Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Podsumowanie

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Streszczenie

Obrazowanie próbek biologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej znacznie się rozwinęło dzięki nowym technologiom, które pozwalają na pokonanie bariery rozdzielczości dyfrakcji światła, co pozwala na uzyskanie superrozdzielczości żywych próbek. Obecnie istnieją trzy główne rodzaje technik super-rozdzielczości – wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (w tym techniki takie jak PALM, STORM i GDSIM) oraz mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM). Podczas gdy techniki lokalizacji STED i pojedynczych cząsteczek wykazują największy wzrost rozdzielczości, są one wolniejsze, oferując większą szybkość akwizycji obrazu. Trójwymiarowa karta SIM (3D-SIM) to technika mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu widzenia, która oferuje szereg zalet zarówno w porównaniu z lokalizacją pojedynczych cząsteczek, jak i STED. Rozdzielczość jest poprawiona, z typową rozdzielczością boczną i osiową odpowiednio 110 i 280 nm oraz głębokością próbkowania do 30 μm z szkiełka nakrywkowego, co pozwala na obrazowanie całych komórek. Najnowsze osiągnięcia (szybkie 3D-SIM) w technologii zwiększającej szybkość przechwytywania surowych obrazów pozwalają na szybkie uchwycenie procesów biologicznych zachodzących w ciągu kilku sekund, przy jednoczesnym znacznym ograniczeniu fototoksyczności i fotowybielania. Tutaj opisujemy zastosowanie jednej z takich metod do obrazowania komórek bakteryjnych zawierających znakowane fluorescencyjnie cytokinetyczne białko FtsZ, aby pokazać, w jaki sposób komórki są analizowane i rodzaj unikalnych informacji, które może dostarczyć ta technika.

Wprowadzenie

Na przestrzeni lat do badania bakterii używano wielu różnych technologii obrazowania, w tym różnych technik mikroskopii elektronowej i optycznej. Podczas gdy mikroskopia elektronowa oferuje niezwykle wysoką rozdzielczość, aż do nanometrów, potrzeba próżni i stosowania środków kontrastowych ograniczyła tę technikę do utrwalonych i osadzonych próbek. Artefakty mogą być również wprowadzane ze względu na długotrwałe przygotowanie próbki, a do przygotowania próbek oraz analizy i interpretacji powstałych obrazów potrzebny jest wykwalifikowany praktyk. Mikroskopia optyczna oferuje korzyści w postaci prostszego przygotowania próbki i aplikacji wielu etykiet ze względną łatwością w porównaniu z mikroskopią elektronową. Za pomocą białek fluorescencyjnych i koniugatów barwnikowych możliwa jest również możliwość badania żywych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dzięki poprawie stabilności fluoroforu i wielkości/struktury białek fluorescencyjnych, co prowadzi do zmniejszenia toksyczności komórek, a także postępom w technologii wykrywania kamer, mikroskopia fluorescencyjna z wykorzystaniem szerokokątnych i konfokalnych systemów obrazowania znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat dynamiki przestrzennej komórek. Korzystając z tych technik, nasza wiedza na temat komórki bakteryjnej w ciągu ostatnich 20 lat znacznie się rozwinęła, osiągając znacznie bardziej szczegółowy obraz, który ujawnia wysoki poziom organizacji strukturalnej i białkowej w komórce bakteryjnej1.

Jednak konwencjonalne metody mikroskopii optycznej są ograniczone dyfrakcją, co oznacza, że rozdzielczość wewnętrzna wynosi około połowy długości fali użytego światła wzbudzenia. W rezultacie, nawet przy najbardziej optymalnym konwencjonalnym systemie mikroskopii optycznej, najlepsza rozdzielczość boczna wynosi około 220-250 nm, a rozdzielczość osiowa wynosi około 500 nm (przegląd patrz Schermelleh i wsp.²). W szczególności dla biologów komórek bakteryjnych nadal poważnie ogranicza to nasze zrozumienie organizacji przestrzennej tych maleńkich komórek; o średnicy zaledwie 1-2 μm i długości 1-10 μm. Istnieje również zapotrzebowanie na techniki o wyższej rozdzielczości, które można przeprowadzić na żywych komórkach, w których można analizować dynamiczne zachowanie przestrzenne białka w celu uzupełnienia danych in vitro.

W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka technik obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości. Mikroskopia superrozdzielcza opisuje techniki obrazowania, które co najmniej podwajają rozdzielczość boczną możliwą do uzyskania za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej, pokonując w ten sposób barierę dyfrakcyjną. Techniki te manipulują oświetleniem i/lub analizą emitowanego światła w celu uzyskania rzeczywistego wzrostu pozornej rozdzielczości. Obecnie istnieją trzy główne rodzaje technik super-rozdzielczości – i) mikroskopia wymuszonej deprymcji emisji³ (STED); ii) mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek, w tym techniki takie jak mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji^4,5 (PALM), stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej⁶ (STORM), bezpośrednia STORM⁷ (dSTORM) oraz zubożenie stanu podstawowego ze zwrotem pojedynczej cząsteczki⁸ (GDSIM); oraz iii) mikroskopia oświetlenia strukturalnego^9-12 (SIM). Techniki lokalizacji pojedynczych cząsteczek oferują największy wzrost rozdzielczości bocznej, do 10-40 nm w próbkach biologicznych. W wielu implementacjach mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek głębokość próbkowania jest ograniczona do fali ulotnej, a początkowe implementacje STED były również ograniczone pod względem głębokości próbkowania. Jednak ostatnie postępy, takie jak zastosowanie optyki adaptatywnej, wykorzystanie astygmatyzmu w funkcji punktowego rozproszenia w różnych punktach ogniskowych, detekcja wielopłaszczyznowa i wykorzystanie dwóch obiektywów do wnioskowania o osiowym położeniu emitowanego światła, przyniosły poprawę zarówno rozdzielczości osiowej, jak i głębokości próbkowania zarówno w lokalizacji STED, jak i pojedynczej cząsteczki^13,14. Szybkość pozyskiwania danych dla technik lokalizacji STED i pojedynczych cząsteczek jest również stosunkowo niska ze względu na dużą liczbę obrazów, które należy uzyskać w celu uzyskania maksymalnej rozdzielczości (do 50 000 w przypadku technik lokalizacyjnych). To powolne pozyskiwanie danych nie nadaje się do obrazowania żywych próbek bez niestandardowych modyfikacji, które często są dość drogie. Te dwie techniki są obecnie optymalnie dostosowane do próbek stałych (przegląd zob. ^2,15), jednak wiele pracy jest wykonywane, aby rozwiązać ten problem.

Trójwymiarowa mikroskopia oświetlenia strukturalnego (3D-SIM) to technika szerokokątna, która poprawia rozdzielczość zarówno poprzeczną, jak i osiową, uzyskując rozdzielczości odpowiednio około 110 i 280 nm. Głębokość pobierania próbek wynosi do 30 μm od szkiełka nakrywkowego, co pozwala na obrazowanie całych komórek. Wariant 3D-SIM opracowany przez Sedata, Agarda i Gustaffssona na platformie Optical Microscope eXperimental (OMX) polega na oświetlaniu próbki znanym wzorem siatki, który jest przesuwany do 15 różnych pozycji w każdej płaszczyźnie z^9-11. Mierzone są prążki w powstałych wzorach mory, które powstają w przestrzeni częstotliwości poza obserwowalnym obszarem. Informacje z przestrzeni częstotliwości są rekonstruowane obliczeniowo w celu wygenerowania widzialnego obrazu o wysokiej rozdzielczości^10,11. Względna szybkość, z jaką można uzyskać surowe obrazy za pomocą tej techniki, umożliwia obrazowanie żywych komórek. Należy jednak zauważyć, że w przypadku procesów biologicznych zachodzących w skali sekund szybkość akwizycji surowych obrazów jest nadal zbyt niska, aby uchwycić dynamiczne zmiany. W przypadku szeregów czasowych z szybkością przechwytywania wynoszącą sekundy powtarzająca się akwizycja bez wystarczającego czasu odzyskiwania może prowadzić do fototoksyczności i fotowybielania, szczególnie podczas obrazowania na żywo małych komórek bakteryjnych.

Aby przezwyciężyć te problemy, opracowano najnowsze rozwiązania dla szybkiej karty 3D-SIM (f3D-SIM). Tutaj opisujemy jeden znany jako OMX Blaze¹⁶, który został wprowadzony pod koniec 2011 roku. Technologia ta tworzy wzorzyste oświetlenie bez użycia fizycznej siatki, jak to było stosowane we wcześniejszych systemach. Zastosowanie interferencyjnych wiązek światła i nowej technologii przesłon pozwala na bardzo szybkie wytworzenie wzorzystego światła na próbce. Szybkość akwizycji obrazu została dodatkowo zwiększona dzięki wprowadzeniu naukowych kamer z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (sCMOS), zwłaszcza w porównaniu z istniejącymi kamerami EMCCD. Zmiany te spowodowały możliwą szybkość akwizycji obrazu wynoszącą jedną klatkę na sekundę dla głębokości próbkowania 1 μm (512 x 512 pikseli, 9 plasterków Z), co pozwoliło na monitorowanie dynamicznych zmian w komórkach, które zachodzą w ciągu kilku sekund¹⁶. Skrócenie czasu pozornej ekspozycji (wzbudzenia) na żywe komórki przy użyciu tej metody pozwala na uchwycenie rozszerzonych szeregów czasowych lub zwiększenie szybkości wychwytywania.

Tutaj opisujemy zastosowanie mikroskopii f3D-SIM do zbadania struktury i dynamicznego ruchu cytokinetycznego pierścienia Z w komórkach dwóch gatunków bakterii: modelowego organizmu w kształcie pręcika Bacillus subtilis i kokoidalnego ludzkiego patogenu Staphylococcus aureus. FtsZ jest białkiem cytoszkieletu podobnym do tubuliny, które odgrywa kluczową rolę w podziale komórek u bakterii^17,18. Lokalizuje się w miejscu podziału, aby zrekrutować co najmniej 20 innych białek podziałowych, tworząc aparat podziału^17,18 i uważa się, że zapewnia siłę do zwężenia komórki^19-23. Metoda ta ujawnia, że FtsZ jest niejednorodnie rozmieszczony wokół pierścienia Z w obu organizmach w układzie podobnym do koralików; rozwiązując długo utrzymywany problem, czy pierścień Z jest ciągłym, jednolitym pasem wokół komórki, jak to uwidoczniono za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu, czy też nieciągłą strukturą, jak sugeruje kriotomografia elektronowa (ECT)²⁴. Pokazujemy, w jaki sposób możliwości 3D-SIM mogą znacznie poprawić badanie przestrzenne maleńkich (o średnicy 1 μm) okrągłych komórek, takich jak S. aureus, które dzielą się w trzech kolejnych prostopadłych płaszczyznach (x,y,z). Badania poklatkowe wykorzystujące te techniki pokazują, że struktura pierścienia Z jest dynamiczna, z dużymi zmianami organizacyjnymi w pierścieniu, a nie cząsteczkami FtsZ poruszającymi się do i z nieruchomego rusztowania²⁴.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Przygotowanie komórek B. subtilis do obrazowania
   1. Zaszczepić 10 ml bulionu Penassay (PAB, znanego również jako pożywka antybiotykowa 3) pojedynczą kolonią szczepu B. subtilis SU570 (168 trpC2 ftsZ::ftsZ-gfp-spec)¹⁶. Rosnąć przez noc w wytrząsarce o niskiej prędkości (100 obr./min) w temperaturze 30 °C.
   2. Rozcieńczyć kulturę przez noc do 0,05 A₆₀₀ (absorbancja mierzona przy 600 nm) w świeżym PAB w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem z dużą prędkością (215 obr./min) i rosnąć do połowy fazy wykładniczej (A₆₀₀ ~ 0,4).
   3. Dodaj 2 g agarozy do elektroforezy w 100 ml 1x pożywka wzrostowa (PAB) w szklanej butelce z zakręcaną nakrętką. Rozpuść agarozę w autoklawie. Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy i w kuchence mikrofalowej w celu stopienia agarozy w razie potrzeby. Pozostawić do zastygnięcia w temperaturze pokojowej.
   4. Przymocuj samoprzylepną ramkę (pojemność 65 μl; patrz Tabela materiałów) do standardowego szklanego szkiełka mikroskopowego. Aby to zrobić, usuń cienki arkusz poliestrowy (każda ramka samoprzylepna jest umieszczona między dwoma arkuszami poliestru, jednym cienkim i jednym grubym, i ma usunięty środkowy kwadrat) i nałóż odsłoniętą powierzchnię klejącą ramy na powierzchnię szkiełka mikroskopowego. To skutecznie tworzy kwadratową studnię na szczycie zjeżdżalni. Pozostaw gruby arkusz poliestru przymocowany do ramy, ponieważ zapobiegnie to przyklejaniu się do niej szkiełka nakrywkowego w kolejnych krokach.
   5. Rozpuść roztwór agarozy w kuchence mikrofalowej do wrzenia i odpipetuj 67 μl do ramki klejącej. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uzyskać płaską powierzchnię i pozostaw w temperaturze pokojowej na 5-10 minut. Usuń szkiełko nakrywkowe na 1-2 minuty podczas pobierania próbki.
   6. Pobrać 1 ml podwielokrotności próbki i odwirować przy 5 900 x g przez 30 sekund. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl świeżego PAB.
   7. Pobrać 2,5 μl zagęszczonej próbki i odpipetować na wcześniej przygotowaną podkładkę agarozową. Próbkę rozprowadzić równomiernie wzdłuż płaskiej powierzchni podkładki agarozowej. Zdejmij ramkę samoprzylepną ze szkiełka mikroskopowego za pomocą pęsety, nie dotykając podkładki agarozowej.
   8. Przenieść wacik agarozowy ze szkiełka mikroskopowego na szalkę Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem nakrywkowym. Odwrócić podkładkę agarozową tak, aby zawiesina komórek i szkiełko nakrywkowe szalki Petriego stykały się ze sobą bezpośrednio. Dolna część szalki Petriego ma współczynnik załamania światła 1,525 dla obrazowania w wysokiej rozdzielczości.
2. Przygotowanie żywych komórek S. aureus do obrazowania
   1. Zaszczepić 10 ml bulionu L pojedynczą kolonią szczepu S. aureus SA94 (SH1000 zawierającego pLOW-FtsZ-GFP i pGL485; Erm^r, Cm^r)²⁵. Uprawiać przez noc w wytrząsarce obrotowej o niskiej prędkości (100 obr./min) w temperaturze 37 °C.
   2. Rozcieńczyć kulturę przez noc do 0,05 A₆₀₀ (absorbancja mierzona przy 600 nm) w świeżym L-bulionie 0,05 mM IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd) w celu indukcji produkcji białka fuzyjnego.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z dużą prędkością (215 obr./min) i rosnąć do połowy fazy wykładniczej (A₆₀₀ ~ 0,4).
   4. Postępuj zgodnie z krokami 1.1.3 - 1.1.8 zgodnie z opisem dla preparatu żywych komórek B. subtilis.
      Uwaga: Dodać odpowiednie stężenie induktora do roztworu agarozy w kroku 1.1.3 dla szczepów, które wyrażają fluorescencyjne białko fuzyjne pod kontrolą indukowalną.

2. Przygotowanie mikroskopu

Ta metoda wykorzystuje system obrazowania 3D-SIM DeltaVision OMX (Optical Microscope, eXperimental) wyposażony w moduł Blaze. Do opisanych eksperymentów używa się tylko jednego lasera i jednej kamery. Natężenie oświetlenia i ścieżka światła są opisane na rysunku 1. Metoda ta zakłada, że mikroskop posiada odpowiednią kalibrację, pliki funkcji transferu optycznego (OTF) oraz wykonaną konserwację kolimacji świetlnej.

1. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek upewnij się, że stopień grzewczy jest przymocowany do stolika ceramicznego, a kołnierz grzewczy obiektywu jest przymocowany do obiektywu (obiektyw olejowy 60X 1.42 NA).
2. Włącz obiektyw i stage grzałki co najmniej 4 godziny przed obrazowaniem i powoli zwiększaj temperaturę do wymaganego ustawienia z maksymalną szybkością 5 °C/h. Zaleca się rozpoczęcie tego procesu wieczorem przed obrazowaniem i zwiększenie temperatury w temperaturze 3 °C/4 godziny. W przypadku eksperymentów z żywymi komórkami z B. subtilis większość doświadczeń przeprowadza się w temperaturze 30 °C. W przypadku S. aureus wszystkie eksperymenty przeprowadza się w temperaturze 37 °C.
3. W dniu eksperymentu włącz system co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem, aby umożliwić pełną stabilizację systemu i laserów. Załaduj małe naczynie stage wkładkę na podgrzewany stage, aby podgrzać.
   1. Włącz stację roboczą kontrolera głównego.
   2. Włącz stację roboczą przetwarzania obrazu.
   3. Włącz chłodnicę aparatu znajdującą się na podłodze na zewnątrz obudowy mikroskopu.
   4. Włącz wszystkie kamery sCMOS (nawet jeśli nie wszystkie będą używane).
   5. Wewnątrz obudowy lasera i elektroniki włącz:
      1. Podwozie kontrolera przyrządów.
      2. Obudowa Nanomotion.
      3. Kontroler Jena dla Z piezo.
      4. Wszystkie 4 sterowniki silników galvo.
      5. Główny moduł sterujący laserem.
      6. Dodatkowy moduł sterujący laserem.
      7. Wszystkie stacje robocze z kamerami.
      8. Stacja robocza OMXIC.
   6. Na stacji roboczej kontrolera głównego otwórz oprogramowanie OMX, klikając ikonę. Ustaw ścieżkę pliku do zapisania danych w odpowiednim folderze danych.
   7. Aby zainicjować sprzęt, przejdź do menu Sprzęt, wybierz Sprzęt i kliknij przycisk Uruchom ponownie sprzęt. Zamknij okno.
   8. Uruchom oprogramowanie softWoRx. Włącz lasery wymagane do eksperymentów (488 nm).
   9. Włącz przełącznik kluczykowy laserowej blokady bezpieczeństwa.
   10. Upewnij się, że właściwa szuflada filtra dichroicznego jest włożona poniżej obiektywu. W przypadku GFP jest to standardowa (lub stała) szuflada.
   11. W OMX SF przejdź do menu Plik, wybierz Ustawienia i wybierz Stała szuflada z menu rozwijanego Szuflada. Zamknij okno.
   12. Wykonaj następujące czynności na ekranie głównym oprogramowania, w sekcji Parametry światła:
       1. Aktywuj odpowiednią kamerę dla kamery z laserem wzbudzenia i filtrem emisyjnym (FITC) z wyboru Kanał.
       2. Sprawdź, czy tryb obrazu jest ustawiony na sekwencyjny.
       3. Sprawdź, czy ścieżka światła jest ustawiona na SI.
       4. Sprawdź, czy tryb jest ustawiony na 95 MHz.
       5. Sprawdź, czy laser 488 jest wybrany w Wzbudzenie.
       6. Ustaw Rozmiar na 512 x 512 dla rozmiaru okna i Binowanie na 1 x 1.
   13. Na karcie Eksperyment upewnij się, że Typ jest ustawiony na SI z menu rozwijanego.
   14. Upewnij się, że podział na sekcje jest włączony i że odstęp między sekcjami optycznymi jest ustawiony na 0,125.
   15. Upewnij się, że punkt ostrości po rozpoczęciu skanowania znajduje się w środku.

3. Akwizycja obrazu

1. Nałóż kroplę olejku na górną część obiektywu. Dla temperatury 37 °C zalecany olej wyjściowy ma współczynnik załamania światła 1,518, aby jak najlepiej odpowiadał współczynnikowi załamania światła wkładki żelowej używanej do montażu komórek bakteryjnych w temperaturze 37 °C (patrz krok 1.1.3).
2. Umieścić próbkę na płytce Petriego zawierającą przygotowane komórki we wstawce stolika i przykryć okrągłą pokrywką do podgrzewania. Obniżyć stolik do momentu, gdy olej dotknie dna płytki Petriego próbki.
3. Pozwól potrawie zrównoważyć temperaturę przez 15 minut na scenie. Korzystając z ustawienia niskiej ekspozycji wynoszącego 5 ms lub mniej (znajdującego się w sekcji Parametry światła), skoncentruj się na próbce za pomocą elementów sterujących stopniem pozycjonowania nano (dZ, znajdującego się w sekcji Pozycjonowanie nano). Ustaw ostrość w górę i w dół przez próbkę, aby określić, czy światło jest równomiernie rozprowadzane powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej próbki. Jeśli funkcja rozrzutu punktowego nie jest parzysta (aberracja sferyczna), należy oczyścić dno naczynia na próbkę i obiektyw chloroformem. Wymień olej i powtarzaj ten krok, aż zostanie znalezione odpowiednie dopasowanie między olejem a współczynnikiem załamania światła, aby zminimalizować aberrację sferyczną.
4. Używając kroku 0,5 μm dZ, zaznacz górną i dolną część stosu obrazów. Wróć do środka próbki. Kliknij przycisk Pobierz grubość na karcie Eksperyment, aby ustawić grubość pobierania próbki. Utrzymuj wysokość stosu do minimum, uważając, aby nie odciąć górnej i dolnej części pierścieni Z. Typowe grubości próbek B. subtilis wynoszą 2-3 μm.
5. Określ maksymalną wartość intensywności (Max) przykładowego obrazu przy bieżących ustawieniach Exposure (Ekspozycja) i %T (%T). Ta wartość znajduje się poniżej okna obrazu. W przypadku obrazowania poklatkowego dostosuj Ekspozycja i % T, aby uzyskać maksymalną intensywność 1,100-1,400 powyżej tła obrazu. Do uzyskania rekonstrukcji obrazu potrzebna jest minimalna intensywność 1,000 nad tłem. W przypadku jednorazowego obrazu zwiększ maksymalną intensywność do 4 000-5 000.
6. Aktywuj sekcję Time-lapse w zakładce Eksperyment. Ustaw wymaganą liczbę klatek na sekundę i łączny czas. W polu Plik danych wprowadź odpowiednią nazwę pliku. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć pobieranie obrazu.
   Uwaga: Akwizycja obrazu jest zakończona, gdy zielony pasek postępu zostanie zakończony i pojawi się plik dziennika dla zestawu danych w odpowiednim folderze danych.

4. Sprawdzanie jakości danych

1. Na początku akwizycji obrazu zanotuj maksymalną wartość intensywności obrazu na początku akwizycji obrazu dla pierwszej klatki szeregów czasowych. Pod koniec akwizycji pierwszej klatki sprawdź, czy nie nastąpił spadek intensywności sygnału przez stos z o więcej niż 10% dla tej pierwszej klatki. Jeśli w pierwszym punkcie czasowym nastąpił więcej niż ten poziom fotowybielania, dane z szeregów czasowych będą niewystarczającej jakości do analizy, a akwizycja szeregów czasowych może zostać zatrzymana.
2. Pod koniec akwizycji szeregów czasowych otwórz wynikowy plik obrazu RAW z sufiksem .dv i upewnij się, że maksymalna intensywność sygnału zmniejszyła się od początku szeregu czasowego do końcowego obrazu. Odrzuć wszystkie punkty czasowe, w których nastąpiło więcej niż 30% fotowybielania.

5. Rekonstrukcja obrazów 3D-SIM

1. Z menu Process (Proces) uaktywnij okno SI Reconstruction. Użyj istniejących ustawień dla wszystkich parametrów.
2. Aktywuj przycisk Użyj OTF specyficznego dla kanału i ustaw na Standardowy zestaw filtrów. Aktywuj przycisk Użyj kątów KO specyficznych dla kanału i ustaw na Standardowy zestaw filtrów.
3. Przeciągnij i upuść plik raw (.dv) do przestrzeni pliku wejściowego. Kliknij przycisk Zrób to. Plik wyjściowy będzie miał taką samą nazwę jak plik wejściowy z _SI dodanym na końcu.
   Uwaga: Ten proces rekonstrukcji można uruchomić jako zadanie za pomocą funkcji Konstruktor zadań z menu Proces, jeśli ma zostać przetworzonych wiele plików.

6. Eksport i analiza danych

1. Użyj Imaris do wizualizacji obrazów 3D w trybie przewyższania i eksportowania danych obrazu jako plików tiff (300 dpi) lub avi (bez kompresji). Pomiary rozmiaru w Imaris można wykonać za pomocą narzędzia do pomiarów w trybie przewyższania.
2. Generowanie wykresów intensywności 3D pierścienia Z na podstawie danych obrazu 3D-SIM:
   1. Zbadaj rozkład FtsZ wokół pierścienia Z i utwórz wykresy intensywności 3D
      1. Otwórz plik obrazu 3D, aby wyświetlić poszczególne plasterki Z. Użyj narzędzia przeglądarki woluminów znajdującego się na karcie menu widoku, aby przyciąć interesujący Cię obszar.
      2. Wprowadź numer okna dla tego obrazu 3D w oknie wejściowym i wprowadź nowy i nieużywany numer okna w oknie wyjściowym. Przycisk wyboru regionu stanie się dostępny, aby przyciąć pojedynczy pierścień zainteresowania Z z oryginalnego pola widzenia 40 × 40 μm.
      3. Dostosuj żądaną oś i stopień obrotu w zakładce obrotu. Kliknij przycisk Zrób to. Przewiń wolumin, aby uzyskać żądaną perspektywę pierścienia Z.
      4. Użyj narzędzia Inspektor danych i dostosuj wymiary kolumn/wierszy, aby utworzyć nowy obszar zainteresowania wokół pojedynczego pierścienia Z. Kliknij środek obrazu, aby ustawić ten nowy obszar zainteresowania. Dane obrazu tekstowego są automatycznie generowaną tabelą, która wyświetla intensywność fluorescencji każdego piksela w obszarze zainteresowania.
      5. Kliknij przycisk Wykres 3D, aby początkowo wyświetlić wykres intensywności.
      6. Alternatywnie dane obrazu tekstowego można wyeksportować, klikając przycisk Zapisz dane tabeli w menu pliku.
      7. Skopiuj dane obrazu z zapisanego pliku tekstowego do nowego arkusza kalkulacyjnego. Zaznacz wszystkie komórki w arkuszu kalkulacyjnym i utwórz nowy wykres powierzchni 3D. Sformatuj wykres intensywności 3D do publikacji.
   2. W przypadku danych poklatkowych powtórz kroki 6.2.1.1 - 6.2.1.7 dla każdego z różnych punktów czasowych z pliku obrazu 3D.
3. Śledzenie średniej intensywności fluorescencji w czasie
   1. Użyj danych obrazu tekstowego, aby śledzić intensywność fluorescencji w czasie w obszarze zainteresowania.
   2. Zaznacz komórki, które odpowiadają interesującemu Cię regionowi.
   3. Oblicz średnią intensywność fluorescencji w każdym punkcie czasowym dla tego obszaru zainteresowania.
   4. Użyj średnich wartości intensywności fluorescencji, aby wygenerować osobny wykres liniowy.

Wyniki

W tym badaniu zobrazowaliśmy białko podziału komórek bakteryjnych FtsZ, wyrażone w żywych komórkach jako fuzja FtsZ-GFP, aby zilustrować potężne zalety f3D-SIM w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią fluorescencyjną w badaniu lokalizacji i dynamiki białek bakteryjnych. FtsZ jest białkiem cytoszkieletu podobnym do tubuliny, które polimeryzuje w dynamiczną strukturę pierścieniową na obwodzie komórki. Pierścień Z pełni ważną funkcję w podziale komórki: jego złożenie wyznacza przyszłe miejsce podziału, rekrutuje wszystkie białka podziału komórki do tego miejsca, a zwężenie pierścienia Z wydaje się zapewniać siłę umożliwiającą ruch otoczki komórki do wewnątrz podczas cytokinezy^17,18.

Gdy jest wizualizowany przez konwencjonalną mikroskopię fluorescencyjną o szerokim polu, pierścień Z pojawia się jako pojedyncze poprzeczne pasmo fluorescencji u bakterii w kształcie pręcików, w tym u najlepiej zbadanych organizmów, takich jak B. subtilis (Rysunek 2A), E. coli i C. crescentus. Co ważne, intensywność fluorescencji w całym tym paśmie wydaje się być mniej więcej jednolita, a wzorzec lokalizacji oferuje bardzo mały wgląd w strukturalną organizację i rozmieszczenie polimerów FtsZ w pierścieniu Z. Kiedy jednak te same komórki są badane przy użyciu opisanej tutaj metody f3D-SIM (rysunek 2B), zalety tej techniki są natychmiast widoczne. Po pierwsze, obrót obrazu 3D-SIM wokół osi Z umożliwia wizualizację pierścienia Z jako prawdziwej struktury pierścieniowej w przestrzeni trójwymiarowej (rysunki 2C i 3A). Wraz ze wzrostem rozdzielczości ujawnia to, że rozkład FtsZ w pierścieniu Z jest w rzeczywistości wysoce niejednorodny (rysunek 3). Poprawa rozdzielczości pozwala nam również zobaczyć pierścienie Z, które rozpoczęły proces zwężania się w celu utworzenia przegrody podziałowej (wskazanej przez wgłębienie błony komórkowej na ryc. 2C i 2D).

Dodatkowe przykłady pierścieni Z B. subtilis wizualizowanych tą techniką są pokazane na rysunku 3Bi - 3Biv i ilustrują, że intensywność fluorescencji wokół pierścienia Z nigdy nie jest taka sama. Ponadto często obserwuje się obszary o bardzo niskiej intensywności fluorescencji. Obszary te nazywamy przerwami (białymi grotami strzałek). Przerwy te obserwujemy w 15% wszystkich badanych pierścieni Z (n = 84) i głównie w pierścieniach Z o średnicy 800 - 900 nm (93%). Aby określić ilościowo te obserwacje, utworzono wykresy intensywności 3D pierścienia Z, które są pokazane na rysunkach 3Ci i 3Cii przy użyciu pierścieni Z pokazanych na rysunkach 3Biii i 3Biv. Wykresy intensywności pokazują, że zazwyczaj ilość fluorescencji w pierścieniu Z może zmieniać się do 3 - 4 razy w różnych obszarach pierścienia Z B. subtilis. Co więcej, wykresy intensywności 3D pokazują, że przerwy we fluorescencji wewnątrz pierścienia Z prawie odczytują podstawowe poziomy fluorescencji tła (strzałka na rysunku 3Ci). Powyższe przykłady pokazują dobre rekonstrukcje pierścienia Z i są zależne od wystarczającej ilości światła emitowanego z próbki bez znaczącego fotowybielania. Osiąga się to dzięki jasności fluoroforu GFP połączonego z FtsZ i jego obfitości w komórce w tych warunkach (wysoki stosunek sygnału do szumu). W innych komórkach, w których stosunek sygnału do szumu jest niski, rekonstrukcja obrazu jest słaba. Aby zasymulować to zjawisko za pomocą FtsZ-GFP, ilość sygnału emisyjnego zebranego z komórek B. subtilis została zmniejszona poprzez obniżenie energii wzbudzenia. Jak pokazano na rysunku 3D, 100-krotne zmniejszenie energii wzbudzenia skutkuje obrazem pierścienia Z, który zawiera znaczące artefakty. Dzieje się tak w wyniku niewystarczającego lokalnego kontrastu między sygnałem FtsZ-GFP a tłem, co prowadzi do słabej rekonstrukcji obrazu.

Co ciekawe, pierścienie B. subtilis Z wykazywały wyraźniejsze przerwy i niejednorodność w górnych i dolnych obszarach pierścienia, ale nie po bokach pierścienia (Rysunek 3B). Dzieje się tak ze względu na różnicę w rozdzielczości osiągniętej przez tę odmianę 3D-SIM w płaszczyźnie bocznej w porównaniu z płaszczyzną osiową. Powoduje to, że górne i dolne obszary pierścienia Z (płaszczyzna boczna) są obrazowane z optymalną rozdzielczością. Przerwy w pierścieniu Z są zbyt małe, aby można je było wykryć po bokach pierścienia Z, jak pokazano w płaszczyźnie osiowej, która ma rozdzielczość około połowy rozdzielczości płaszczyzny bocznej. Bakterie o morfologii kokoidalnej, takie jak S. aureus, mają pierścienie Z, które są umieszczone we wszystkich płaszczyznach. Tak więc obrazowanie pierścienia Z, gdy leży on w płaszczyźnie bocznej (lub blisko niej) zapewnia możliwość zobrazowania wszystkich obszarów pierścienia z optymalną rozdzielczością. Korzystając z tego, zbadaliśmy strukturę pierścienia Z w żywych komórkach S. aureus, wykorzystując szczep, który zawiera fuzję ftsZ-gfp zawierającą plazmid. Produkcja tej fuzji jest pod kontrolą promotora indukowanego_{P spac} (patrz krok 1.2.1). Na zdjęciu w płaszczyźnie osiowej, pierścienie Z S. aureus wydawały się identyczne z pierścieniami Z B. subtilis, które są obecne w tej samej płaszczyźnie (ryc. 4Ai). Jednak obrazowanie pierścieni Z w płaszczyźnie bocznej potwierdziło, że cały pierścień Z wyglądał zarówno jak koralik, jak i niejednorodny. Około 26% tych pierścieni wykazało również co najmniej jedną widoczną "przerwę" fluorescencji (Ryc. 4Aii, 4B). Podobnie jak w przypadku B. subtilis FtsZ, wykresy intensywności fluorescencji pokazują, że intensywność fluorescencji w pierścieniu Z zmienia się nawet 4 - 6 razy w różnych obszarach pierścienia Z S. aureus (ryc. 4C).

Długość i szerokość koralików można zmierzyć (patrz schemat na rysunku 4D). Okazało się, że 80% badanych pierścieni Z (n = 43) miało długość koralików 200 nm, osiągając maksymalną długość 400 nm. Z kolei szerokość koralików wynosiła do 200 nm. Na jeden pierścień Z przypadało średnio 12 ± 2 (SEM) koralików FtsZ. Podobne dane lokalizacyjne zaobserwowano, gdy natywny FtsZ został zwizualizowany tymi metodami przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej (IFM), pokazując, że ten niejednorodny i podobny do koralików wzór lokalizacji był autentyczny, a nie artefaktem spowodowanym ekspresją ftsZ-gfp oprócz natywnego FtsZ (dane nie pokazane). Ten postęp 3D-SIM jest w stanie pokazać, że pierścień Z wydaje się być niejednorodną strukturą i może mieć nieciągły charakter.

Aby odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób ta heterogeniczna struktura pierścienia Z ulega zwężeniu i ułatwia podział komórek, można przeprowadzić poklatkową analizę dynamiki pierścienia Z. Jednym z głównych wyzwań związanych z badaniami poklatkowymi w mikroskopii fluorescencyjnej jest minimalizacja fotowybielania próbek i fototoksyczności podczas obrazowania. 3D-SIM wymaga uzyskania dużej liczby surowych obrazów, co oznacza, że fotowybielanie próbki z czasem spowoduje słaby stosunek sygnału do szumu, co doprowadzi do niewystarczającej ilości sygnału, aby umożliwić odpowiednią rekonstrukcję obrazu. Zastosowanie nowej technologii minimalizuje ilość energii wzbudzenia zużywanej na każdą ekspozycję, a tym samym zmniejsza energię docierającą do żywych komórek. Jest to możliwe dzięki połączeniu interferometrii wiązki światła w celu stworzenia strukturalnego wzoru na próbce oraz zastosowaniu naukowych kamer CMOS, które zwiększają czułość i wydajność kwantową. Ta kombinacja powoduje akwizycję z-stack 1 μm na sekundę (512 × 512 pikseli x 8 z-slices) w porównaniu do 1 μm na 5-8 s (512 x 512 pikseli x 8 z-slices) uzyskanej za pomocą naszej poprzedniej iteracji 3D-SIM (opisanej w Riglar et al.²⁶). Skrócenie czasu akwizycji obrazu i ustawień ekspozycji może również pomóc zminimalizować fototoksyczność żywych komórek, co jest szczególnie istotne w badaniach poklatkowych. Zaprezentowana tutaj nowa technologia rozwiązuje również inny problem w obrazowaniu żywych komórek, który nazywamy "rozmyciem ruchu", co w tym kontekście odnosi się do lokalizacji białek zmieniających się podczas akwizycji obrazu. Skracając czas akwizycji obrazu, minimalizuje się stopień "rozmycia ruchu", co zapewnia dokładniejszą rekonstrukcję obrazu.

Poprzednie badania, które dotyczyły sposobu organizacji FtsZ w pierścieniu Z, nie były w stanie pokazać, jak struktura pierścienia Z zmienia się w czasie. Aby zbadać ten aspekt, przeprowadziliśmy time-lapse za pomocą f3D-SIM. Umożliwiło to uzyskanie obrazu 3D-SIM pierścienia Z u B. subtilis co 5-10 sekund przez okres 50 sekund, co wcześniej nie było możliwe w tej skali czasowej. Na rysunku 5A przedstawiono przykład gwałtownych zmian rozkładu FtsZ w obrębie pierścienia Z w czasie (średnica 890 nm). Wykazano również, że inne pierścienie Z, które były w widocznym procesie zwężania, miały podobną dynamikę, która wpływała na rozkład FtsZ wokół pierścienia Z (nie pokazano). Wykresy intensywności 3D mogą być również generowane dla każdego z punktów czasowych w celu ilościowego określenia i docenienia ciągłych zmian intensywności fluorescencji, a tym samym względnej obfitości FtsZ w różnych obszarach pierścienia Z w skali sekundowej (Rysunek 5B). Na tych wykresach intensywności można zidentyfikować obszary zainteresowania, aby śledzić wahania intensywności fluorescencji (ryc. 5C). Śledzenie tych zmian w strukturze pierścienia Z w tych warunkach byłoby praktycznie niemożliwe bez zaawansowanej technologii f3D-SIM. Ponadto prace te ujawniły, że u S. aureus dynamiczny ruch FtsZ jest podobny do obserwowanego u B. subtilis. S. aureus (złocist) Komórki RN4220 wytwarzające FtsZ-GFP obrazowano przez 50 sekund w 10-sekundowych odstępach czasu. Zmiany w niejednorodności pierścienia Z u S. aureus z f3D-SIM były również podobne do B. subtilis (patrz groty strzałek i strzałek na rycinie 6). Te badania poklatkowe wspierają model zwężenia pierścienia Z (iteracyjny model szczypania), który został przewidziany poprzez badanie utrwalonych komórek C. crescentus, ale nie można go było wykazać ze względu na potrzebę zbadania dynamiki pierścienia Z w żywych komórkach²⁷.

Rysunek 1. Schemat konfiguracji optycznej karty f3D-SIM wykorzystanej w tym badaniu. Światło lasera ze stołu laserowego jest kierowane przez światłowód SIM do soczewki kolimacyjnej i stałej siatki, a następnie do modułu kontroli fazy, który tworzy zarówno optymalne odstępy między wiązkami ± 1^{. rzędu dla} określonej długości fali z wiązki centralnej zerowego rzędu, jak i kroki fazowe dla kolekcji SIM. Wiązki następnie wchodzą do modułu sterowania kątem, gdzie wiązki są odbijane do 3 różnych klastrów, aby utworzyć 3 kąty oświetlenia. Wiązki następnie wchodzą do mikroskopu i ścieżki światła, jak pokazano (zmodyfikowano za zgodą Paula Goodwina, API).

Rysunek 2. Porównanie konwencjonalnej fluorescencji szerokokątnej i obrazowania 3D-SIM komórek B. subtilis eksprymujących ftsZ-gfp. (A) Konwencjonalne obrazowanie fluorescencyjne szerokokątne komórek B. subtilis eksprymujących ftsZ-gfp (SU570; zielony) jako pojedynczą kopię również wybarwiono barwnikiem membranowym FM4-64 (czerwony). Podziałka = 5 μm. Obraz uzyskano przy użyciu pionowego mikroskopu fluorescencyjnego. (B) Obrazowanie 3D-SIM tego samego szczepu B. subtilis wykazującego ekspresję ftsZ-gfp, wybarwionego FM4-64. Obszary zainteresowania na obrazie można wybrać (pole przerywane), aby powiększyć. Obraz można również obrócić wokół osi z, aby wyświetlić pierścienie 3D FtsZ w płaszczyźnie osiowej. (C, D) Usunięcie nieostrego światła i poprawa rozdzielczości obrazu zapewniana przez 3D-SIM pozwala na wyraźną wizualizację pierścieni Z (w tym tych, które się zwężają) oraz wewnętrznej błony komórkowej podczas podziału (oznaczonej białymi strzałkami). Zauważ, że tekst protokołu opisuje wizualizację pojedynczego fluoroforu. Procedurę można jednak dostosować do jednoczesnego pozyskiwania do czterech różnych długości fal. Rysunek ten został przedrukowany ze Strauss et al¹⁶.

Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy pierścienia Z w żywych komórkach bakteryjnych w kształcie pręcików (B. subtilis) wykazujących ekspresję FtsZ-GFP przy użyciu 3D-SIM. (Ai) Pierścień Z jest obserwowany jako pasmo fluorescencji prostopadłe do długiej osi komórki, która znajduje się w płaszczyźnie x-y. Panie przewodniczący, panie i panowie! Obraz został obrócony wokół osi Z za pomocą oprogramowania do wizualizacji 3D Imaris (patrz krok 6.1 protokołu), dzięki czemu patrzy się przez strukturę pierścienia, aby wyraźnie zobaczyć, jak FtsZ jest rozłożone w pierścieniu Z. To zdjęcie, teraz w płaszczyźnie z-x pokazuje, że pierścień ma niejednorodny rozkład FtsZ z obszarami o braku lub bardzo małej fluorescencji (białe groty strzałek). Obraz musi zostać obrócony, aby zaobserwować te "przerwy" w obszarach fluorescencji. Bi-Biv pokazuje kolejne przykłady obróconych pierścieni Z, które teraz leżą w płaszczyźnie z-x. Pierścienie Z w (Bi–iii) mają średnicę ~0,9 μm. (Biv) pokazują pierścień Z o średnicy zaledwie 0,65 μm podlegający zwężeniu. (Ci) Ten typowy profil intensywności 3D ilustruje różnice w intensywności fluorescencji (tj. stężeniu) w FtsZ-GFP wokół pierścienia Z o średnicy 0,85 μm (patrz kroki protokołu 6.1-6.3). Poziom fluorescencji w tych przerwach jest niski i zbliża się do poziomów fluorescencji tła (strzałka). (Cii) Podobny profil intensywności 3D pierścienia Z w procesie zwężania. Stężenie FtsZ-GFP jest również niejednorodne; średnica, 0,65 μm. Panele A, B, CI i Cii zostały przedrukowane z Strauss et al¹⁶.

Rysunek 4. Reprezentatywne obrazy 3D-SIM komórek S. aureus wytwarzających FtsZ-GFP. Ponieważ komórki te są okrągłe (ziarniaki), pierścień Z będzie miał różne orientacje. Komórki, które wykazują pasmo fluorescencji w normalnej orientacji oglądania (czyli w płaszczyźnie x-y), jak pokazano na (Ai), wyglądają bardzo podobnie do tych w komórkach w kształcie pręta, gdy są obrócone wokół osi Z, jak na rysunku 1Ai. W (Aii) pierścień Z znajduje się już w płaszczyźnie x-y; orientacja boczna i rozdzielczość jest maksymalna na całym pierścieniu, co daje teraz strukturę przypominającą koralik (B). (C) Wykres intensywności 3D względnej obfitości FtsZ-GFP w pierścieniu Z. (D) Schematyczne przedstawienie pierścienia Z S. aureus. Czerwone strzałki wskazują wymiary długości i szerokości ściegu (patrz krok 6.1 protokołu). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Straussa i wsp. ¹⁶.

Rysunek 5. f3D-SIM umożliwia szybką analizę lokalizacji FtsZ w czasie w 3D-SIM. (A) Zmiany w rozmieszczeniu FtsZ-GFP w pierścieniu Z w komórkach B. subtilis w kształcie pręcików można zwizualizować, aby wskazać dynamikę pierścienia. Czas (s) jest wskazany w lewym górnym rogu każdego obrazu. (B) Wykresy intensywności fluorescencji 3D pokazują niejednorodny i dynamiczny rozkład FtsZ w pierścieniu Z. (C) Dynamika FtsZ (zmiany fluorescencji FtsZ-GFP w pierścieniu) może być również zbadana bardziej szczegółowo, poprzez ilościowe określenie intensywności fluorescencji w czasie w dwóch obszarach zainteresowania. Rysunek ten został przedrukowany ze Strauss et al¹⁶.

Rysunek 6. Zdjęcia poklatkowe f3D-SIM pokazują zmiany w lokalizacji FtsZ w pierścieniu w czasie u S. aureus. Biały grot strzałki wskazuje przerwę, gdy zostanie ona początkowo wykryta w pierścieniu Z. Pojawianie się i znikanie przerw w tym samym miejscu (oznaczonym białym grotem strzałki) w czasie ilustruje, w jaki sposób FtsZ jest redystrybuowane wokół pierścienia Z. Białe strzałki wskazują na powstawanie przerw w pierścieniu Z w późniejszych punktach czasowych. Czas (s) jest pokazany w lewym górnym rogu obrazów. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Straussa i wsp. ¹⁶.

Dyskusja

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek jest potężnym narzędziem, które umożliwia obserwację dynamicznych zmian w komórkach w czasie. Obrazowanie biologii komórek bakteryjnych na żywo było wyzwaniem ze względu na mały rozmiar komórek i zmniejszoną zdolność komórek bakteryjnych do wytrzymywania powtarzającej się ekspozycji na światło wzbudzające. f3D-SIM rozszerzył dostępne narzędzia do badania całej biologii komórki, ale konieczne jest staranne wykonanie tej techniki, ponieważ artefakty mogą zostać wprowadzone, jeśli zostaną źle zaimplementowane. Istnieje kilka ważnych czynników wpływających na pomyślne zastosowanie tej techniki. Ponieważ jest to metoda obrazowania fluorescencyjnego o szerokim polu, która opiera się na wykorzystaniu funkcji punktowego rozproszenia emitowanego światła, należy unikać niedopasowania współczynnika załamania światła i aberracji sferycznej emitowanego światła, aby umożliwić dokładną rekonstrukcję obrazu. Zdecydowanie zaleca się stosowanie szkiełek nakrywkowych o grubości 0,17 mm wysokiej jakości, aby uniknąć zmian intensywności sygnału spowodowanych zmiennością grubości szkła w szkiełku nakrywkowym. Niezwykle ważne jest, aby dokładnie ocenić aberrację sferyczną emitowanego światła podczas początkowych etapów wszystkich eksperymentów i w razie potrzeby dostosować współczynnik załamania światła olejku immersyjnego. Może się to różnić z dnia na dzień, ponieważ zależy zarówno od temperatury, jak i nośnika montażowego/podłoża próbki. Użycie niewłaściwego oleju spowoduje gorszą rekonstrukcję obrazów z artefaktami, takimi jak aureole i sygnały echa.

Pod koniec procesu rekonstrukcji obrazu, dla każdej fazy, można uzyskać miarę jakości rekonstrukcji za pomocą "najlepszego dopasowania dla kąta kO" dla każdej fazy/kąta oświetlenia. Jeśli wartość ta jest mniejsza niż 1 dla każdego kąta, to jakość rekonstrukcji najprawdopodobniej będzie wysoka. Jeśli ta wartość jest wyższa niż 6, najprawdopodobniej zrekonstruowany obraz będzie zawierał artefakty. Typowe artefakty obejmują i) pojawienie się pasków na obrazie, które odpowiadają jednemu z kątów siatki. Może to wynikać z niższego sygnału z tego kąta siatki; ii) Aureola wokół konstrukcji. Może to wynikać z bardzo nierównych poziomów sygnału z jasnych struktur w porównaniu z otaczającymi strukturami, niedopasowania współczynnika załamania światła oleju i próbki lub może wynikać z tego, że struktury na obrazie są zbyt amorficzne i nie zawierają wystarczającej ilości "struktury", aby mogły zostać rozpoznane przez algorytm; (iii) "plaster miodu", który wynika z niskiego stosunku sygnału do szumu na obrazie, zwykle z powodu wysokiego sygnału tła; iv) struktury, które są rozciągnięte/wydłużone w XY, co może być spowodowane niedopasowaniem współczynnika załamania światła oleju i próbki. Ten artefakt jest trudny do rozpoznania dla niedoświadczonego użytkownika. Zaleca się, aby nowi użytkownicy skonsultowali się z doświadczonym badaczem SIM w celu uzyskania porady na temat interpretacji i analizy obrazu przed rozpoczęciem korzystania z tej techniki.

Podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów z obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek, ważne jest, aby starannie zrównoważyć wejściową energię wzbudzenia, aby zminimalizować stopień fotowybielania i fototoksyczności komórek z wystarczającym sygnałem emisyjnym potrzebnym do rekonstrukcji obrazów przy minimalnym artefaktach. Nadmierne fotowybielanie (większe niż 30% w pojedynczej akwizycji z-stack) doprowadzi do powstania pasków na zrekonstruowanym obrazie. Dzięki zastosowaniu kamer sCMOS można z powodzeniem zrekonstruować obrazy o wysokiej rozdzielczości z obrazów surowych z sygnałem emisyjnym już od 1000 zliczeń nad tłem. Może to pozwolić na bardzo krótkie czasy naświetlania, zmniejszając w ten sposób fotowybielanie i umożliwiając szybkie uchwycenie każdej klatki. Zwiększa również ilość czasu między klatkami, w którym komórki mogą odzyskać siły po wprowadzeniu energii wzbudzenia. Dodatkowo, ze względu na to, że czas przechwytywania każdej pojedynczej klatki może być bardzo krótki, stopień artefaktu wprowadzanego przez "rozmycie ruchu" podczas pojedynczego przechwytywania jest zmniejszony przy użyciu tej metody.

Ta odmiana 3D-SIM oferuje szereg innych zalet w porównaniu z innymi dostępnymi technologiami obrazowania w super- i wysokiej rozdzielczości do obrazowania na żywo przez biologów komórek bakteryjnych. 2-krotny wzrost rozdzielczości we wszystkich 3 wymiarach oraz możliwość obrazowania do 30 μm w próbce umożliwia obrazowanie całych komórek bakteryjnych (i ssaków) podczas eksperymentu. Techniki takie jak lokalizacja pojedynczych cząsteczek, które są powszechnie wykonywane w fali ulotnej, nie mogą osiągnąć głębokości penetracji próbki i nie dostarczają informacji o całych komórkach. Najnowsze osiągnięcia, które pozwalają na większe głębokości próbkowania dla tej techniki, mogą skutkować lepszą rozdzielczością osiową całych komórek. Ponadto techniki lokalizacji pojedynczych cząsteczek, które wymagają uzyskania tysięcy surowych obrazów, są również ograniczone pod względem liczby klatek na sekundę, które można przechwycić, i mogą wymagać kompromisu między liczbą klatek na sekundę przechwytywania a ostateczną osiągniętą rozdzielczością przestrzenną, ponieważ rozdzielczość przestrzenna zależy od liczby zdarzeń zarejestrowanych w zdefiniowanej przestrzeni. Zmniejszenie liczby przechwyconych klatek spowoduje niższą rozdzielczość przestrzenną, ale może być wystarczające do osiągnięcia rozdzielczości czasowej wymaganej dla procesu biologicznego będącego przedmiotem zainteresowania. Wydłużenie czasu odzyskiwania między klatkami może być również konieczne w celu zminimalizowania fototoksyczności w żywych komórkach, ograniczając w ten sposób czas trwania i częstotliwość, z jaką można uzyskać szeregi czasowe. Techniki wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia elektronowa (EM) lub kriotomografia elektronowa (ECT), oferują zwiększoną rozdzielczość w porównaniu z 3D-SIM (i innymi technikami mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości), ale muszą być wykonywane na utrwalonych próbkach. Utrwalanie i przetwarzanie może wprowadzać artefakty, a brak oznakowania może utrudniać interpretację. Elektrowstrząsy bezznacznikowe mają słaby kontrast i mogą osiągnąć głębokość penetracji próbki około 500-200 nm²⁴, więc nawet jeśli można zidentyfikować białko będące przedmiotem zainteresowania, nie można zaobserwować struktury białka w całej komórce bakteryjnej. Nawet jeśli znakowanie może być stosowane w EM, na przykład za pomocą immunogold, obrazowanie jest wykonywane tylko w 2D. 3D jest możliwe do osiągnięcia tylko przy cienkich przekrojach i komputerowej rekonstrukcji skrawków. Cienkie cięcie wymaga doświadczonego technika, ale może być problematyczne i prowadzić do artefaktów. W przypadku komórek aktywnych lub stacjonarnych karta 3D-SIM nie musi być osadzona w określony sposób, a komórki mogą być szybko przygotowane do obrazowania w stanie zbliżonym do natywnego.

Metoda ta jest stosunkowo łatwa do wdrożenia przez badaczy z minimalnym doświadczeniem w mikroskopii fluorescencyjnej. Eksperymenty można przeprowadzać w pożywkach, które wspierają zdrowe funkcjonowanie komórek, o ile nie fluoryzują ani nie generują nadmiernego sygnału tła. W przypadku komórek bakteryjnych może to pozwolić na stosowanie wielu rodzajów złożonych i minimalnych pożywek lub stosowanie pożywek stałych lub półstałych do kontrolowania ruchliwości komórek bakteryjnych. Wielu biologów, którzy już zaprojektowali fuzje białek fluorescencyjnych (FP) i przetestowali funkcjonalność tych fuzji, może szybko wdrożyć tę technologię bez dalszej inżynierii i walidacji dzięki nowym fotoaktywowalnym fuzjom FP. Stwierdziliśmy, jako ogólną obserwację, że S. aureus był bardziej podatny na fotowybielanie podczas obrazowania z fuzjami FP niż B. subtilis. Korzystając z naszych oryginalnych metod 3D-SIM, w których wzór siatki był generowany przez fizyczną siatkę, nie byliśmy w stanie przeprowadzić obrazowania żywych komórek z wieloma fuzjami FP S. aureus . Jednak dzięki tej zaawansowanej metodzie f3D-SIM byliśmy w stanie zobrazować te fuzje FP i wykonać krótkie szeregi czasowe, aby uchwycić dynamikę tych znakowanych białek. Jest to najprawdopodobniej spowodowane skróconym czasem naświetlania potrzebnym do obrazowania i wydłużonym czasem między klatkami w celu odzyskania komórek.

OMX Blaze 3D-SIM to dostępna na rynku technologia, którą można stosunkowo łatwo wdrożyć w jednym laboratorium lub głównym zakładzie obrazowania. Należy zachować ostrożność podczas wykonywania tej techniki, aby uniknąć artefaktów spowodowanych złym przygotowaniem próbki lub słabym uchwyceniem obrazu. Po opanowaniu tej techniki można przeprowadzić badania struktury i dynamiki białek w małych organizmach, takich jak bakterie, w fluorescencji jedno- lub wielokolorowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza I (klasa biotecnologiczna)	AMRESCO	0710-500G	Służy do budowy 2% wafor agarozowych. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę w pożywkach wzrostowych.
Dibromek N-(3-trietyloamoniopropylo)-4-(6-(4-(dietyloamino)fenylo)heksatrienylo)pirydyny dibromek (FM 4-64)	Life Technologies	T-13320	Barwnik lipofilowy stosowany do barwienia błon komórkowych.
Mikroprobówka 1,5 ml, z dyplomem	Specjalności Przyrodnicze Inc.	1210-00	Wykonany z homopolimeru polipropylenu, używany do zbierania komórek bakteryjnych przed umieszczeniem ich na podkładkach agarozowych w celu wizualizacji.
Baza bulionowa Luria, Miller	BD	241420	Przygotowana zgodnie z instrukcją producenta. Dodaj 2% agarozy po autoklawowaniu.
BBL Bulion do oznaczania antybiotyków, Pożywka antybiotykowa 3	BD	210932	Przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta.
Ramka samoprzylepna	Thermo-Fisher Scientific	ABGAB-0577	Znana jako Gene Frame z tą firmą. Służy do przygotowania płatków agarozowych 2% (Wymiary: 15 x 16 mm).
Szkło pokrywy mikroskopu	Thermo-Fisher Scientific	111512-9	22 x 22 Nr 1 Grubość
Średnica 35 mm Szalka Petriego ze szklanym dnem szkiełka nakrywkowego	Światowe instrumenty precyzyjne	FD35-100	Znany jako FluoroDish z tą firmą. Danie: Ø 35 mm, Szkło: Ø 23 mm, Grubość szkła: 0,17 mm, niepirogenny
Chloramfenikol	Sigma-Aldrich	C0378-25G	Przygotuj 10 mg/ml zapasu w 95% etanolu.
Chlorowodorek linkomycyny	Sigma	L6004-5MU	Przygotować zapas 25 mg/ml w 50% etanolu.
Erytromycyna	Boehringer Mannheim GmbH	12390120-14	Przygotuj zapas 10 mg/ml w 95% etanolu.
Połączona orbitalno-liniowa kąpiel wodna z wytrząsaniem	Grant scientific Instruments	OLS-200	Prędkość wytrząsania stosowana do hodowli: spektrofotometr UV widzialny 215 obr./min
	Shimadzu	UV-1601	długości fali 600 nm został użyty do pomiaru gęstości optycznej kultur bakteryjnych.
Wirówka	Eppendorf	5415R	Granulki kultur bakteryjnych uzyskano poprzez odwirowanie średnio rosnących kultur z prędkością 8 000 obr./min przez 30 sekund.
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	Sigma	15502-10G	Przed użyciem przygotować 1 M wywar i przefiltrować sterylizację.
oprogramowanie softWoRx	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company	wersja 5.0
Oprogramowanie do analizy danych Imaris	Bitplane Scientific Software, Bitplane AG	wersja 7.0.0	Matlab XTensions zawierało
system obrazowania DeltaVision OMX 3D-SIM wyposażony w moduł Blaze.	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company		Moduł Blaze zamontowany w OMX V3
Pionowy mikroskop fluorescencyjny	Zeiss Axioplan 2