Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Podsumowanie

Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.

Streszczenie

Atakujące komórki raka jelita grubego (CRC) nabyły zdolność do uwalniania się od swoich siostrzanych komórek, infiltracji zrębu i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Scharakteryzowanie biologii tej fenotypowo odrębnej grupy komórek może znacznie poprawić nasze zrozumienie wczesnych zdarzeń podczas kaskady przerzutów.

Inwazja guza to dynamiczny proces, który jest ułatwiony przez dwukierunkowe interakcje między złośliwym nabłonkiem a zrębem związanym z rakiem. W celu zbadania specyficznych dla komórek odpowiedzi na granicy zrębu guza, połączyliśmy współhodowlę organotypową i techniki mikropreparacji laserowej.

Modele organotypowe, w których kluczowe składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są 3-dwukątnie współhodowane z komórkami nabłonkowymi raka, są wysoce podatnymi na manipulację narzędziami eksperymentalnymi, które umożliwiają badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa (LMD) to technika, która polega na chirurgicznym rozwarstwieniu i ekstrakcji różnych warstw tkanki nowotworowej, z precyzją na poziomie mikronów.

Łącząc te techniki z profilowaniem genomicznym, transkryptomicznym i epigenetycznym, dążymy do głębszego zrozumienia cech molekularnych atakujących komórek nowotworowych i otaczającej tkanki zrębu, a tym samym potencjalnie odkrywamy nowe biomarkery i możliwości rozwoju leków w CRC.

Wprowadzenie

Organotypowe kokultury to modele inżynierii tkankowej, które pomagają w rekonstrukcji mikrośrodowiska guza in vivo w 3 wymiarach poprzez zestawienie złośliwych komórek nabłonkowych i komórek zrębu w żelu kolagenowym zawierającym niezbędne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej^1-3. Organotypy, pomyślane głównie jako metoda pomiaru inwazji guza, zmniejszają zależność od modeli zwierzęcych in vivo i pozwalają uniknąć niedociągnięć innych technik in vitro, takich jak testy Transwella, w których inwazyjne komórki są sztucznie zmuszane do stanu monorozproszonego^2-4. Włączenie komórek zrębu do tych modeli, takich jak fibroblasty, odzwierciedla zasadniczą rolę mikrośrodowiska guza w regulacji inwazji nowotworów złośliwych i przerzutów^3-4, jednak niejednorodność fenotypowa zrębu jest taka, że aby zmaksymalizować fizjologiczne znaczenie modeli organotypowych, należy uwzględnić w miarę możliwości fibroblasty ex vivo specyficzne dla narządu, anatomicznie dokładne^3,6.

Organotypy są wszechstronną platformą do badania interakcji między komórkami nowotworowymi i zrębowymi i są coraz częściej wykorzystywane w nowatorski sposób do badania wpływu na inwazję nowotworu chemicznych inhibitorów i ukierunkowanych zmian genów^7,8. Badanie inwazyjnego marginesu guza jest szczególnie ekscytującą perspektywą. W modelach organotypowych ustalone linie komórkowe raka jelita grubego (CRC) zazwyczaj wytwarzają dobrze warstwową warstwę nabłonkową, a w przekroju poprzecznym komórki, które nabyły zdolność do inwazji na macierz zewnątrzkomórkową (ECM), są łatwo rozpoznawalne. W świetle ustalonej heterogeniczności mikrotopograficznej guza i komórek zrębu związanych z nowotworem in vivo, ekstrakcja tych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej i badanie ich w izolacji może ujawnić ważne biologiczne spostrzeżenia dotyczące pochodzenia przerzutów raka jelita grubego i tego, jak można je skuteczniej ukierunkować. Zgodnie z poniższą metodologią wszyscy pacjenci, którzy oddali próbki tkanek, wyrazili pisemną świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone przez regionalną komisję etyczną ds. badań naukowych.

Protokół

1. Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów z eksplantatów okrężnicy

1. Pobrać próbki normalnej tkanki błony śluzowej jelita grubego człowieka bezpośrednio z sali operacyjnej i zawiesić w 7-10 ml PBS uzupełnionym 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml Fungizone.
2. W laboratorium umieść próbkę na środku 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i przemyj 3 razy PBS/Pen-strep/Fungizone. Nie zasysać po ostatnim praniu.
3. Za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela pokrój tkankę na małe kawałki (około 2 mm) i umieść każdy kawałek na środku krzyża narysowanego ostrzem skalpela na 12-dołkowej płytce. Delikatnie kołysz skalpelem po tkance, aby mogła przylgnąć.
4. Hoduj próbki w 750 μl pierwotnej pożywki wzrostowej fibroblastów (DMEM uzupełniony 20% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 292 μg/ml L-glutaminy), które powinny zanurzyć tkankę, nie umożliwiając jej unoszenia się na wodzie. Unikaj naruszania talerza przez następne 5 dni, z wyjątkiem ponownego karmienia co 2 dni.
5. W ciągu najbliższych 5 dni fibroblasty powoli zaczną wyrastać z krawędzi tkanki. Po około 7 dniach będzie to bardziej widoczne. Po około 3-4 tygodniach, jeśli wyrasta wystarczająca ilość fibroblastów, dodaj 750 μl trypsyny do każdej studzienki. Po odłączeniu komórek (co może zająć 5-10 minut) należy zebrać i przenieść do kolby do hodowli tkankowej T-25.

2. Przygotowanie organotypowe

Przygotowanie żelu organotypowego impregnowanego fibroblastami:

1. Przygotować zawiesinę komórek fibroblastów zawierającą 5 x 10⁵ komórek na organotyp w DMEM, uzupełnioną 10% FCS i 292 μg/ml L-glutaminy.
2. Żele organotypowe uzupełnić na lodzie w następujących proporcjach:
   • 7 tomów Kolagenu ze Szczurzego Ogona: Matrigel mix (1:1)
   • 1 objętość filtrowanego 10x DMEM
   • 1 objętość SKO
   • 1 objętość zawiesiny komórek fibroblastów zawierającej 5 x 10⁵ fibroblastów
     Na 9 żeli (1 ml na żel) przygotuj 10 ml i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć pęcherzyków.
3. Dodać 1 ml do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze, aby żele zastygły. Po 1 godzinie dodaj 1 ml DMEM (10% FCS)/Glut na wierzch żeli i wróć na noc do inkubatora.
4. Następnego dnia należy odessać pożywkę od góry żeli i płytki 1 ml pożywki zawierającej 5 x 10⁵ komórek nabłonka CRC.

Przygotowanie arkuszy nylonowych pokrytych żelem:

5. Przygotuj wcześniej sterylne, autoklawowane arkusze nylonu o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm.
6. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść wymaganą liczbę nylonowych arkuszy w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm (zwykle w jednym naczyniu można pomieścić 4 nylonowe arkusze).
7. Uzupełnić żel na lodzie w następującej kolejności (wymagana jest całkowita objętość 250 μl na arkusz nylonu):
   • 7 tomów Kolagenu ze Szczurzego Ogona
   • 1 objętość filtrowanego 10x DMEM
   • 1 objętość SKO
   • 1 objętość DMEM 10% FCS/Glut
8. Jeśli roztwór jest żółty, zneutralizować przez dodanie 0,1 M NAOH w 50 μl podwielokrotności, aż roztwór zmieni kolor na różowy.
9. Dodać 250 μl tego roztworu do każdego arkusza nylonu i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ przez 30 minut, aby żel stwardniał.
10. Uzupełnić 1% roztwór aldehydu glutarowego w PBS. Po stężeniu żelu dodać 10 ml do każdego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
11. Arkusze nylonu prać 3x w PBS i 1x w DMEM (10% FCS)/Glu i inkubować przez noc w DMEM/Glu w temperaturze 4 °C.

Wznoszenie żeli organotypowych na stalowe siatki w celu inwazji:

12. Wstępnie przygotuj rusztowania, składając arkusze stali nierdzewnej w formację trójnogu. Autoklaw przed użyciem.
13. Użyj kleszczy wysterylizowanych w etanolu, aby umieścić stalową siatkę w każdym dołku sześciodołkowej płytki.
14. Umieść pokryty żelem arkusz nylonowy stroną kolagenową do góry na każdej siatce.
15. Ostrożnie przenieść żele organotypowe z płytki 24-dołkowej na wypukły arkusz nylonowy za pomocą szpatułki wysterylizowanej w etanolu.
16. Napełnij studzienkę DMEM 10% FCS/Glut uzupełnionym 10% FCS, aż arkusz nylonu zetknie się z medium, ale nie zostanie zanurzony. Upewnij się, że podłoże nie styka się z żelem organotypowym.
17. Inkubować przez 14 dni w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO_{2 ,} wymieniając pożywkę co 2 dni.

3. Utrwalenie organotypowe

1. Usuń cały arkusz organotypowy, w tym nylonowy, z dołka i umieść na folii spożywczej.
2. Przetnij arkusz organotypowy i nylonowy za pomocą czystego jednorazowego skalpela i utrwal obie połówki w formaldehydzie na 24 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Zastąp formaldehyd 70% etanolem po 24 godzinach i pozostaw na noc przed zatopieniem w parafinie, cięciem i barwieniem.

4. Laserowa mikrodysekcja brzegu inwazyjnego

1. Przekrój do grubości 10 μm na szkiełkach montowanych na membranie.
2. Odparafinować skrawki, nakładając ksylen na 1 minutę, następnie usunąć ksylen i utrwalić w 75% etanolu przez kolejne 1 minutę.
3. Usuń etanol i zabarwić 0,125% roztworem fioletu krezylowego przez 1 minutę. Fiolet krezylowy uwydatnia komórki nabłonkowe i umożliwia łatwą dyskryminację od zrębu.
4. Usuń fiolet krezylowy i nałóż 100% etanol na kolejną 1 minutę, a następnie spłucz 100% etanolem. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut.
5. Przeprowadź mikrodysekcję laserową przy użyciu wybranej platformy (np. systemu Leica AS).
6. Umieść szkiełko podstawowe z zabarwioną częścią przeznaczoną do mikropreparowania ekranem do dołu na stoliku mikroskopu.
7. Zamontuj probówkę mikrowirówkową o pojemności 0,5 ml w kasecie zbiorczej i dodaj 50 μl buforu do lizy komórek (np. buforu do lizy DNA, RNA lub białka) do nasadki, do której zbierze się mikrowycięta tkanka.
8. W bezpośrednim widzeniu użyj joysticka, aby zidentyfikować interesującą tkankę, a za pomocą interfejsu oprogramowania opisz wybarwioną sekcję organiczną, podświetlając komórki do mikrosekcji na froncie inwazji guza.
9. Poinstruuj laser, aby wystrzelił, co powinno zarówno wyciąć podświetloną sekcję, jak i wepchnąć mikrowypreparowaną tkankę do nasadki probówki mikrowirówkowej.
10. Po zebraniu wystarczającej ilości materiału wysuń kasetę zbiorczą, zamknij probówkę mikrowirówki i delikatnie odwiruj, aby wyciągnąć bufor do lizy na dno probówki.
11. Umieść próbki na lodzie do momentu zakończenia mikrodysekcji. Próbki należy przetworzyć odpowiednią metodą w celu ekstrakcji analitu będącego przedmiotem zainteresowania.

Wyniki

Zastosowaliśmy powyższą metodę do wielu kombinacji linii komórkowych CRC i komórek zrębowych. Jednym z przedstawionych tutaj przykładów są nabłonkowe linie komórkowe CRC SW480 z pierwotnymi ludzkimi fibroblastami okrężnicy ex vivo. Trójwymiarowe kokultury są konstruowane (ryc. 1), poddawane mikroskopii i mikrodysekcji wychwytywania laserowego (ryc. 2) i analizowane za pomocą profilowania mikroRNA (miRNA) (ryc. 3) w celu porównania różnie wyrażonych miRNA między ...

Dyskusja

Tutaj opisujemy metodę specyficznego izolowania i charakteryzowania komórek nowotworowych, które nabyły zdolność do inwazji zrębu związanego z rakiem podczas najwcześniejszych etapów progresji przerzutów w trójwymiarowym konstrukcie kokulturowym komórek nabłonka i zrębu.

Modele kohodowli składające się z komórek nabłonka CRC zestawionych z syntetycznym zrębem zawierającym ex vivo ludzkie fibroblasty okrężnicy wykorzystano do zbadania inwazji CRC w trzech wymiarach. Ten fizjologicznie ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linie komórkowe raka jelita grubego - przykład pokazany SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Kolagen	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Membrana nylonowa	Merck Millipore	VVLP01300
Siatka metalowa	Firma siatkowa	WSS20-A4
themeshcompany.com Laser Platforma mikrodysekcyjna	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Prowadnice membranowe	Urządzenia molekularne
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025