Method Article

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

DOI:

10.3791/51474

⸱

September 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, Los Angeles, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, University of Notre Dame, 3Molecular Imaging Center, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj szczegółowo opisujemy projekt, produkcję i użycie urządzenia mikroprzepływowego do oceny odkształcalności dużej liczby pojedynczych komórek w efektywny sposób. Zazwyczaj dane dla ~102 komórek można uzyskać w ciągu 1-godzinnego eksperymentu. Zautomatyzowany program do analizy obrazu umożliwia wydajną analizę danych obrazu po eksperymencie, umożliwiając zakończenie przetwarzania w ciągu kilku godzin. Geometria naszego urządzenia jest wyjątkowa, ponieważ komórki muszą odkształcać się poprzez serię zwężeń w skali mikronów, umożliwiając w ten sposób wstępną deformację i zależne od czasu rozluźnienie poszczególnych komórek. Wykazano przydatność tej metody do ludzkich komórek białaczki promielocytowej (HL-60). Kierując komórki do deformacji poprzez zwężenia w skali mikronów za pomocą przepływu sterowanego ciśnieniem, obserwujemy, że ludzkie komórki promielocytarne (HL-60) chwilowo zamykają pierwsze zwężenie na medianę czasu 9,3 ms, zanim szybciej przechodzą przez kolejne zwężenia z medianą czasu przejścia wynoszącą 4,0 ms na zwężenie. W przeciwieństwie do tego, komórki HL-60 traktowane kwasem all-trans retinowym (typu neutrofilowego) zamykają pierwsze zwężenie tylko na 4,3 ms, zanim przejdą przez kolejne zwężenia z medianą czasu pasażu wynoszącą 3,3 ms. Metoda ta może zapewnić wgląd w lepkosprężystą naturę komórek i ostatecznie ujawnić molekularne pochodzenie tego zachowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmiany w kształcie komórki są krytyczne w wielu kontekstach biologicznych. Na przykład erytrocyty i leukocyty deformują się przez naczynia włosowate, które są mniejsze niż ich własna średnica1. W przypadku przerzutów komórki rakowe muszą deformować się przez wąskie szczeliny śródmiąższowe, a także kręte sieci naczyniowe i limfatyczne, aby wysiać w miejscach wtórnych2. Aby zbadać fizyczne zachowanie poszczególnych komórek, urządzenia mikroprzepływowe stanowią idealną platformę, którą można dostosować do badania szeregu zachowań komórek, w tym ich zdolności do migracji przez wąskie szczeliny3 i pasywnego odkształcania się przez zwężenia w skali mikronowej3-9. Urządzenia mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu (PDMS) są optycznie przezroczyste, co umożliwia wizualizację deformacji komórek za pomocą mikroskopii świetlnej i analizę przy użyciu podstawowych narzędzi do przetwarzania obrazu. Co więcej, można precyzyjnie zdefiniować tablice zwężeń, co umożliwia jednoczesną analizę wielu komórek z przepustowością przekraczającą wiele istniejących technik10,11.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół eksperymentalny do badania deformowalności komórek za pomocą mikroprzepływowego urządzenia PDMS 'Cell Deformer'. Urządzenie zostało zaprojektowane tak, aby komórki przechodziły przez sekwencyjne zwężenia; Ta geometria jest powszechna w kontekstach fizjologicznych, takich jak łożysko kapilarne płuc12. Aby ocenić odkształcalność komórki, czas tranzytu zapewnia wygodną metrykę, którą można łatwo zmierzyć jako czas potrzebny pojedynczej komórce na przejście przez pojedyncze zwężenie4,6. Aby utrzymać stały spadek ciśnienia w zwężonych kanałach podczas tranzytu komórek, stosujemy przepływ sterowany ciśnieniem. Nasz protokół zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące projektowania i produkcji urządzeń, obsługi urządzenia przez przepływ sterowany ciśnieniem, przygotowania i obrazowania komórek, a także przetwarzania obrazu w celu zmierzenia czasu odkształcenia komórek przez serię zwężeń. Jako pliki uzupełniające dołączamy zarówno projekty urządzeń, jak i kod przetwarzania danych wizyjnych. Jako reprezentatywną próbkę danych pokazujemy czas przejścia komórki przez serię zwężeń w funkcji liczby przekroczonych zwężeń. Analiza skali czasowej, w której komórki przechodzą przez wąskie zwężenia urządzenia mikroprzepływowego, może ujawnić różnice w odkształcalności różnych typów komórek4,5,13. Zademonstrowane tutaj urządzenie w unikalny sposób bada tranzyt komórek przez serię zwężeń w skali mikronowej; Taka konstrukcja emuluje krętą ścieżkę, którą komórki doświadczają w krążeniu, a także umożliwia badanie dodatkowych cech fizycznych komórek, takich jak czas relaksacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Konstrukcja urządzenia ma cztery podstawowe obszary funkcjonalne: port wejściowy, filtr komórkowy, tablica zwężeń i port wyjściowy (Rysunek 1). Ogólny projekt można zastosować do szerokiej gamy typów komórek, z niewielkimi korektami wymiarów. Poniżej znajduje się kilka podstawowych zaleceń projektowych wraz z parametrami urządzenia, które są skuteczne w przypadku wyboru zarówno komórek pierwotnych, jak i unieśmiertelnionych.

  1. Wybierz szerokość kanałów matrycy zwężonej (Rysunek 1B) tak, aby wynosiła około 30-50% średniej średnicy komórki; ten stosunek zwężenia do wielkości komórki powoduje znaczną deformację komórki, ale minimalne zatkanie. Biorąc pod uwagę typ ogniwa, który nie był wcześniej testowany, rozsądnie jest zaprojektować zakres szerokości zwężenia od ~30-50% średnicy ogniwa, aby znaleźć optymalną szerokość. Podobnie jak w przypadku wielu typów urządzeń mikroprzepływowych, ponad 120 form wzorcowych urządzeń można wzorować na jednej 4-calowej płytce krzemowej, co umożliwia wytwarzanie szeregu różnych projektów urządzeń w jednym procesie produkcyjnym.
  2. Wybierz wysokość kanału tak, aby wynosiła co najmniej 50% średnicy komórki; gwarantuje to, że komórka jest ograniczona w 2 wymiarach. Aby zapobiec zapadaniu się kanału podczas łączenia, upewnij się, że proporcje kanału nie są mniejsze niż 1:10 (wysokość:szerokość) w całym urządzeniu. W przypadku kanałów, które muszą przekraczać ten współczynnik proporcji, dodaj słupki wsparcia, aby zapobiec zawaleniu. Umieść słupki wsporcze w odległości co najmniej dwukrotnie większej niż średnica komórki, aby nie utrudniać przepływu komórek.
  3. Umieść filtr w portach wejściowych, aby usunąć zanieczyszczenia i zdezagregować klastry komórek (Rysunek 1B). Dostosuj rozmiar i odstępy między słupkami filtra tak, aby odległość między słupkami była w przybliżeniu równa średnicy jednej komórki.
    UWAGA: Dolna granica rozmiaru elementu jest określana przez rozdzielczość, w jakiej drukowana jest maska litograficzna. Upewnij się, że wszystkie funkcje mieszczą się w limicie rozdzielczości określonym przez dostawcę maski.

2. Zaopatrzenie i przygotowanie

UWAGA: Przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu, należy przygotować następujące elementy. Schemat całej konfiguracji znajduje się na rysunku 1.

  1. Wykonać wzorzec urządzenia przy użyciu standardowych technik mikroobróbki litograficznej14,15. Sprawdź wysokość elementów wzoru za pomocą profilometru.
    UWAGA: Podczas gdy wzorce można łatwo wytworzyć w pomieszczeniu czystym, niektóre laboratoria opracowały niedrogie metody litografii do stosowania w półczystym środowisku16,17.
  2. Przygotuj źródło powietrza do przepływu napędzanego ciśnieniem, używając zbiornika sprężonego powietrza oraz sekwencji regulatorów powietrza i armatury (Rysunek 1A).
    1. Ustaw zbiornik powietrza doprowadzającego powietrze i regulator ręczny.
      UWAGA: Kompozycja 5% CO2 w powietrzu utrzymuje podobne środowisko jak typowy inkubator do hodowli komórkowych, ale można również stosować inne mieszaniny gazów.
    2. Ustaw elektronicznie sterowany regulator ciśnienia w jednej linii z regulatorem ręcznym. Użyj przetwornicy elektropneumatycznej, aby regulować i utrzymywać stabilny spadek ciśnienia na kanałach, przy wahaniach ciśnienia mniejszych niż 2 kPa. Użyj prostego kodu napisanego w LabVIEW (Informacje dodatkowe), aby wprowadzić żądane ciśnienie.
      UWAGA: Przekształtnik elektropneumatyczny wykorzystuje wewnętrzną pętlę sprzężenia zwrotnego do regulacji ciśnienia wylotowego zaworu w celu dopasowania do określonego ciśnienia w urządzeniu mikroprzepływowym.
    3. Ustawić komorę ciśnieniową, aby napędzać przepływ zawiesiny komórek. Zmontuj komorę zawieszenia komórek ze standardowej rurki cytometru przepływowego i obrabianej maszynowo nasadki, która tworzy szczelne uszczelnienie na probówce.
      UWAGA: Nasadka komory ciśnieniowej zawiera dwa otwory: wlot, który łączy się ze zbiornikiem sprężonego powietrza, oraz wylot, przez który komórki przepływają z komory ciśnieniowej do urządzenia (rysunek 2).
  3. Ustaw odwrócony mikroskop wyposażony w kamerę, która ma szybkość akwizycji co najmniej 100 klatek na sekundę, aby uchwycić obrazy komórek przepływających przez układ zwężeń. Połącz kamerę z kartą przechwytującą wideo i komputerem.
  4. Przygotuj podstawowy roztwór środka powierzchniowo czynnego o stężeniu 10% w/w Pluronic F-127 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), ponieważ dodanie niewielkiej ilości F127 do roztworu pożywki komórkowej pomoże zminimalizować przyleganie komórek do ścian PDMS. Aby przygotować roztwór F127, należy delikatnie podgrzać i podgrzać w temperaturze 37 °C, aby rozpuścić F127. Przed użyciem przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotuj roztwór środka powierzchniowo czynnego z wyprzedzeniem, ponieważ wirowanie i filtrowanie wygeneruje pęcherzyki, które utrzymają się przez ponad 24 godziny.

3. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

  1. Wyprodukuj blok PDMS z kanałami mikroprzepływowymi.
    1. Dokładnie wymieszać PDMS w stosunku 1:10 (w/w) utwardzacza do bazy.
    2. Wlej mieszaninę na mistrza urządzenia (krok 2.1). Odgazuj w słoiku dzwonowym z zastosowaną próżnią, aż uwięzione pęcherzyki znikną lub przez około 10-20 min.
      UWAGA: Po tym czasie na granicy faz powietrze-PDMS mogą nadal pojawiać się pęcherzyki, co jest normalne; Zazwyczaj rozpraszają się one podczas pieczenia. Najważniejsze jest, aby upewnić się, że w pobliżu kanałów nie pozostały żadne pęcherzyki.
    3. Piecz odgazowane urządzenie w temperaturze 65 °C przez 4 godziny. Aby zapobiec zapadaniu się kanałów, upiecz urządzenie przez noc, aby jeszcze bardziej usieciować PDMS w celu uzyskania urządzenia o wyższym module sprężystości, które jest bardziej odporne na zapadanie się kanału. Należy jednak pamiętać, że przedłużone pieczenie również powoduje kruchość PDMS i może prowadzić do pękania podczas dziurkowania otworów (krok 3.3).
  2. Wyjmij urządzenia mikroprzepływowe z formy głównej. Wytnij poszczególne urządzenia mikroprzepływowe z bloku PDMS za pomocą żyletki i wyjmij urządzenie z urządzenia głównego. Zacznij od delikatnego podniesienia jednego rogu urządzenia; powolne i delikatne peelingowanie, w przeciwieństwie do podnoszenia bloku PDMS prosto do góry, zmniejsza stres zarówno u PDMS, jak i mastera.
  3. Przebij otwory w urządzeniu PDMS, aby utworzyć porty połączeniowe umożliwiające dostęp między rurkami a mikrokanałami. Otwory należy wykonać za pomocą dziurkacza do biopsji i przebić od strony kanału do zewnętrznej strony urządzenia.
    UWAGA: Dziurkacz do biopsji o średnicy otworu 0,75 mm tworzy otwory, które idealnie łączą się z rurkami z polieteroeteroketonu (PEEK) (średnica zewnętrzna = 1/32" lub 0,79 mm) lub rurkami polietylenowymi (PE-20, średnica zewnętrzna = 0,043" lub 1,09 mm). Użyj lampy pierścieniowej, aby pomóc w wizualizacji otworów w urządzeniach z płytkimi kanałami18. Upewnij się, że cios biopsyjny jest ostry; Po wielokrotnym użyciu krawędź tnąca stępia się, a stempel do biopsji należy wyrzucić i wymienić.
  4. Wypłucz urządzenie PDMS izopropanolem (klasa HPLC), aby usunąć kurz i osadzone kawałki PDMS. Upewnij się, że wybite otwory są wolne od zanieczyszczeń, kierując przez nie stały strumień czystego izopropanolu z butelki do wyciskania. Wysuszyć suszarką z przefiltrowanym powietrzem. Po oczyszczeniu umieść bloki PDMS kanałami skierowanymi do góry na czystej szalce Petriego, aby utrzymać urządzenie w czystości. W razie potrzeby przechowuj urządzenia w tej formie do czasu sklejenia.
  5. Oczyść szklane podłoże przez spłukanie metanolem (klasa HPLC), wysusz przefiltrowanym powietrzem i umieść na płycie grzejnej o temperaturze 200 °C na 5-10 minut, aby upewnić się, że szkło jest całkowicie czyste i suche przed obróbką plazmową.
    UWAGA: Szklane podłoże tworzy dno każdego kanału. Zazwyczaj wystarcza szklane szkiełko, ponieważ obiektyw 10X lub 20X jest idealny do obrazowania wielu kanałów równolegle. Aby uzyskać obrazowanie o wyższej rozdzielczości, przymocuj urządzenie do szkiełka nakrywkowego (grubość #1.5).
  6. Przymocuj urządzenie PDMS do szklanego podłoża.
    1. Plazma tlenowa traktuje stronę kanału bloku PDMS i 1 stronę szkiełka podstawowego.
      UWAGA: W przypadku ręcznego urządzenia wyładowczego należy stosować czas zabiegu wynoszący 1 minutę, ale zoptymalizować czas leczenia dla każdego aparatu plazmy tlenowej.
    2. Natychmiast po zabiegu umieścić stronę kanałową PDMS na wierzchu leczonej strony szkła.
    3. Trzymaj razem z lekkim naciskiem przez ~10 sekund, aby ułatwić wiązanie. Piecz całe urządzenie w podwyższonej temperaturze (60-80 °C) przez co najmniej 15 minut, aby poprawić siłę wiązania.

4. Deformacja komórek przez zwężone kanały

  1. Sprawdź urządzenie mikroprzepływowe pod mikroskopem. Upewnij się, że kanały nie są zagięte ani uszkodzone oraz że zarówno otwory wlotowe, jak i wylotowe łączą się bezpośrednio z kanałami urządzenia za pomocą obiektywu o małej mocy (10X). Oznacz wadliwe urządzenia, nacinając powierzchnię PDMS żyletką i nie używaj ich do eksperymentów.
  2. Przygotować próbki kultur komórkowych do oznaczenia. Hodowla komórek w standardowych warunkach.
    1. Na przykład hodowla komórek HL-60 w pożywce RPMI-1640 uzupełniona 1% roztworem penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej w 5% inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
    2. W przypadku komórek przylegających należy je zebrać przez trypsynizację i ponownie zawiesić w świeżej pożywce wzrostowej. Użyj standardowego protokołu trypsynizacji; Na przykład, dodać ~0,5 ml trypsyny do kolby z powierzchnią hodowli 25cm2 i ponownie zamieszać w ~30 ml świeżej pożywki. Różnicować komórki HL-60 w komórki typu neutrofilowego za pomocą all-trans retinoicznej (ATRA) w końcowym stężeniu 5 μM na 1 x 105 komórek/ml, jak opisano wcześniej19,20.
    3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty, ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki do odpowiedniej gęstości końcowej w świeżej pożywce hodowlanej z 0,1% v/v F-127.
  3. Policz komórki za pomocą licznika Coultera, hemacytometru lub cytometru przepływowego. Dostosować zawiesinę komórek do gęstości 1 x 106 do 5 x 106 komórek/ml. Po ustawieniu gęstości zawiesiny uzupełnić około 0,1% v/v F-127.
    UWAGA: Gęstość komórek i stężenie środków powierzchniowo czynnych mogą wymagać modyfikacji w zależności od poszczególnych systemów komórkowych; Tabela 1 zawiera zapis poprzednio stosowanych stężeń komórek i F-127 dla różnych typów komórek.
  4. Umieść zawiesinę komórek w probówce cytometru przepływowego i podłącz do nasadki ciśnieniowej. Przed podłączeniem rurki do urządzenia mikroprzepływowego należy wyregulować ciśnienie na około 14-21 kPa i spłukiwać, aż zawiesina komórek wydostanie się z końcówki rurki. Pomoże to zminimalizować pęcherzyki powietrza w wężyku i urządzeniu.
  5. Włóż końcówkę rurki zawierającej zawiesinę komórek do wlotu urządzenia. Jeśli urządzenie jest połączone ze szkiełkiem nakrywkowym, przed podłączeniem rurki umieść urządzenie na płaskiej, twardej powierzchni, takiej jak stolik mikroskopu; Szkiełko nakrywkowe jest delikatne i w przeciwnym razie może pęknąć.
  6. Włóż kawałek rurki do portu wyjściowego i poprowadź go do pustej rurki do zbierania odpadów, takiej jak pusta rurka Falcon przyklejona taśmą z boku stolika mikroskopu. Aby zapewnić spójność ogólnej odporności płynnej urządzenia między eksperymentami, należy upewnić się, że rurki doprowadzające i wylotowe mają tę samą średnicę i w przybliżeniu tę samą długość dla każdego eksperymentu.
  7. Delikatnie zwiększ ciśnienie do około 28 kPa lub do momentu, gdy komórki przepłyną przez kanały. Ustaw urządzenie tak, aby wiele kanałów znajdowało się w polu view i były prostopadłe do dołu ekranu. Jeśli kamera jest ograniczona rozmiarem danych, uzyskaj wiele filmów, aby wygenerować wystarczającą liczbę niezależnych punktów danych. Dostosuj liczbę klatek na sekundę zgodnie z potrzebami dla żądanego wyjścia danych. Aby uchwycić zmiany w kształcie komórki, użyj obrazowania z dużą szybkością 300 klatek na sekundę (fps); Aby zmierzyć czas tranzytu komórek, użyj szybkości klatek około 100 kl./s.

5. Analiza danych

  1. Otwórz plik Master_script.m (Downloadable Supplemental File) i uruchom program.
  2. Wybierz pierwszy film wideo do analizy w wyświetlonym oknie Eksploratora Windows. Określ liczbę klatek na sekundę dla wybranego filmu i naciśnij enter.
    UWAGA: Pojawi się rysunek, który poprosi użytkownika o wybranie prostokątnego okna przycinania dla pierwszego filmu.
  3. Wybierz okno, które obejmuje wszystkie kanały od lewej do prawej i przecina kanały tuż nad pierwszą żarówką z zestawu kanałów na górze i na dole (Rysunek 3).
  4. Wybierz obszary zwężenia z przyciętego obrazu. Zwróć szczególną uwagę, aby zachować stałą odległość pikseli między górną i dolną granicą okna dla każdego wybranego filmu.
    UWAGA: Górna krawędź okna określa najwyższe zwężenie, a dolna krawędź okna określa najniższe zwężenie (Rysunek 4); Pośrednie zwężenia są przybliżane na podstawie tych danych wejściowych użytkownika. Następnie algorytm wyświetla segmentację komórek dla pierwszych 50 klatek każdego filmu (rysunek 5).
  5. Uważnie monitoruj obraz w lewym górnym rogu (Rysunek 5A), aby określić, czy algorytm dokładnie lokalizuje komórki; binaryzowany obraz jest nakładany na źródłowy obraz wideo, aby zademonstrować lokalizację zidentyfikowanych komórek.
    UWAGA: Poszczególne okna (rysunki 5B-5D) służą do diagnozowania kodu i demonstrują klatki wideo po określonych operacjach przetwarzania obrazu.
  6. Wybierz następny film do przetworzenia w oknie Eksploratora Windows.
    UWAGA: Algorytm powtórzy kroki 5.2-5.5 dla każdego wybranego filmu.
  7. Wybierz opcję Anuluj, gdy wszystkie żądane filmy zostaną dodane za pomocą okna Eksploratora Windows, aby poinstruować funkcję, że lista filmów jest kompletna.
    UWAGA: Algorytm wykona pozostałe operacje bez ingerencji użytkownika. Zajmie to około 1-2 godzin, w zależności od liczby przetworzonych filmów i wydajności komputera. Po zakończeniu algorytm utworzy histogram danych o czasie przejścia i zapisze dane w katalogu jako plik MATLAB .mat i plik .xls programu Microsoft Excel.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać odkształcalność różnych typów komórek, ludzkie komórki białaczki szpikowej (HL-60), zróżnicowane komórki neutrofilowe, mysie limfocyty i linie komórkowe ludzkiego raka jajnika (OVCAR8, HEYA8) są oceniane za pomocą techniki mikroprzepływowej 'Cell Deformer'. Reprezentatywne wyniki dla czasu tranzytu komórek HL-60 i HL-60 typu neutrofilowego pokazują skalę czasu, w którym pojedyncza komórka przechodzi przez serię zwężeń, jak pokazano na rysunku 6. Czas pasażu mierzy się dla populacji pojedynczyc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy kompleksową procedurę eksperymentalną do analizy deformacji komórek przechodzących przez zwężone kanały mikroprzepływowe przy użyciu przepływu sterowanego ciśnieniem. Skrypt MATLAB umożliwia automatyczne przetwarzanie danych (Supplemental Material); Aktualizowana wersja kodu jest utrzymywana (www.ibp.ucla.edu/research/rowat). W szerszym ujęciu, przedstawione tu techniki można zaadaptować w wielu komórkowych testach mikroprzep...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Lloydowi Ungowi za konstruktywny wkład we wczesne wersje tej techniki, Dr. Jeremy'emu Agresti za wskazówki dotyczące projektowania nasadki ciśnieniowej oraz Dr. Dongping Qi za pomoc w produkcji nasadki ciśnieniowej. Jesteśmy wdzięczni laboratoriom M. Teitella i P. Gunaratne za dostarczenie różnorodnych próbek komórek do testów. Jesteśmy wdzięczni Narodowej Fundacji Nauki (CAREER Award DBI-1254185), UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center oraz UCLA Clinical and Translational Science Institute za wsparcie tej pracy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pluronic F-127 Środek powierzchniowo czynny z kopolimeru blokowego Fisher Naukowy 8409400Wyprodukowany przez BASF, dostępny również za pośrednictwem
bazy i środka sieciującegoSigma PDMS Essex BrownellDC-184-1.1Produkt powszechnie nazywany Sylgard 184 Elastomerowa
jednostka wyładowcza plazmy tlenowejEnerconDyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0,75 mm)Ted Pella, Inc.15072
Tulejka dokręcana palcowo, 1/32"UpchurchScientificUP-F-113
Złączka doszczelna III, 10-32RurkaUP-F-300X
, średnica zewnętrzna = 1/32"lub 0,79 mmValcoTPK.515-25M
Rurka polietylenowa (PE-20), 0,043" lub 1,09 mmBecton Dickinson427406
Regulator ciśnieniaAirgas lub rurka
, 5/32" ODMcMaster Carr5648K284
Złączki wciskaneMcMaster Carr5111K91
Przetwornik elektropneumatyczny napięcia na ciśnienie (E / P)OmegaIP413-020
16-bitowy, 250 kS/S, 80 wejść analogowych Wielofunkcyjny DAQNational InstrumentsNI PCI 6225-779295-01
Złącze analogowe Blok-zacisk śrubowyNational InstrumentsSCB-68-776844-01
Oprogramowanie do projektowania systemów LabViewOprogramowanie National Instruments
MATLABThe MathWorks, Inc.MATLAB R2012awymaga zestawu narzędzi do przetwarzania obrazu
ekranowanyNational InstrumentsSHC68-68
polieteroeteroketonowa (PEEK) Upchurch Scientific poliuretanowa PraxairKod

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
  2. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
  3. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
  4. Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
  5. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  6. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
  7. Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174(2011).
  8. Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560(2012).
  9. Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275(2013).
  10. Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
  11. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
  12. Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
  13. Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
  14. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
  15. Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
  16. Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
  17. Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
  18. Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
  19. Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
  20. Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
  21. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  22. Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
  23. Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
  24. Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
  25. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  26. Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
  27. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceCell DeformabilityPressure Driven FlowMicron Scale ConstrictionsAutomated Image AnalysisHL 60 CellsTransit Time MeasurementPDMS FabricationFlow Cytometry TubeInverted Microscope

Related Articles