Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Podsumowanie

Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Streszczenie

Ostre uszkodzenie płuc (ALI) jest ciężką chorobą charakteryzującą się neutrofilią pęcherzyków płucnych, z ograniczonymi możliwościami leczenia i wysoką śmiertelnością. Eksperymentalne modele ALI mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy chorób. Lipopolisacharyd (LPS) pochodzący z bakterii Gram-dodatnich indukuje neutrofilowe zapalenie w drogach oddechowych i miąższu płuc myszy. Skuteczne dostarczanie do płuc związków, takich jak LPS, jest jednak trudne do osiągnięcia. W opisanym tutaj podejściu dostarczanie płucne u myszy uzyskuje się poprzez prowokację do aerozolowego Pseudomonas aeruginosa LPS. Rozpuszczony LPS był aerozolowany za pomocą nebulizatora podłączonego do sprężonego powietrza. Myszy były wystawione na ciągły przepływ aerozolu LPS w pudełku z pleksiglasu przez 10 minut, a następnie kondycjonowanie przez 2 minuty po odstawieniu aerozolu. Następnie przeprowadzono intubację tchawicy, a następnie płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, a następnie perfuzję formaliny, co pozwala na scharakteryzowanie jałowego zapalenia płuc. Aerozol LPS generuje zapalenie płuc charakteryzujące się neutrofilią pęcherzykową, wykrywaną w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych i ocenie histologicznej. Technikę tę można skonfigurować niewielkim kosztem przy użyciu kilku urządzeń i wymaga minimalnego szkolenia i wiedzy. System ekspozycji może być zatem rutynowo wykonywany w dowolnym laboratorium, co może przyczynić się do lepszego zrozumienia patologii płuc.

Wprowadzenie

Lipopolisacharyd (LPS) jest składnikiem ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych¹. Wyzwanie dla LPS to dobrze udokumentowany model ostrego uszkodzenia płuc, zespołu charakteryzującego się ostrym zapaleniem neutrofilowym i obrzękiem². Ponadto neutrofilia płucna jest również cechą charakterystyczną przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP)³, a prowokacja LPS u ludzi została wykorzystana do modelowania zaostrzeń^{POChP 4}. W związku z tym eksperymentalne modele ekspozycji na LPS są klinicznie istotnymi i cennymi narzędziami do zrozumienia patologii człowieka.

Celem opisanego tutaj dostarczania LPS w aerozolu do płuc jest wywołanie neutrofilowej odpowiedzi zapalnej w przewodzących i oddechowych drogach oddechowych, bez udziału całego organizmu. Kilka technik wyzwania LPS zostało opisanych wcześniej. Wstrzyknięcie dożylne LPS jest najczęściej stosowaną drogą podawania. Chociaż ta technika jest łatwo dostępna, pierwotne uszkodzenie dotyczy śródbłonka, z wtórnym zniszczeniem nabłonka płucnego w wyniku migracji neutrofili do płuc. Podanie dożylne wywołuje również ogólnoustrojowe zapalenie², co może komplikować obraz kliniczny w modelach zwierzęcych. Zapalenie ogólnoustrojowe nie jest natomiast obserwowane w przypadku podawania dotchawniczego. Technika ta jest jednak pracochłonna i wymaga znieczulenia, a także znacznego treningu ^5,6 . Ponadto odkładanie się w płucach tą drogą podania jest zależne od oddychania⁷. W związku z tym na osadzanie w płucach ma wpływ głębokość znieczulenia potrzebnego do podania dotchawiczego i można zaobserwować zmienne osadzanie w drogach oddechowych. W przeciwieństwie do tego, poród płucny za pomocą LPS w aerozolu wymaga minimalnego przeszkolenia i można go łatwo przeprowadzić na dużej liczbie zwierząt z niewielkimi lub żadnymi różnicami między osobnikami ^5,8 . Niedawne badanie potwierdza, że dostarczanie aerozolu jest lepsze niż droga dotchawicza w odniesieniu do osadzania się oraz że bardziej odpowiednie dawki LPS wywołują zapalenie neutrofilowe w tym modelu⁸.

Poprzednie badania wykazały, że prowokacja do aerozolowanego Psuedomonas aeruginosa LPS generuje wyraźną reakcję zapalną w świetle dróg oddechowych i miąższu płucnym, w tym w przestrzeniach pęcherzykowych ^9,10. Stan zapalny charakteryzuje się przewagą neutrofili i obecnością obrzęku płuc, a zatem może być stosowany do zwalczania patogenezy ostrego uszkodzenia płuc i uzyskania dalszej wiedzy na temat mechanizmów przyczyniających się do patologii choroby.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. dobrostanu zwierząt w północnym Sztokholmie. Procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z prawem szwedzkim.

1. Generowanie aerozolu LPS

1. Rozpuścić 0,5 g oczyszczonego LPS P. aeruginosa w 50 ml sterylnej soli fizjologicznej przy delikatnym mieszaniu i zweryfikować stopień rozpuszczenia. Rozcieńczyć 1 ml rozpuszczonego LPS w 9 ml sterylnej soli fizjologicznej do końcowego stężenia 1 mg/ml. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Odmrozić rozpuszczony LPS w ciemności w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszać bezpośrednio przed użyciem.
3. W wentylowanej komorze biologicznej klasy II włożyć czerwony wlot do nebulizatora i połączyć nebulizator z powietrzem pokojowym pod ciśnieniem za pomocą rurek dostarczonych przez producenta (należy zapoznać się ze schematem urządzeń eksperymentalnych przedstawionym na Rysunku 1).
   UWAGA: podczas ekspozycji należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej, w tym wielorazowy respirator półmaskowy z filtrami przeciwcząsteczkowymi, gogle, rękawiczki oraz odzież ochronną.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie urządzeń eksperymentalnych wykorzystywanych do generowania aerozolu. Wlot nebulizatora jest połączony z zasilaniem powietrznym. Wylot nebulizatora jest najpierw połączony z przepływomierzem za pomocą rurki o średnicy 15,9 mm i filtra powietrza, a zasilanie powietrzem jest ustawione na 5,0 L/m przy ciśnieniu 2 kbar. Następnie wylot zostaje połączony z pudełkiem z pleksiglasu wyposażonym w wyjmowane pokrywy i otwory o średnicy 5 mm w celu zapobiegania wzrostowi ciśnienia.

4. Podłączyć wylot nebulizatora do przepływomierza masowego za pomocą filtra powietrza. Podłączyć przepływomierz masowy do zasilania elektrycznego.
5. Ustawić dopływ powietrza na 5 L/min, utrzymując ciśnienie na poziomie 1.0-2.0 bar.
6. Zdjąć przepływomierz masowy i odłączyć dopływ powietrza.
7. Podłączyć wylot nebulizatora do rurki o średnicy 15.9 mm, która rozdziela się i łączy z dwoma pudełkami z pleksiglasu o wymiarach 150 x 163 x 205 mm, wyposażonymi w zdejmowane pokrywy. Każde pudełko powinno posiadać otwór o średnicy 5 mm w ścianie przeciwległej do wlotu, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia.
8. Umieścić do 5 myszy w każdym pudełku z pleksiglasu i zamknąć pokrywy.
9. Otworzyć nebulizator i napełnić wkładnik co najmniej 4 ml LPS rozpuszczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub samym nośnikiem (sterylna sól fizjologiczna; objętość nie powinna przekraczać 8 ml). Ponownie podłączyć wlot do dopływu powietrza.
10. Pozostawić aerozol w zamkniętych pudełkach z pleksiglasu przez 10 min. stale monitorować zwierzęta. Upewnić się, że dopływ powietrza jest szczelnie przymocowany do wlotu nebulizatora.
11. Odłączyć dopływ powietrza. Pozostawić zwierzęta w pudełkach z pleksiglasu przez 2 min przy zamkniętych pokrywach.
12. Otworzyć pokrywy, aby umożliwić rozproszenie aerozolu, a następnie przenieść zwierzęta z powrotem do klatek. Jeśli zwierzęta są wilgotne, umieścić klatki na podkładce grzewczej ustawionej na niską temperaturę, aby zapobiec hipotermii.
13. Stale monitorować zwierzęta przez pierwsze 30 min, a następnie co 2 hr przez pierwsze 6 hr. Zwierzęta powinny wykazywać prawidłowy wzorzec oddychania i aktywność w trakcie oraz po procedurze nebulizacji.

2. Płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL)

1. W punkcie końcowym eksperymentu głęboko znieczul zwierzęta izofluranem do uzyskania efektu zgodnie z zaleceniami personelu weterynaryjnego danej instytucji. Uciśnij tylną łapę, aby sprawdzić odruch wycofania i upewnić się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca do przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego. Spryskaj futro zwierząt 70% etanolem.
2. Otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek i przetnij aortę, aby doprowadzić do upuszczenia krwi z organizmu zwierzęcia. Połóż kawałek tkaniny na brzuchu, aby wchłonęła krew.
3. Po eutanazji wykonaj jedno cięcie nożyczkami w kierunku przednio-tylnym, aby odsłonić klatkę piersiową. Unieś klatkę piersiową za przednią część mostka i za pomocą nożyczek przebij przeponę w najbardziej brzusznej części, uważając, aby nie przeciąć żadnego płata płuc. Otwórz klatkę piersiową, wykonując dwa cięcia w kierunku przednio-tylnym (spotykające się poniżej żuchwy).
4. Ostrożnie rozsuń klatkę piersiową za pomocą pęsety i przetnij tchawicę poniżej krtani.
5. Unieś tchawicę pęsetą i usuń płuca, przecinając więzadła łączące płaty z jamą klatki piersiowej i delikatnie pociągając za tkankę tłuszczową i serce.
6. Wprowadź rurkę polietylenową (średnica wewnętrzna: 0,58 mm; średnica zewnętrzna: 0,965 mm) do tchawicy i zabezpiecz rurkę jedwabną nicią.
7. Powiąż nicią jedwabną płat wielodzielny (cztery płaty prawego płuca).
8. Wprowadź igłę 23G do rurki polietylenowej i powoli wstrzyknij 250 µl lodowatego sterylnego PBS do pojedynczego płata za pomocą strzykawki 1 ml.
9. Ostrożnie opukaj płuca 30 razy i zbierz ciecz do strzykawki. Powtórz procedurę z 200 µl PBS (z całkowitej wstrzykniętej objętości 450 µl z pojedynczego płata powinno zostać odzyskane około 300 µl PBS).
10. Przechowuj płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) w lodzie lub natychmiast dokonaj zliczenia komórek BAL. Policz komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru), używając roztworu Turka do barwienia komórek¹¹. Oblicz całkowitą liczbę komórek, mnożąc liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia roztworu barwiącego oraz objętość pola zliczanego w hemocytometrze.
11. Przygotuj różnicowe zliczenia komórek z komórek poddanych cytocentryfugacji zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu¹¹.

3. Fixacja tkanki płucnej w formalinie do oceny histologicznej

1. Wyjąć wielopłat i zamrozić gwałtownie na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Zamocować strzykawkę 60 ml bez tłoka na metalowym statywie. Napełnić strzykawkę 10% formaliną tak, aby jej poziom znajdował się 20 cm powyżej blatu laboratoryjnego, co zapewni stałe ciśnienie równe 20 cm słupa cieczy.
3. Połączyć igłę 23 G zabezpieczoną w tchawicy ze strzykawką 60 ml za pomocą plastikowej rurki z zaworem do kontrolowania przepływu formaliny.
4. Wprowadzić formalinę do płata płuca przez 5 min. Odłączyć igłę i usunąć ją wraz z rurką polietylenową z tchawicy, pociągając za jedwabną nić, aby zamknąć tchawicę i utrzymać ciśnienie w płucu.
5. Zanurzyć płat płuca w formalinie i utrwalać przez 24 hr w temperaturze 4 °C.
6. Przemyć utrwaloną tkankę trzy razy przez co najmniej 20 min 70% etanolem, a następnie odwodnić do ksylenu zgodnie z poniższym schematem (każdy etap po 1 hr):
   • 3x 70% etanol
   • 3x 95% etanol
   • 3x 100% etanol
   • 3x ksylen
   • 1x parafina (ciekła)
7. Zatopić odwodnioną tkankę w parafinie, wykonać skrawki o grubości 4-5 µm i zabarwić hematoksyliną i eozyną w celu oceny histologicznej.

Wyniki

Wywołanie reakcji na aerozolowe LPS P. aeruginosa zazwyczaj skutkuje wyraźną odpowiedzią zapalną w świetle dróg oddechowych i przestrzeni pęcherzyków płucnych, charakteryzującą się przewagą neutrofili zarówno we wczesnych, jak i późnych punktach czasowych.

Aerozolowy LPS indukuje neutrofilię płucną

Myszy szczepów C57BL/6by i BALB/c poddano działaniu aerozolu z LPS P. aeruginosa lub samego nośnika, a następnie oznaczono liczbę neutrofili w BALF. Całko...

Dyskusja

Aerozol LPS generuje reakcję zapalną w drogach oddechowych, charakteryzującą się neutrofilami w błonie podśluzowej nabłonka, przestrzeniach otaczających przewodzące drogi oddechowe, a także przestrzeniach pęcherzykowych. Jest to, wraz ze zwiększoną całkowitą zawartością białka w BALF, wskazującą na wyciek osocza, reprezentatywną dla patologii ostrego uszkodzenia płuc. Ponieważ LPS wywołuje jałowe zapalenie, reakcja jest niezależna od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i istnieją ograniczenia co do znaczenia infekcji...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oczyszczony Pseudomonas aeruginosa LPS	Sigma-Aldrich		Szkodliwy. Zalecane oczyszczanie. Można stosować LPS oczyszczone z innych bakterii.
Nebulizator Pari LC sprint star	PARI Respiratory Equipment Inc.	023G1250
Przepływomierz masowy TSI 4040	TSI	4040	Można stosować produkt alternatywny od innego dostawcy.
Wężyk Tygon 15.9 mm Saint-Gobain	Sigma-Aldrich	Z685704	Zalecana marka.
Pudełka z pleksiglasu z wyjmowanymi pokrywami	Wykonane na zamówienie	N/A	150 x 163 x 205 mm (otwór 2 mm z boku).
Maska wielorazowa 3M Half Facepiece	3M	7503	Zalecana marka.
Zaawansowane filtry cząsteczkowe (P100) 3M	3M	2291	Zalecana marka.
Nożyczki	VWR	233-1104	Można stosować preferowane nożyczki.
Pinceta	VWR	232-1313	Można stosować preferowaną pincetę.
Wężyk polietylenowy Intramedic PE50	BD	427411	Zalecana marka.
Nić jedwabna Ethicon 2-0 Perma-hand	VWR	95056-992	Zalecana marka.
Igła G 26 ½			Istnieją alternatywni dostawcy.
Strzykawka 1 ml BD z końcówką typu slip-tip, niesterylna	BD	301205	Istnieją alternatywni dostawcy.
Strzykawka 60 ml BD Luer-Lok, niesterylna, polipropylenowa	BD	301035	Istnieją alternatywni dostawcy.
Hematoksylina i eozyna Fluka	Sigma-Aldrich	3972	Istnieją alternatywni dostawcy.
Roztwór Türka	Merck Millipore	109277
Wirówka nakładkowa			Istnieją alternatywni producenci.
Cytowirówka Cytospin 4	Thermo Scientific	A78300003	Można stosować alternatywną wirówkę.
Zestaw barwiący HEMA-3 stat pack	Fisher Scientific	23-123-869	Istnieją alternatywne zestawy barwiące.
Formalina, neutralnie buforowana, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Istnieją alternatywni dostawcy.