Artykuł metodologiczny

Pomiar rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51473

⸱

29 marca 2014

 , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital, Jena, Germany, 2Integrated Research and Treatment Center, Center for Sepsis Control and Care (CSCC), Jena University Hospital, Jena, Germany

W tym artykule

Podsumowanie

Inhibicyjne presynaptyczne GABAergiczne jest potężnym mechanizmem hamującym w rdzeniu kręgowym, ważnym dla integracji sygnałów motorycznych i czuciowych w sieciach rdzenia kręgowego. Podstawową pierwotną depolaryzację aferentną można zmierzyć poprzez rejestrację potencjałów korzenia grzbietowego (DRP). Tutaj demonstrujemy metodę rejestracji in vivo DRP u myszy.

Streszczenie

Hamowanie presynaptyczne jest jednym z najpotężniejszych mechanizmów hamujących w rdzeniu kręgowym. Podstawowym mechanizmem fizjologicznym jest depolaryzacja pierwotnych włókien doprowadzających, w której pośredniczą synapsy akso-aksonalne GABA-ergiczne (pierwotna depolaryzacja aferentna). Siłę pierwotnej depolaryzacji aferentnej można zmierzyć, rejestrując potencjały przewodzone objętościowo w korzeniu grzbietowym (potencjały korzenia grzbietowego, DRP). Patologiczne zmiany hamowania presynaptycznego mają kluczowe znaczenie w nieprawidłowym centralnym przetwarzaniu niektórych stanów bólowych oraz w niektórych zaburzeniach nadpobudliwości ruchowej. W tym miejscu opisujemy metodę rejestrowania DRP in vivo u myszy. Wyjaśniono przygotowanie korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego u znieczulonego zwierzęcia oraz procedurę rejestracji za pomocą elektrod ssących. Metoda ta pozwala na pomiar GABA-ergicznego DRP, a tym samym oszacowanie rdzeniowego hamowania presynaptycznego u żywej myszy. W połączeniu z transgenicznymi modelami myszy, zapis DRP może służyć jako potężne narzędzie do badania patofizjologii kręgosłupa związanej z chorobą. Zapis in vivo ma kilka zalet w porównaniu z preparatami izolowanymi ex vivo rdzenia kręgowego, np. możliwość jednoczesnego rejestrowania lub manipulowania sieciami nadrdzeniowymi oraz indukcja DRP poprzez stymulację nerwów obwodowych.

Wprowadzenie

Hamowanie presynaptyczne jest jednym z najpotężniejszych mechanizmów hamujących w rdzeniu kręgowym. Hamuje pobudzające potencjały postsynaptyczne (EPSP) w monosynaptycznie wzbudzonych neuronach ruchowych bez zmiany potencjału błony postsynaptycznej i pobudliwości neuronów ruchowych1-3. Pierwotna depolaryzacja aferentna (PAD) indukowana przez GABA-ergiczne synapsy akso-aksonalne na czuciowe włókna presynaptyczne jest mechanizmem leżącym u podstaw4-7 (patrz również ryc. 1a). Synapsy te zawierają receptory GABAA iGABA B (GABAAR i GABABR). Aktywność GABA, AR prowadzi do wzrostu przewodnictwa chlorków, które wywołuje PAD ze względu na lokalną dystrybucję jonów. Ta depolaryzacja blokuje propagację potencjałów czynnościowych do zakończeń aksonów i zmniejsza ich siłę, prowadząc do zmniejszonego napływu Ca2+ i zmniejszenia uwalniania nadajnika. Aktywacja receptorów GABAB nie przyczynia się do PAD, ale prowadzi do zmniejszenia napływu Ca2 +, zwiększając w ten sposób hamowanie presynaptyczne. Podczas gdy aktywacja GABAAR wydaje się być zaangażowana w krótkotrwałe hamowanie, GABABR są zaangażowane w długoterminową modulację8-10. Oprócz GABA, który odpowiada za główną część PAD i hamowania presynaptycznego, inne systemy przekaźnikowe mogą również modulować i przyczyniać się do tego mechanizmu11,12.

Patologiczne zmiany w hamowaniu presynaptycznym wydają się być kluczowe w kilku stanach chorobowych, np. zapalenie obwodowe i ból neuropatyczny13,14, a także nieprawidłowe przetwarzanie bólu ośrodkowego15, uraz rdzenia kręgowego16 i choroba OUN z nadpobudliwością motoryczną, w której pośredniczy wadliwa transmisja GABA-ergyczna17,18. Dlatego oszacowanie inhibicji presynaptycznej jest warte zbadania eksperymentalnych stanów patologicznych na poziomie rdzenia kręgowego in vivo. PAD powoduje powstanie potencjałów przewodzonych objętościowo, zapewniając bezpośrednią miarę hamowania presynaptycznego w rdzeniu kręgowym. Potencjały te nazywane są potencjałami korzeni grzbietowych (DRP) i można je zmierzyć z korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego po stymulacji sąsiednich korzeni grzbietowych7.

Pierwsze pomiary DRP zostały odnotowane u kotów i żab19 i były intensywnie badane u kotów przez Ecclesa, Schmidta i innych na początku lat siedemdziesiątych3,4,20,21. Podczas gdy zapisy in vivo DRP u kotów22 i szczurów23 były szeroko stosowane, pomiary na myszach wykonywano prawie wyłącznie w izolowanych preparatach rdzenia kręgowego ex vivo 15,24. W tym miejscu opisujemy metodę rejestrowania DRP u znieczulonych myszy in vivo, co pozwala na bezpośredni pomiar hamowania presynaptycznego w nienaruszonym organizmie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne wymienione w poniższym protokole zostały zatwierdzone przez władze kraju związkowego Turyngii (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).

1. Przygotowania do eksperymentu

  1. Produkcja elektrod ssących
    1. Pobrać mikropipetę za pomocą standardowej kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet, np. standardowej elektrody krosowej.
    2. Przełamać elektrodę do średnicy końcówki 0,5-1 mm (nieco większej niż średnica korzeni grzbietowych) za pomocą pilnika diamentowego.
    3. Wypoleruj końcówkę na gorąco, aby nie uszkodziła korzenia grzbietowego po zassaniu. Odpowiednia będzie standardowa latarka laboratoryjna.
    4. Zamontuj szklane żarnik na uchwycie elektrody podłączonym do strzykawki, przez którą można zastosować podciśnienie.
  2. Przygotowanie roztworów
    1. Znieczulenie iniekcyjne dla myszy: Wymieszaj 0,75 ml ketaminy 10%, 0,24 ml ksylazyny 2% i 5 ml 0,9% soli fizjologicznej. 10 μl/g masy ciała (m.c.) roztworu wstrzykuje się dootrzewnowo (i.p.).
    2. Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF): Rozcieńczyć w wodzie podwójnie destylowanej następujące sole (w mM): NaCl 134; KCl 3; KH2PO4 1,25; MgSO4•H2O 2; NaHCO3 25; CaCl2 2; D-glukoza 10. DodaćH2O2do końcowego stężenia 0,003%. Używaj zawsze świeżo przygotowanego roztworu.
  3. Przygotowanie konfiguracji nagrywania (rysunek 2)
    1. Podłącz wzmacniacz do interfejsu komputera w celu digitalizacji danych.
    2. Użyj programu komputerowego lub zegara analogowego, aby wyzwolić stymulator impulsów kwadratowych i akwizycję danych na dysku twardym komputera.
    3. Używaj chlorkowanych drutów srebrnych podłączonych do standardowych uchwytów elektrod szklanych, jak do stymulacji i nagrywania.
    4. Zmontuj trzy manipulatory do stymulacji, rejestracji i elektrody referencyjnej odpowiednio wokół ramy stereotaktycznej dla myszy, tak aby wszystkie elektrody miały później dostęp do przygotowanego rdzenia kręgowego.
    5. Podłącz rurki i strzykawki do uchwytów elektrod, aby były jabłkowe, aby wytworzyć podciśnienie.

2. Ogólne uwagi dotyczące eksperymentów na zwierzętach i przygotowania zwierząt do procedury nagrywania

  1. Wszystkie eksperymenty na myszach należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi odpowiedniej instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Wykonuj wszystkie operacje i nagrania w głębokiej narkozie, upewniając się, że cierpienie zwierząt jest zminimalizowane.
  2. Znieczulić zwierzę przez wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (odpowiednio 125 mg i 8 mg na g masy ciała ketaminy i ksylazyny; 10 μl/g m.c. przygotowanego roztworu, jak opisano powyżej). W razie potrzeby podczas długotrwałych nagrań można wykonać dodatkowe iniekcje i.p. lub i.m.
    Uwaga: Powtarzające się wstrzyknięcia domięśniowe 0,05-0,1 ml roztworu ketaminy/ksylazyny w górną część ud okazały się odpowiednie do utrzymywania zwierzęcia w głębokim znieczuleniu przez okres do 3 godzin.
  3. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  4. Zamocuj głowę zwierzęcia w ramie stereotaktycznej i użyj poduszki grzewczej z sondą doodbytniczą i pętlą odruchową, aby kontrolować temperaturę ciała zwierzęcia podczas eksperymentu. Mocowanie rdzenia kręgowego w ramie stereotaktycznej nie jest konieczne.
  5. Przed rozpoczęciem przygotowania należy sprawdzić głębokość narkozy poprzez odruch mrugania oczami i drganie między palcami u nóg myszy. Odruchy powinny zostać zniesione.
  6. Otwórz skórę wzdłuż linii środkowej nad rdzeniem kręgowym od górnego poziomu klatki piersiowej do dolnych obszarów lędźwiowych, aby uzyskać czyste pole operacyjne za pomocą skalpela. Nie używaj nożyczek do wykonywania nacięć skóry. Ostrożnie odczep skórę od leżącej pod spodem tkanki. Podczas kolejnych kroków należy zwilżyć ranę 0,9% solą fizjologiczną.
  7. Przetnij ścięgna i tkankę łączną po obu stronach kręgów od poziomu lędźwiowego do piersiowego za pomocą skalpela i nożyczek.
  8. Usuń wyrostki kolczyste i resztę tkanki łącznej wokół kręgów za pomocą małego szczypiec.
  9. Ostrożnie rozbij kręgi szczypcem, zaczynając od poziomu lędźwiowego (L4/L5) pod mikroskopem preparacyjnym. Wepchnij końcówkę szczypiec w przestrzeń między kręgami a rdzeniem kręgowym i rozsuń kawałki kości. Nie uszkadzaj opony twardej i unikaj ucisku na rdzeń kręgowy. Oba te czynniki mają kluczowe znaczenie dla sukcesu. Utrzymuj rdzeń kręgowy w wilgotnym stanie podczas całego zabiegu. Przejdź do środkowego poziomu klatki piersiowej.

3. Oddzielenie korzeni grzbietowych i zapis DRP (Rysunek 2)

  1. Ostrożnie otwórz oponę twardą za pomocą cienkiej igły (30 G) z zagiętą końcówką. Od teraz używaj aCSF do nawilżania.
  2. Oddziel korzenie grzbietowe tak daleko, jak to możliwe, za pomocą miernika i odetnij dwa sąsiednie korzenie tak dystalnie, jak to możliwe. Energiczne ciągnięcie za korzenie podczas separacji wpływa na powodzenie eksperymentu.
  3. Opuść elektrodę ssącą w dół do korzeni grzbietowych. Dodaj jak najwięcej płynu mózgowo-rdzeniowego do rdzenia kręgowego, ponieważ płyn pomaga zassać korzenie grzbietowe.
  4. Zassać odcięty koniec jednego korzenia grzbietowego do jednej szklanej pipety, stosując podciśnienie przez strzykawkę. W razie potrzeby przesuń korzeń grzbietowy przed otwór elektrody za pomocą cienkiej igły.
  5. Jeśli korzeń grzbietowy leży suchy w elektrodzie ssącej, dodaj trochę aCSF do jego końcówki, ostrożnie ssąc, aż pipeta zostanie wystarczająco wypełniona aCSF.
  6. Po zassaniu korzenia grzbietowego podnieś końcówkę elektrody z rdzenia kręgowego. Należy uważać, aby żaden "mostek wodny" między końcówką pipety a rdzeniem kręgowym nie spowodował zwarcia elektrody rejestrującej/stymulującej.
  7. Powtórz kroki 3.3-3.6 dla sąsiedniego korzenia ipsilateralnego.
  8. Umieść elektrodę odniesienia jak najbliżej korzeni grzbietowych i utrzymuj ją zwilżoną, nakładając płyn CSF.
  9. Ustalając konfigurację nagrywania, jeden korzeń jest już wybrany do stymulacji, a drugi do nagrywania. Zwiększaj napięcie stopniowo, podczas gdy nagrywanie od drugiego korzenia grzbietowego odbywa się w bieżącym trybie cęgowym. Można zauważyć krótkie odchylenie w dół, po którym następuje powolne, długotrwałe odchylenie w górę, reprezentujące DRP.
  10. Dostosuj napięcie bodźca do poziomów supramaksymalnych i nagraj kilka przemiatania (co najmniej 20 - 30 przeciągnięć/korzeń grzbietowy przy 0,1 Hz, filtruj między 0,3 Hz-3 kHz).
  11. Nagrywaj krótkie ciągi trzech bodźców (100 Hz), aby uzyskać informacje o zależnym od czasu sumowaniu DRP.
  12. Przełącz miejsce nagrywania i stymulacji na dodatkowe nagrania kontralateralne.
  13. Zwierzęta nie są przeznaczone do przeżycia zabiegu. Składanie ofiar ze zwierząt po ostatnim nagraniu przez dekapitację, nadal pod wpływem głębokiego znieczulenia (ketamina/ksylazyna, patrz wyżej, krok 2.2).

4. Analiza danych

  1. Przenieś dane do programu analitycznego (np. Sigma Plot, Igor Pro lub MATLAB).
  2. Oblicz średnie ślady z 20-30 przebiegów.
  3. Weź maksymalną amplitudę ugięcia napięcia (od linii podstawowej; Amplituda piku DRP) do dalszej analizy (rysunek 3).
  4. Oblicz stosunek amplitudy piku DRP po trzech impulsach i pojedynczym impulsie, aby uzyskać miarę zależnego od czasu sumowania kolejnych potencjałów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowe zapisy DRP przedstawiono na Rysunku 3. Po wyraźnym artefakcie stymulacji zazwyczaj następuje krótkie odchylenie w dół. Następnie wyraźnie widoczne jest powolne, długotrwałe odchylenie w górę, reprezentujące DRP. W części zapisów odruchy korzenia grzbietowego są widoczne jako małe skoki na szczycie DRP. U normalnych myszy typu dzikiego odruchy korzenia grzbietowego pojawiają się najczęściej, gdy napięcie stymulacji jest zbyt wysokie. Ponieważ odruchów korzenia grzbietowego nie można wywołać z wysok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe elektrofizjologiczne zapisy aktywności neuronalnej i potencjałów synaptycznych in vivo są najnowocześniejszymi technikami badania funkcji neuronalnych i patofizjologii OUN. Integracja kręgosłupa ma kluczowe znaczenie dla funkcji motorycznych, np . ruchów kończyn i multimodalnej percepcji sensorycznej. Hamowanie presynaptyczne jest jednym z krytycznych mechanizmów w tym procesie obliczeniowym, zapewniającym odpowiednie reakcje na bodźce sensoryczne. Synapsy GABA-ergiczne na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Manfredowi Heckmannowi za pomocne dyskusje podczas tworzenia metody. Ponadto dziękujemy Claudii Sommer za pomoc techniczną i Frankowi Schubertowi za wsparcie przy produkcji filmu. Prace były wspierane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) z Niemiec, FKZ: 01EO1002 oraz Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Szpitala Uniwersyteckiego w Jenie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurki szklane (średnica wewnętrzna 1,16 mm)Science Products (Hofheim, Niemcy)GB200F-10Inne rurki szklane mogą być również odpowiednie
Roztwór do superfuzji (sterylny, 0,9% NaCl)Braun Melsungen AG3570350
Rompun 2% (ksylazyna)Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Niemcy)
Ketamine 10%Medistar GmbH (Ascheberg, Niemcy)KETAMIN 10%
30 G Mikroigłowy / StericanBraun Melsungen AG4656300
Sole do aCSFSigma-AldrichDiverse
S88 Dual Output Square PulseGrass Technologies (Warwick, USA)S88X
SIU5 RF Transformer Isolation UnitGrass Technologies (Warwick, USA)SIU-V
InstruTECH LIH 8+8HEKA ( Lambrecht, Deutschland)LIH 8+8 + oprogramowanie Patchmaster
Uniwersalny wzmacniaczNPI (Tamm, Deutschland)ELC-03X
Ściągacz do mikropipetSutter Instruments (Novato, USA)P-1000
Olympus (Tokio, Japonia)
MikromanipulatorSutter Instruments (Novato, USA)MPC-200/MPC-325Możliwe również mikromanipulatory mechaniczne
Homeotermiczny systemStoelting (Wood Dale, USA)50300V
Wewnątrz/zewnątrzkomórkowy uchwyt elektrody rejestrującejAparat Harvarda (Holliston, USA)641227
Mikroskop preparacyjny

Bibliografia

  1. Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
  2. Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
  3. Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
  4. Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
  5. Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
  6. Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
  7. Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
  8. Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
  9. Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
  10. Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why? Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
  11. Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
  12. Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
  13. Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
  14. Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
  15. Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
  16. Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
  17. Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
  18. Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
  19. Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
  20. Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
  21. Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
  22. Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
  23. Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775(2011).
  24. Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rdze kr gowyrejestracja in vivoelektrody ss cesynapsy GABAergicznepierwotna depolaryzacja aferentnamodel mysiznieczulenie ketaminpreparat korzenia grzbietowego

Powiązane artykuły