Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Podsumowanie

Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Streszczenie

Ostre uszkodzenie płuc (ALI) jest ciężką chorobą charakteryzującą się neutrofilią pęcherzyków płucnych, z ograniczonymi możliwościami leczenia i wysoką śmiertelnością. Eksperymentalne modele ALI mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy chorób. Lipopolisacharyd (LPS) pochodzący z bakterii Gram-dodatnich indukuje neutrofilowe zapalenie w drogach oddechowych i miąższu płuc myszy. Skuteczne dostarczanie do płuc związków, takich jak LPS, jest jednak trudne do osiągnięcia. W opisanym tutaj podejściu dostarczanie płucne u myszy uzyskuje się poprzez prowokację do aerozolowego Pseudomonas aeruginosa LPS. Rozpuszczony LPS był aerozolowany za pomocą nebulizatora podłączonego do sprężonego powietrza. Myszy były wystawione na ciągły przepływ aerozolu LPS w pudełku z pleksiglasu przez 10 minut, a następnie kondycjonowanie przez 2 minuty po odstawieniu aerozolu. Następnie przeprowadzono intubację tchawicy, a następnie płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, a następnie perfuzję formaliny, co pozwala na scharakteryzowanie jałowego zapalenia płuc. Aerozol LPS generuje zapalenie płuc charakteryzujące się neutrofilią pęcherzykową, wykrywaną w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych i ocenie histologicznej. Technikę tę można skonfigurować niewielkim kosztem przy użyciu kilku urządzeń i wymaga minimalnego szkolenia i wiedzy. System ekspozycji może być zatem rutynowo wykonywany w dowolnym laboratorium, co może przyczynić się do lepszego zrozumienia patologii płuc.

Wprowadzenie

Lipopolisacharyd (LPS) jest składnikiem ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych¹. Wyzwanie dla LPS to dobrze udokumentowany model ostrego uszkodzenia płuc, zespołu charakteryzującego się ostrym zapaleniem neutrofilowym i obrzękiem². Ponadto neutrofilia płucna jest również cechą charakterystyczną przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP)³, a prowokacja LPS u ludzi została wykorzystana do modelowania zaostrzeń^{POChP 4}. W związku z tym eksperymentalne modele ekspozycji na LPS są klinicznie istotnymi i cennymi narzędziami do zrozumienia patologii człowieka.

Celem opisanego tutaj dostarczania LPS w....

Protokół

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. dobrostanu zwierząt w północnym Sztokholmie. Procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z prawem szwedzkim.

1. Generowanie aerozolu LPS

1. Rozpuścić 0,5 g oczyszczonego LPS P. aeruginosa w 50 ml sterylnej soli fizjologicznej przy delikatnym mieszaniu i zweryfikować stopień rozpuszczenia. Rozcieńczyć 1 ml rozpuszczonego LPS w 9 ml sterylnej soli fizjologicznej do końcowego stężenia 1 mg/ml. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Odmrozić rozpuszczony LPS w ciemności w temperaturze pok....

Wyniki

Wywołanie reakcji na aerozolowe LPS P. aeruginosa zazwyczaj skutkuje wyraźną odpowiedzią zapalną w świetle dróg oddechowych i przestrzeni pęcherzyków płucnych, charakteryzującą się przewagą neutrofili zarówno we wczesnych, jak i późnych punktach czasowych.

Aerozolowy LPS indukuje neutrofilię płucną

Myszy szczepów C57BL/6by i BALB/c poddano działaniu aerozolu z LPS P. aeruginosa lub samego nośnika, a następnie oznaczono liczbę neutrofili w BALF. Całko.......

Dyskusja

Aerozol LPS generuje reakcję zapalną w drogach oddechowych, charakteryzującą się neutrofilami w błonie podśluzowej nabłonka, przestrzeniach otaczających przewodzące drogi oddechowe, a także przestrzeniach pęcherzykowych. Jest to, wraz ze zwiększoną całkowitą zawartością białka w BALF, wskazującą na wyciek osocza, reprezentatywną dla patologii ostrego uszkodzenia płuc. Ponieważ LPS wywołuje jałowe zapalenie, reakcja jest niezależna od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i istnieją ograniczenia co do znaczenia infekcji.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oczyszczony Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Szkodliwy. Zalecane oczyszczanie. Można stosować LPS oczyszczone z innych bakterii.
Nebulizator Pari LC sprint star	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
Przepływomierz masowy TSI 4040	TSI	4040	Można stosować produkt alternatywny od innego dostawcy.
Wężyk Tygon 15.9 mm Saint-Gobain	Sigma-Aldrich	Z685704	Zalecana marka.
Pudełka z pleksiglasu z wyjmowanymi pokrywami	Wykonane na zamówienie	N/A	150 x 163 x 205 mm (otwór 2 mm z boku).
Maska wielorazowa 3M Half Facepiece	3M	7503	Zalecana marka.
Zaawansowane filtry cząsteczkowe (P100) 3M	3M	2291	Zalecana marka.
Nożyczki	VWR	233-1104	Można stosować preferowane nożyczki.
Pinceta	VWR	232-1313	Można stosować preferowaną pincetę.
Wężyk polietylenowy Intramedic PE50	BD	427411	Zalecana marka.
Nić jedwabna Ethicon 2-0 Perma-hand	VWR	95056-992	Zalecana marka.
Igła G 26 ½			Istnieją alternatywni dostawcy.
Strzykawka 1 ml BD z końcówką typu slip-tip, niesterylna	BD	301205	Istnieją alternatywni dostawcy.
Strzykawka 60 ml BD Luer-Lok, niesterylna, polipropylenowa	BD	301035	Istnieją alternatywni dostawcy.
Hematoksylina i eozyna Fluka	Sigma-Aldrich	3972	Istnieją alternatywni dostawcy.
Roztwór Türka	Merck Millipore	109277
Wirówka nakładkowa			Istnieją alternatywni producenci.
Cytowirówka Cytospin 4	Thermo Scientific	A78300003	Można stosować alternatywną wirówkę.
Zestaw barwiący HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Istnieją alternatywne zestawy barwiące.
Formalina, neutralnie buforowana, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Istnieją alternatywni dostawcy.