Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Podsumowanie

Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Streszczenie

Ostre uszkodzenie płuc (ALI) jest ciężką chorobą charakteryzującą się neutrofilią pęcherzyków płucnych, z ograniczonymi możliwościami leczenia i wysoką śmiertelnością. Eksperymentalne modele ALI mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy chorób. Lipopolisacharyd (LPS) pochodzący z bakterii Gram-dodatnich indukuje neutrofilowe zapalenie w drogach oddechowych i miąższu płuc myszy. Skuteczne dostarczanie do płuc związków, takich jak LPS, jest jednak trudne do osiągnięcia. W opisanym tutaj podejściu dostarczanie płucne u myszy uzyskuje się poprzez prowokację do aerozolowego Pseudomonas aeruginosa LPS. Rozpuszczony LPS był aerozolowany za pomocą nebulizatora podłączonego do sprężonego powietrza. Myszy były wystawione na ciągły przepływ aerozolu LPS w pudełku z pleksiglasu przez 10 minut, a następnie kondycjonowanie przez 2 minuty po odstawieniu aerozolu. Następnie przeprowadzono intubację tchawicy, a następnie płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, a następnie perfuzję formaliny, co pozwala na scharakteryzowanie jałowego zapalenia płuc. Aerozol LPS generuje zapalenie płuc charakteryzujące się neutrofilią pęcherzykową, wykrywaną w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych i ocenie histologicznej. Technikę tę można skonfigurować niewielkim kosztem przy użyciu kilku urządzeń i wymaga minimalnego szkolenia i wiedzy. System ekspozycji może być zatem rutynowo wykonywany w dowolnym laboratorium, co może przyczynić się do lepszego zrozumienia patologii płuc.

Wprowadzenie

Lipopolisacharyd (LPS) jest składnikiem ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych¹. Wyzwanie dla LPS to dobrze udokumentowany model ostrego uszkodzenia płuc, zespołu charakteryzującego się ostrym zapaleniem neutrofilowym i obrzękiem². Ponadto neutrofilia płucna jest również cechą charakterystyczną przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP)³, a prowokacja LPS u ludzi została wykorzystana do modelowania zaostrzeń^{POChP 4}. W związku z tym eksperymentalne modele ekspozycji na LPS są klinicznie istotnymi i cennymi narzędziami do zrozumienia patologii człowieka.

Celem opisanego tutaj dostarczania LPS w aerozolu do płuc jest wywołanie neutrofilowej odpowiedzi zapalnej w przewodzących i oddechowych drogach oddechowych, bez udziału całego organizmu. Kilka technik wyzwania LPS zostało opisanych wcześniej. Wstrzyknięcie dożylne LPS jest najczęściej stosowaną drogą podawania. Chociaż ta technika jest łatwo dostępna, pierwotne uszkodzenie dotyczy śródbłonka, z wtórnym zniszczeniem nabłonka płucnego w wyniku migracji neutrofili do płuc. Podanie dożylne wywołuje również ogólnoustrojowe zapalenie², co może komplikować obraz kliniczny w modelach zwierzęcych. Zapalenie ogólnoustrojowe nie jest natomiast obserwowane w przypadku podawania dotchawniczego. Technika ta jest jednak pracochłonna i wymaga znieczulenia, a także znacznego treningu ^5,6 . Ponadto odkładanie się w płucach tą drogą podania jest zależne od oddychania⁷. W związku z tym na osadzanie w płucach ma wpływ głębokość znieczulenia potrzebnego do podania dotchawiczego i można zaobserwować zmienne osadzanie w drogach oddechowych. W przeciwieństwie do tego, poród płucny za pomocą LPS w aerozolu wymaga minimalnego przeszkolenia i można go łatwo przeprowadzić na dużej liczbie zwierząt z niewielkimi lub żadnymi różnicami między osobnikami ^5,8 . Niedawne badanie potwierdza, że dostarczanie aerozolu jest lepsze niż droga dotchawicza w odniesieniu do osadzania się oraz że bardziej odpowiednie dawki LPS wywołują zapalenie neutrofilowe w tym modelu⁸.

Poprzednie badania wykazały, że prowokacja do aerozolowanego Psuedomonas aeruginosa LPS generuje wyraźną reakcję zapalną w świetle dróg oddechowych i miąższu płucnym, w tym w przestrzeniach pęcherzykowych ^9,10. Stan zapalny charakteryzuje się przewagą neutrofili i obecnością obrzęku płuc, a zatem może być stosowany do zwalczania patogenezy ostrego uszkodzenia płuc i uzyskania dalszej wiedzy na temat mechanizmów przyczyniających się do patologii choroby.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. dobrostanu zwierząt w północnym Sztokholmie. Procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie ze szwedzkim prawem.

1. Generowanie aerozolu LPS

1. Rozpuścić 0,5 g oczyszczonego P. aeruginosa LPS w 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej z delikatnym mieszaniem i sprawdzić rozpuszczenie. Rozcieńczyć 1 ml rozpuszczonego LPS w 9 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do końcowego stężenia 1 mg/ml. Chronić przed światłem folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Rozmrozić rozpuszczony LPS w ciemności w temperaturze pokojowej i dobrze wymieszać bezpośrednio przed użyciem.
3. W wentylowanym okapie chroniącym przed zagrożeniem biologicznym poziomu II włożyć czerwony wlot do nebulizatora i podłączyć nebulizator do sprężonego powietrza w pomieszczeniu za pomocą rurki dostarczonej przez producenta (schemat przeglądowy przedstawiający urządzenia eksperymentalne na rysunku 1).
   UWAGA: w trakcie narażenia należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym półmaski oddechowej wielokrotnego użytku z filtrami cząstek stałych, okularów, rękawic i odzieży ochronnej.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie urządzeń doświadczalnych służących do wytwarzania aerozolu. Wlot nebulizatora jest podłączony do dopływu powietrza. Wylot nebulizatora jest najpierw podłączony do przepływomierza za pomocą rurki 15,9 mm i filtra powietrza, a dopływ powietrza jest regulowany na 5,0 l/m przy ciśnieniu 2 kbar. Wylot jest następnie podłączony do skrzynki z pleksiglasu wyposażonej w zdejmowane pokrywy i otwory 5 mm, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia.

4. Podłączyć wylot nebulizatora do przepływomierza masowego za pomocą filtra powietrza. Podłącz przepływomierz masowy do źródła zasilania.
5. Wyreguluj dopływ powietrza na 5 l/min, przy ciśnieniu pozostającym na poziomie 1,0-2,0 bar.
6. Wyjąć przepływomierz masowy i odłączyć dopływ powietrza.
7. Podłącz wylot nebulizatora do rurki 15,9 mm, która rozdziela się i łączy z dwoma pudełkami z pleksiglasu o wymiarach: 150 x 163 x 205 mm, wyposażonymi w zdejmowane pokrywy. Każda skrzynka powinna mieć otwór o średnicy 5 mm po stronie przeciwnej do wlotu, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia.
8. Umieść do 5 myszy w każdym pudełku z pleksiglasu i zamknij pokrywki.
9. Otworzyć nebulizator i napełnić wkładkę co najmniej 4 ml LPS rozpuszczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub samym nośniku (jałowy roztwór soli fizjologicznej; objętość nie powinna przekraczać 8 ml). Ponownie podłącz wlot do dopływu powietrza.
10. Pozwól, aby aerozol spłynął do zamkniętych pojemników z pleksiglasu przez 10 minut. Stale monitoruj zwierzęta. Upewnij się, że dopływ powietrza pozostaje szczelnie przymocowany do wlotu nebulizatora.
11. Odłączyć dopływ powietrza. Przy zamkniętych pokrywach pozwól zwierzętom pozostać w pudełkach z pleksiglasu przez 2 minuty.
12. Otwórz pokrywki i pozwól, aż aerozol się rozproszy, a następnie włóż zwierzęta z powrotem do klatek. Jeśli zwierzęta wydają się mokre, umieść klatki na poduszce grzewczej ustawionej na niskie ciepło, aby zapobiec hipotermii.
13. Zwierzęta należy monitorować w sposób ciągły przez pierwsze 30 minut, a następnie co 2 godziny przez pierwsze 6 godzin. Zwierzęta powinny wykazywać normalny wzorzec oddechowy i aktywność w trakcie i po zabiegu nebulizacji.

2. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL)

1. W punkcie końcowym eksperymentu głęboko znieczulij zwierzęta izofluranem, aby uzyskać efekt zgodny z zaleceniami personelu weterynaryjnego Twojej instytucji. Uszczypnij tylną łapę, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu wycofania, aby zapewnić wystarczającą głębokość znieczulenia do przeprowadzenia poważnej operacji. Spryskaj sierść zwierząt 70% etanolem.
2. Otwórz brzuch za pomocą nożyczek i odetnij aortę, aby wykrwawić zwierzę. Umieść kawałek tkanki na brzuchu, aby wchłonąć krew.
3. Po eutanazji użyj pojedynczego przednio-tylnego cięcia nożyczek, aby odsłonić klatkę piersiową. Podnieś klatkę piersiową za przedni koniec mostka i użyj nożyczek, aby przebić przeponę w najbardziej brzusznym punkcie, nie wcinając się w żaden płat płucny. Otwórz klatkę piersiową, wykonując dwa nacięcia w kierunku przednio-tylnym (spotykając się poniżej szczęki).
4. Delikatnie rozsuń klatkę piersiową za pomocą kleszczy i przetnij tchawicę poniżej krtani.
5. Podnieś tchawicę kleszczami i usuń płuca, przecinając więzadła łączące płaty z jamą piersiową i delikatnie ciągnąc za tkankę tłuszczową i sercową.
6. Włóż rurkę polietylenową (średnica wewnętrzna: 0,58 mm; średnica zewnętrzna: 0,965 mm) do tchawicy i zabezpiecz rurkę sznurkiem jedwabnej nici.
7. Zwiąż wielopłatek (cztery płaty prawego płuca) jedwabną nicią.
8. Wprowadzić igłę o rozmiarze 23 do rurki polietylenowej i powoli wstrzyknąć 250 μl lodowatego sterylnego PBS do pojedynczego płatka za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
9. Ostrożnie postukać w płuca 30 razy i zebrać płyn przez strzykawkę. Powtórzyć procedurę z 200 μl PBS (około 300 μl PBS powinno zostać odzyskane z pojedynczego płata z całkowitej objętości wstrzykniętej 450 μl).
10. Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) należy przechowywać na lodzie lub natychmiast zliczyć komórki BAL. Policz komórki za pomocą hemocytometru, używając roztworu Turka do wybarwienia komórek¹¹. Obliczyć całkowitą liczbę komórek, mnożąc liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia roztworu barwiącego i objętość w zliczonym polu hemocytometru.
11. Przygotować różnicową liczbę komórek z komórek cytowirowanych, jak opisano w innym miejscu¹¹.

3. Utrwalanie tkanki płucnej w formalinie do oceny histologicznej

1. Wyjmij wielopłatek i zatrzaskowo zamroź na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Zamontować strzykawkę o pojemności 60 ml z wyjętym tłokiem na metalowym stojaku. Napełnij strzykawkę 10% formaliną do wysokości 20 cm nad stołem laboratoryjnym, co odpowiada 20 cm stałego ciśnienia.
3. Podłączyć igłę o rozmiarze 23 przymocowaną do tchawicy do strzykawki o pojemności 60 ml za pomocą plastikowej rurki z zaworem do kontrolowania przepływu formaliny.
4. Napełnić płat płuca formaliną przez 5 minut. Odłączyć igłę i wyjąć ją wraz z rurką polietylenową z tchawicy, jednocześnie ciągnąc za jedwabną nić, aby zamknąć tchawicę i utrzymać ciśnienie w płucach.
5. Zanurzyć płat płuca w formalinie i utrwalić na 24 godziny w temperaturze 4 °C.
6. Umyj utrwaloną tkankę trzy razy przez co najmniej 20 minut 70% etanolem i odwodnij do ksylenu według następującego schematu (po 1 godzinie):
   • 3x 70% etanol
   • 3x 95% etanol
   • 3x 100% etanol
   • 3x ksylen
   • 1x (płynna) parafina
7. Zanurz odwodnioną tkankę w parafinie, pokrój na odcinki 4-5 μm i wybarwij hematoksyliną i eozyną, aby umożliwić ocenę histologiczną.

Wyniki

Wyzwanie dla aerozolowanego P. aeruginosa LPS zwykle powoduje wyraźną reakcję zapalną w świetle dróg oddechowych i przestrzeni pęcherzykowej, charakteryzującą się przewagą neutrofili zarówno we wczesnym, jak i późnym punkcie czasowym.

Aerozolowy LPS wywołuje neutrofilię płucną

myszy C57BL/6by i BALB/c były wystawione na działanie aerozolu P. aeruginosa LPS lub samego nośnika, a neutrofile zostały wyliczone w BALF. Całkowita liczba komórek w BALF myszy...

Dyskusja

Aerozol LPS generuje reakcję zapalną w drogach oddechowych, charakteryzującą się neutrofilami w błonie podśluzowej nabłonka, przestrzeniach otaczających przewodzące drogi oddechowe, a także przestrzeniach pęcherzykowych. Jest to, wraz ze zwiększoną całkowitą zawartością białka w BALF, wskazującą na wyciek osocza, reprezentatywną dla patologii ostrego uszkodzenia płuc. Ponieważ LPS wywołuje jałowe zapalenie, reakcja jest niezależna od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i istnieją ograniczenia co do znaczenia infekcji...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oczyszczony Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Szkodliwy. Zalecane oczyszczanie. Można stosować LPS oczyszczony z innych bakterii.
Nebulizator gwiazdowy Pari LC sprint	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
TSI przepływomierz masowy 4040	TSI	4040	Można zastosować alternatywny produkt od dostawcy.
Rurka Saint-Gobain 15,9 mm Tygon	Sigma-Aldrich	Z685704	marki Recomended.
Pudełka z pleksiglasu ze zdejmowanymi pokrywami	Wykonane na zamówienie	Nie dotyczy	150 x 163 x 205 mm (otwór 2 mm z boku).
Półmaska oddechowa wielokrotnego użytku	3M 3M	7503	Recomended marki.
Zaawansowane filtry cząstek stałych 3M (P100)	Marka 3M	2291	Recomended.
Nożyczki	VWR	233-1104	Można używać preferowanych nożyczek.
Kleszcze	VWR	232-1313	Można stosować preferowane kleszcze.
Tuba polietylenowa Intramedic PE50	BD	427411	marki Recomended.
Bieżnik Ethicon 2-0 Perma-hand silk	VWR	95056-992	Recomended marki.
26 ½ igła pomiarowa			Istnieją alternatywni dostawcy.
Strzykawka 1 ml BD z końcówką ślizgową, niesterylna	BD	301205	Istnieją alternatywni dostawcy.
Strzykawka 60 ml BD Luer-Lok, niejałowa, polipropylen	BD	301035	Istnieją alternatywni dostawcy.
Fluka Hematoxylin-Eosin	Sigma-Aldrich	3972	Istnieją alternatywni dostawcy.
Tü Rozwiązanie rk	Merck Millipore	109277
Wirówka			Istnieją alternatywni producenci.
Można zastosować wirówkę cytospin 4	Thermo Scientific	A78300003	Alternative wirówka.
Pakiet statystyk HEMA-3	Fisher Scientific	23-123-869	Istnieją alternatywne zestawy do barwienia.
Roztwór formaliny, buforowany neutralnie, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Istnieją alternatywni dostawcy.