Leczenie pierwotnych osteoblastów myszy kwasem retinowym wytwarza jednorodną populację rozgałęzionych komórek posiadających morfologiczne i molekularne cechy osteocytów. Metoda ta pozwala przezwyciężyć trudności związane z uzyskaniem i utrzymaniem pierwotnych osteocytów w hodowli i może być korzystna w badaniu komórek pochodzących z modeli transgenicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie kwasu retinowego do uzyskiwania kultur osteocytów z pierwotnych osteoblastów myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Potrzeba hodowli osteocytów jest dobrze znana społeczności badaczy kości; izolacja pierwotnych osteocytów jest trudna i powoduje niską liczbę komórek. Dlatego najczęściej stosowanym układem komórkowym jest osteocytowa linia komórkowa MLO-Y4.
Opisana tutaj metoda odnosi się do użycia kwasu retinowego do wytworzenia jednorodnej populacji rozgałęzionych komórek o cechach morfologicznych i molekularnych osteocytów.
Po wyizolowaniu osteoblastów z kalwarii myszy, kwas all-trans retinowy (ATRA) jest dodawany do pożywki komórkowej, a monitorowanie komórek jest prowadzone codziennie pod odwróconym mikroskopem. Pierwsze zmiany morfologiczne są wykrywalne po 2 dniach leczenia, a różnicowanie jest na ogół zakończone w ciągu 5 dni, z postępującym rozwojem dendrytów, utratą zdolności do wytwarzania macierzy zewnątrzkomórkowej, obniżeniem poziomu markerów osteoblastów i zwiększeniem poziomu cząsteczek specyficznych dla osteocytów.
Codzienne monitorowanie komórek jest potrzebne ze względu na wrodzoną zmienność komórek pierwotnych, a protokół może być dostosowany z minimalnymi zmianami do komórek uzyskanych z różnych szczepów myszy i zastosowany do modeli transgenicznych.
Metoda jest łatwa do wykonania i nie wymaga specjalnego oprzyrządowania, jest wysoce powtarzalna i szybko generuje dojrzałą populację osteocytów przy całkowitym braku macierzy zewnątrzkomórkowej, co pozwala na wykorzystanie tych komórek do nieograniczonych zastosowań biologicznych.
Wprowadzenie
Osteocyty, najliczniejszy typ komórek kostnych, są ostatecznie zróżnicowanymi, wysoce rozgałęzionymi komórkami głęboko położonymi w szkielecie. Ciało komórkowe dojrzałych osteocytów zawarte jest w lukach kostnych i ma różne kształty; Osteocyty z wydłużonymi ciałami komórkowymi znajdują się w kości korowej, podczas gdy zaokrąglone osteocyty są częstsze w kości beleczkowej1. Rozgałęzione dendryty rozciągają się od ciała komórki i znajdują się w maleńkich kanałach zwanych kanalikami, tworząc skomplikowaną sieć, która nawiązuje wiele kontaktów nie tylko z innymi osteocytami, ale także z innymi typami komórek kostnych, szpikiem kostnym, naczyniami krwionośnymi i powiązanymi perycytami. Poprzez płyn śródmiąższowy zawarty w lukach i kanalikach osteocyty są również ostatecznie połączone z układem krążenia, dzięki czemu mogą wpływać nie tylko na zdarzenia miejscowe, ale także ogólnoustrojowe i odwrotnie, ich zachowanie może być regulowane zarówno przez zmiany miejscowe, jak i ogólnoustrojowe2.
Badania nad osteocytami ostatnio nabrały rozpędu, dzięki kilku postępom technicznym, takim jak generowanie transgenicznych zwierząt transgenicznych specyficznych dla tkanek i komórek, zastosowanie potężnych technik mikroskopowych i wysokoprzepustowych molekularnych badań przesiewowych3,4. Wiedza na temat tych komórek jest jednak nadal niekompletna, głównie ze względu na stosunkowy niedobór odpowiednich modeli in vitro. W rzeczywistości osteocyty zawsze były trudne do uzyskania i utrzymania w hodowli ze względu na głęboką lokalizację i niski poziom proliferacji, który charakteryzuje tak zróżnicowany typ komórek.
Na przestrzeni lat opracowano wiele metod izolowania pierwotnych osteocytów5-7, chociaż zazwyczaj dają one niską wydajność komórek i niosą ze sobą ryzyko, że nawet kilka zanieczyszczających fibroblastów szybko przerośnie osteocyty8. Z tego powodu większość prac eksperymentalnych in vitro przeprowadzono do tej pory na dobrze znanej linii komórkowej osteocytów MLO-Y4 9.
Dodatkowe metodologie in vitro mogłyby zwiększyć możliwość badania tych komórek i mogłyby poprawić analizę biologii i patofizjologii osteocytów. Aby metody te mogły być powszechnie stosowane, powinny być łatwe do odtworzenia i nie wymagać specjalnego oprzyrządowania ani bardzo długiego czasu oczekiwania na osiągnięcie dojrzałości komórki. Co ważne, jeśli miałyby zastosowanie do komórek pierwotnych, umożliwiłyby wykorzystanie zwierząt transgenicznych. Niedawno opisaliśmy, że leczenie osteoblastów linii komórkowej MC3T3-E1 i pierwotnych osteoblastów kwasem retinowym indukuje szybką zmianę fenotypu prowadzącą do rozwoju jednorodnej populacji rozgałęzionych komórek posiadających cechy morfologiczne i molekularne osteocytów10.
Kwas all-trans retinowy (ATRA) jest aktywnym produktem metabolicznym witaminy A, który reguluje transkrypcję genów poprzez wiązanie jądrowych receptorów kwasu retinowego (RAR). RAR wiążą się z DNA jako heterodimery z receptorami retinoidu X (RXR), co ostatecznie prowadzi do modulacji genów docelowych reagujących na kwas retinowy (RA)11. Wykazano, że ATRA moduluje różnicowanie i dojrzewanie kilku typów komórek, w tym innych rozgałęzionych komórek, takich jak komórki neuronalne12 i podocyty13.
Opisana tutaj metoda opiera się na dodawaniu ATRA do pierwotnych osteoblastów. Aby ATRA była skuteczna, musi być dodawana na precyzyjnym etapie dojrzewania do komórek posianych o określonej gęstości; Z naszego doświadczenia wynika, że warunki te mają kluczowe znaczenie dla uzyskania zmiany fenotypu z osteoblastów na osteocyty.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z obowiązującymi krajowymi i europejskimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i zostały sprawdzone i zatwierdzone przez komisję etyki Uniwersytetu w Mediolanie.
1. Izolacja pierwotnych osteoblastów
Metoda, z niewielkimi modyfikacjami, jest zgodna z procedurą opisaną przez Dodiga i innych14.
- Przygotuj pożywkę trawiącą, dodając 0,1% kolagenazy P i 0,05% trypsyny (zaczynając od 2,5% trypsyny 10X, bez czerwieni fenolowej) do podłoża HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa, bez czerwieni wapniowej, magnezowej lub fenolowej).
- Użyj 3-4 dniowych myszy (procedurę można zastosować już na 1 myszy).
- Ofiara przez ścięcie. Spryskaj głowę 70% etanolem i trzymaj na lodzie. Usuń warstwy skóry i mięśni za pomocą pęsety i nożyczek preparacyjnych/chirurgicznych.
- Delikatnie usuń kości ciemieniowe i rozdziel je, podążając za szwem strzałkowym na dwie połowy. Upewnij się, że kości są wolne od szwów i wszelkich przylegających tkanek i umieść pojedyncze kawałki kości w płytkach zawierających podłoże HBSS do czasu zakończenia zabiegu.
- Odrzucić HBSS i dodać do każdej studzienki pożywkę trawiącą na 15 minut w temperaturze 37 °C.
- Odrzucić supernatant.
- Ponownie dodać pożywkę trawiącą na 15 minut w temperaturze 37 °C.
- Tym razem zachowaj supernatant i umieść go w alfa-MEM (Minimum Essential Medium) uzupełnionym o 10% FBS (Fetal Bull Bull Surure) i 1% streptomycyny/penicyliny.
- Powtórz kroki 1.7 i 1.8 2x.
- Zebrać trzy zebrane frakcje, odwirować komórki przez odwirowanie z prędkością 425 g przez 5 minut, odrzucić supernatant, dodać 3 ml uzupełnionego alpha-MEM w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego i przenieść do kolby o średnicy 25 cm2.
- Zmień podłoże po 24 godzinach, aby usunąć zanieczyszczenia i martwe komórki.
- Dodać 50 μg/ml kwasu askorbinowego (AA) i 3 mM hydrat (GP) 2-fosforanu glicerolu (GP) do pożywki alfa-MEM.
- Następnie zmieniaj pożywkę (alpha-MEM plus AA/GP) co drugi dzień.
2. Protokół ATRA
- Przeprowadzaj wszystkie eksperymenty z ATRA (kwasem All-Trans retinoiowym) w zaciemnionym pomieszczeniu, aby zapobiec inaktywacji.
- Przygotować 1X roztwór trypsyny w pożywce HBSS i przechowywać w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
- Usuń pożywkę z komórek subkonfluentnych i ostrożnie umyj je HBSS.
- Dodać 1 ml trypsyny, delikatnie obrócić kolbę, aby wszystkie komórki pokryły się trypsyną, i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
- Sprawdź rzeczywiste oderwanie komórek pod odwróconym mikroskopem.
- Dodaj 3 ml pożywki alfa-MEM, aby dezaktywować trypsynę.
- Odzyskać komórki i odwirować przez 15 minut przy 425 g.
- Zawiesić osad komórkowy w świeżym podłożu.
- Umieść kroplę w komorze zliczającej hemocytometr, pozostaw na kilka minut i policz liczbę komórek.
- Umieść komórki w kolbach o długości 25 cm2 o gęstości 10 000 komórek/cm2 z alpha-MEM plus AA/GP. Należy pamiętać, że gęstość komórek jest istotna dla optymalnego rozwoju procesów komórkowych i kontaktów międzykomórkowych. Gęstość wyjściowa wyższa niż 10 000 komórek/cm2 upośledza prawidłowy rozwój procesów komórkowych, ale mniejsza liczba komórek powoduje przedwczesną śmierć komórek z powodu braku kontaktów międzykomórkowych.
- Dodawać 5 μM ATRA do pożywki co 24 godziny.
- Codziennie monitoruj komórki, aby ocenić morfologię: zmiany morfologiczne obserwuje się na ogół po 48 godzinach. Jeśli po pierwszych 24-48 godzinach komórki nadal się namnażają, należy ponownie platerować w powyższej gęstości. Jednorodna populacja dojrzałych osteocytów pojawia się po 4-5 dniach. W zależności od potrzeb używaj ogniw w dowolnym momencie, do 12-15 dni.
- Gdy ogniwa są powlekane na innych podłożach (takich jak szkiełka nakrywkowe lub płytki studzienkowe), należy upewnić się, że powyższa gęstość jest zachowana i kontynuować dodawanie ATRA co 24 godziny, aż do użycia. Pozostaw komórki, aby przylegały do nowego podłoża przez co najmniej 24 godziny przed eksperymentem.
3. Barwienie immunologiczne
- W celu barwienia immunologicznego należy umieścić komórki na szkiełkach nakrywkowych i postępować zgodnie z ustalonymi metodologiami (patrz na przykład Burry15).
- Na przykład, w przypadku immunofluorescencji pośredniej, utrwal w 4% paraformaldehydzie lub zimnym acetonie, inkubuj sekwencyjnie z przeciwciałem pierwszorzędowym w RT przez 1 godzinę w wilgotnej komorze, a następnie z przeciwciałem wtórnym znakowanym fluorescencyjnie w ciemności, w RT przez 30 minut, w wilgotnej komorze.
- Użyj DAPI lub analogów do barwienia jądrowego i zamontuj w podłożu zapobiegającym blaknięciu.
4. Barwienie i ekstrakcja czerwieni alizaryny
- Ułóż komórki na szkiełkach nakrywkowych.
- Napraw komórki, zanurzając szkiełko nakrywkowe w 70% etanolu na 10 minut.
- Przykryj komórki kilkoma kroplami roztworu barwiącego czerwień alizarynową (1 mg/ml, pH 5,5) przez 30 minut.
- Umyj szkiełka nakrywkowe wodą z kranu. Zamontuj kroplę glicerolu na szkiełkach i rób zdjęcia za pomocą mikroskopu pionowego przy powiększeniu 10X i 20X.
- Po wykonaniu powyższej procedury odzyskaj szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w wodzie z kranu.
- Umieść każde szkiełko nakrywkowe w dołku.
- Dodać 60% kwasu nadchlorowego (ilość musi być wystarczająca, aby całkowicie pokryć komórki) i pozostawić O/N w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
- Odczytać gęstość optyczną supernatantu za pomocą spektrofotometrii przy długości fali 450 nm.
- Aby znormalizować wartości liczby komórek, dodaj Janus Green (0,2% roztwór w PBS), aby pokryć preparat komórkowy na 10 minut.
- Umyj dokładnie ultraczystą wodą.
- Dodać 0,5 N HCl (ilość musi być wystarczająca, aby pokryć wszystkie komórki) i delikatnie wstrząsać ręcznie przez kilka sekund.
- Odczytać absorbancję przy długości fali 615 nm za pomocą spektrofotometrii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki uzyskano z 5 do 10 niezależnych eksperymentów.
Morfologia komórek
Pierwotne komórki traktowane AA/GP wykazują głównie cechy przypominające brukowanie, charakterystyczne dla dojrzałych osteoblastów. Można w nich znaleźć przemieszane komórki rozgałęzione (wskazane czerwonymi strzałkami na Rysunku 1A), które prawdopodobnie reprezentują niektóre osteocyty.
Po zastosowaniu ATRA komórki szybko zaczynają wykazywać rozgałęzienia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W ostatnich latach osteocyt stał się najbardziej centralną komórką w kości. Postępy w badaniach stopniowo ujawniają szereg wcześniej niepodejrzewanych lub nieudowodnionych właściwości osteocytów, które mają ogromną wartość dla projektowania nowatorskich i lepszych metod leczenia różnych chorób kości. Jednak badania nad biologią osteocytów cierpią z powodu ograniczonej dostępności modeli in vitro do tego stopnia, że osteoblasty były wykorzystywane jako komórki zastępcze przez długi czas, zanim udostępniono linię ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie zostało zapewnione przez "Progetto a concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" dla MD i Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolagenaza P | Roche Nauki stosowane | 11213857001 | |
| Trypsyna | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Wstępnie podgrzane w temperaturze 37 & stopni; C przed użyciem |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Wstępnie podgrzej w temperaturze 37 &; C przed użyciem |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycyna/Penicylina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Kwas askorbinowy | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glicerol 2-fosforan sól disodowa hydrat | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Chronić ATRA przed światłem |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | Rozpuścić w PBS i przefiltrować przed użyciem. Zawsze pracuj pod maską chemiczną. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Może być dodawany do przeciwciała drugorzędowego |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Kwas nadchlorowy | Sigma-Aldrich 176745 | Stosować ostrożnie (zalecana jest ochrona skóry i oczu) | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Używaj ostrożnie (zalecana jest ochrona skóry i oczu) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Pęseta #7, końcówki 0,40 x 0,5 mm | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Pęseta #4, końcówki 0,40 x 0,45 mm | World Precision Instruments | 501978 | |
| Nożyczki preparacyjne, proste, zakrzywione 10 cm | World Precision Instruments | 14394 | |
| Nożyczki chirurgiczne, 14 cm, proste, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Kolby hodowlane | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox Szkiełka nakrywkowe | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Mikroskop | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
Bibliografia
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. J Bone Miner Res. 7 (4), 389-396 (1992).
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J. Osteocyte isolation and culture. Methods Mol Med. 80, 41-50 (2003).
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
