu, przedstawiamy dane pokazujące, że można go wykorzystać do identyfikacji; 1) wada ruchowa u mutanta wrażliwego na napady (BS), który jest podatny na napady padaczkowe oraz 2) zdolność leku metforminy, który jest powszechnie stosowany w leczeniu cukrzycy typu II, do zmniejszania intensywności aktywności podobnej do napadu (SLA) u dwóch mutantów BS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie poszczególnych much do testu lokomocji

  1. Przenieść muchy, delikatnie stukając w poszczególne puste fiolki i zakręcając fiolki bawełnianym zatyczką. Pozwól muchom siedzieć w spokoju 20-30 minut przed obserwacją. Ważne jest, aby nie znieczulać much w ciągu kilku godzin przed obserwacją behawioralną, ponieważ poprzednie badania wykazały, że ekspozycja na znieczulenie może zmienić zachowanie w porównaniu z muchami nieznieczulonymi.
  2. Delikatnie wystuknąć muchę z fiolki i umieścić pojedyncze muchy pod pokrywą szalki Petriego o średnicy 5 cm (o wysokości 5 mm) z małymi szczelinami umożliwiającymi przepływ powietrza. Oświetl od dołu i obserwuj muchy za pomocą kamery internetowej zamontowanej nad szalką Petriego.

2. Przygotowanie poszczególnych much do testu padaczkowego

  1. Nakarm dwudniowe muchy wrażliwe na napady albo standardowymi drożdżami/mąką kukurydzianą/pożywką agarową, albo standardową pożywką zmieszaną bezpośrednio z lekiem. W przypadku przedstawionych tutaj danych, muchom podawano 1 g standardowej pożywki lub 1 g standardowej pożywki zmieszanej z 25 mg metforminy.
  2. Po tym, jak muszki będą karmione przez dwa dni pożywką lub pożywką z lekiem, przenieś je, delikatnie stukając w poszczególne puste fiolki i zakryj fiolki bawełnianym zatyczką. Pozwól muchom siedzieć w spokoju przez 20 minut przed obserwacją. Ważne jest, aby nie znieczulać much w ciągu kilku godzin przed obserwacją behawioralną, ponieważ poprzednie badania wykazały, że ekspozycja na znieczulenie może zmienić zachowanie w porównaniu z muchami nieznieczulonymi.
  3. Wiruj pojedyncze fiolki zawierające pojedynczą muchę na wirowniku laboratoryjnym, używając najwyższego ustawienia przez 10 sekund. Umieść unieruchomioną muchę na czystej białej kartce papieru bezpośrednio pod kamerą internetową zamontowaną nad papierem.

3. Nagrywanie wideo

  1. Nagraj ruch lub SLA za pomocą oprogramowania HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm. Ten program wykorzystuje kamerę internetową do przechwytywania obrazów w oparciu o ustawienia użytkownika.
  2. Wybierz opcję Zdjęcia poklatkowe na karcie Przechwytywanie, Gdy otworzy się okno, wybierz kamerę internetową jako urządzenie przechwytujące. W przypadku większości eksperymentów rozmiar klatki wideo 640 x 480 jest wystarczający.
  3. Wybierz kodek Intel IYUV dla kompresji i wybierz 0,1 s/klatkę dla testu napadu lub wybierz 0,1-0,5 s/klatkę dla testu ruchu. Na karcie Zaawansowane wybierz opcję utwórz plik obrazu .bmp dla każdego przechwycenia i wybierz folder, w którym program ma przechowywać wykonane obrazy (stos obrazów).
  4. Umieść martwą muchę na kartce papieru. Kliknij pole Ustawienia wideo i dostosuj ustawienia na karcie Ustawienia urządzenia, aby uzyskać jasne białe tło i wyraźny kontrast z ciemniejszą muchą.
  5. Kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie. Po zakończeniu okresu nagrywania kliknij przycisk zatrzymania. Stos obrazów powinien teraz znajdować się w wybranym folderze. Uwaga: Przed nagraniem upewnij się, że folder wybrany dla stosu obrazów jest pusty.

4. Analiza danych za pomocą ImageJ

  1. Otwórz bezpłatne oprogramowanie do przetwarzania obrazów NIH ImageJ, które można pobrać ze strony http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html. Uwaga: Oprócz pobrania programu, wtyczka Multitracker musi zostać pobrana i zainstalowana w sposób wskazany na stronie http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html.
  2. Zaimportuj stos obrazów do ImageJ, klikając kartę Plik, a następnie wybierając opcję Importuj → sekwencję obrazów.
    1. Wybierz folder zawierający stos obrazów, podświetl jeden z obrazów i wybierz pozycję Otwórz. Otworzy się okno dialogowe Opcje sekwencji. Kliknij przycisk Sortuj nazwy numerycznie, a następnie wybierz przycisk OK, a stos obrazów zostanie załadowany do ImageJ.
  3. Proguj wszystkie obrazy tak, aby każdy z nich składał się z białego tła, a mucha została przekształcona w czarną kropkę. Aby rozpocząć ten proces, przekonwertuj obraz na format 8-bitowy, wybierając opcję Typ → 8 bitów na karcie Obraz.
    1. Kliknij ponownie kartę Obraz i wybierz Dostosuj próg →. Spowoduje to otwarcie okna dialogowego Próg, w którym można dostosować punkt odcięcia progu.
    2. Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić, czy są dodatkowe czarne kropki lub czy w plasterku brakuje czarnej kropki. W takim przypadku dostosuj próg, aby złagodzić problem. Zazwyczaj próg nie musi być dostosowywany, ponieważ program domyślnie ustawia odpowiednią wartość.
      Uwaga: Każdy slajd w stosie powinien mieć tylko jedną czarną kropkę reprezentującą pozycję muchy.
    3. Wybierz opcję Zastosuj w oknie dialogowym Próg, a otworzy się okno dialogowe Konwertuj na maskę. Nie klikaj żadnej z opcji, ale po prostu kliknij OK, aby przekroczyć próg stosu obrazów.
  4. Po progowaniu stosu obrazów, wybierz wtyczkę Multitracker w zakładce Wtyczki, aby zmierzyć ruch muchy w pikselach. Pojawi się okno dialogowe Object Tracker (Śledzenie obiektów).
    1. Kliknij wszystkie cztery opcje podane w oknie dialogowym, a następnie wybierz przycisk OK. Wtyczka Multitracker dołączy współrzędne do czarnej kropki w każdym wycinku i wyświetli je w oknie Wyniki, a także całkowitą długość ścieżki w pikselach. Okno Ścieżki przedstawia graficznie ścieżkę, którą przebyła mucha.
    2. Skopiuj listę współrzędnych x i y z okna Wyniki i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego programu Excel. Jeśli na którymkolwiek slajdzie w stosie nie ma czarnej kropki, program Multitracker zatrzyma się na tym slajdzie. W takim przypadku należy wrócić do kroku 4.2 i ponownie progować stos, aby upewnić się, że mucha rejestruje się jako kropka na danym slajdzie.
  5. Aby przekonwertować długości ścieżek z pikseli na cm, zrób osobny obraz dwóch kropek oddalonych od siebie o jeden cm na czystej białej kartce papieru.
    1. Wykonaj powyższe kroki (3.1-4.4.2), aby określić współrzędne pikseli x, y dla dwóch kropek i wykorzystać te informacje do określenia liczby pikseli odpowiadającej cm. Ten współczynnik konwersji jest używany w kroku piątym do generowania danych o ruchu w cm. Uwaga: Po wykonaniu tej czynności ważne jest, aby kamera była nieruchoma dla wszystkich przyszłych nagrań. Za każdym razem, gdy kamera jest przesuwana lub dostosowywana, należy powtórzyć ten krok, aby przekonwertować piksele na cm.
    2. Długość ścieżki generowana przez wtyczkę Multitracker zawyża ruch, ponieważ niewielkie wahania pozycji ciała i natężenia/odbicia światła wpłyną na rozmiar i środek czarnej kropki, która jest generowana podczas progowania obrazów. Szum ten musi zostać usunięty, aby uzyskać dokładne oszacowanie ruchu muchy.

5. Analiza danych za pomocą Excela

  1. Usuń szum z zarejestrowanych danych, importując serię współrzędnych x, y wygenerowanych przez program Multitracker do Fly Analysis, programu Excel Visual Basic stworzonego przez autorów. (Program jest dostępny po skontaktowaniu się z autorami.)
  2. Kliknij przycisk Kliknij mnie i wybierz wartość progową. Wybierz wartość progową 0,5 cm/s dla analizy SLA lub wybierz wartość z zakresu 0,1-0,3 cm/s dla analizy ruchu. Kliknij OK, a program obliczy prędkość, czas i odległość ruchu. Uwaga: Program wykorzystuje analizę okna przesuwnego do oceny danych w sekwencyjnych przedziałach 0,5-1,0 s i oblicza prędkość w tym oknie. Wszystko, co znajduje się powyżej zdefiniowanego przez użytkownika punktu odcięcia, jest traktowane jako ruch muchy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj technika była wcześniej używana do analizy różnic w SLA u mutantów Drosophila BS 1. Przedstawione tutaj wyniki dotyczą szczepów BS łatwo zszokowanych (eas), bang senseless (bss) i technicznych nokautów (tko). Locus eas koduje kinazę etanoloaminową zaangażowaną w syntezę fosfatydyloetanoloaminy15, a locus tko koduje mitochondrialną ryboproteinę16. Mutacja bss jest allelem porażonego<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badając wzorce lokomotoryczne lub ruchowe u Drosophila, przydatna jest możliwość wydobycia informacji dotyczących przebytej odległości, prędkości ruchu i wzorca ruchu. Aby wydobyć te informacje, tradycyjnie stosuje się drogi sprzęt, który często jest zaporowy dla mniejszych laboratoriów lub laboratoriów, które chcą oszczędnie korzystać z takich testów4,8,9.

Opisany tutaj test może być wykorzystany do określenia przebytej odległości (rysunki 2 i 6

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną również wyrazić podziękowania dla Kris Burner, Stephena McKinney, Laury Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer i Megan Hyde za ich pracę nad dopracowaniem tego testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamera internetowaLogitechPro900Wystarczy każda wysokiej jakości kamera internetowa.
Oprogramowanie poklatkowe HandiAVIAzcendantNajnowszą wersję można znaleźć pod adresem http://www.azcendant.com/
ImageJNIHNajnowszą wersję można znaleźć pod adresem http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Multiracker Plug-InNIHNajnowszą wersję można znaleźć pod adresem http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html
VortexerVWRVortex Genie 2Wystarczą większość wirów o standardowych rozmiarach, takich jak Vortex Genie 2.
Pokrywa szalki Petriego 5 cmLabM LimitedD011Mniejsze lub większe osłony szalki Petriego mogą być używane do areny w teście ruchu.
Kaseton świetlnywykonany naZbudowany ze złomu. Oświetlenie służy do testu lokomocji. W zależności od oświetlenia pomieszczenia możliwe jest wykonanie testu bez kasetonu.
Oprogramowanie zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
  2. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
  3. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
  4. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
  5. Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
  6. Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
  9. Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
  10. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
  11. Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
  12. Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
  13. Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
  14. Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
  15. Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
  16. Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
  17. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
  18. Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
  19. Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza ruchu Drosophilaledzenie za pomoc kamery internetowejprzetwarzanie w programie Image Joprogramowanie do analizy muchzachowanie lokomotorycznemutanty wra liwe na uderzenieleczenie metforminnagrywanie wideoanaliza danych

Powiązane artykuły