Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Atakujące komórki raka jelita grubego (CRC) nabyły zdolność do uwalniania się od swoich siostrzanych komórek, infiltracji zrębu i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Scharakteryzowanie biologii tej fenotypowo odrębnej grupy komórek może znacznie poprawić nasze zrozumienie wczesnych zdarzeń podczas kaskady przerzutów.
Inwazja guza to dynamiczny proces, który jest ułatwiony przez dwukierunkowe interakcje między złośliwym nabłonkiem a zrębem związanym z rakiem. W celu zbadania specyficznych dla komórek odpowiedzi na granicy zrębu guza, połączyliśmy współhodowlę organotypową i techniki mikropreparacji laserowej.
Modele organotypowe, w których kluczowe składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są 3-dwukątnie współhodowane z komórkami nabłonkowymi raka, są wysoce podatnymi na manipulację narzędziami eksperymentalnymi, które umożliwiają badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
Mikrodysekcja laserowa (LMD) to technika, która polega na chirurgicznym rozwarstwieniu i ekstrakcji różnych warstw tkanki nowotworowej, z precyzją na poziomie mikronów.
Łącząc te techniki z profilowaniem genomicznym, transkryptomicznym i epigenetycznym, dążymy do głębszego zrozumienia cech molekularnych atakujących komórek nowotworowych i otaczającej tkanki zrębu, a tym samym potencjalnie odkrywamy nowe biomarkery i możliwości rozwoju leków w CRC.
Wprowadzenie
Organotypowe kokultury to modele inżynierii tkankowej, które pomagają w rekonstrukcji mikrośrodowiska guza in vivo w 3 wymiarach poprzez zestawienie złośliwych komórek nabłonkowych i komórek zrębu w żelu kolagenowym zawierającym niezbędne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej1-3. Organotypy, pomyślane głównie jako metoda pomiaru inwazji guza, zmniejszają zależność od modeli zwierzęcych in vivo i pozwalają uniknąć niedociągnięć innych technik in vitro, takich jak testy Transwella, w których inwazyjne komórki są sztucznie zmuszane do stanu monorozproszonego2-4. Włączenie komórek zrębu do tych modeli, takich jak fibroblast....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów z eksplantatów okrężnicy
- Pobrać próbki normalnej tkanki błony śluzowej jelita grubego człowieka bezpośrednio z sali operacyjnej i zawiesić w 7-10 ml PBS uzupełnionym 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml Fungizone.
- W laboratorium umieść próbkę na środku 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i przemyj 3 razy PBS/Pen-strep/Fungizone. Nie zasysać po ostatnim praniu.
- Za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela pokrój tkankę na małe kawałki (około 2 mm) i umieść każdy kawałek na środku krzyża narysowanego ostrzem skalpela na 12-dołkowej płytce. Delikatnie koły....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisaną powyżej metodę zastosowano w odniesieniu do wielu kombinacji linii komórkowych CRC i komórek zrębu. Przykładem przedstawionym w niniejszej pracy są nabłonkowe linie komórkowe CRC SW480 wraz z pierwotnymi ludzkimi fibroblastami okrężnicy ex vivo. Tworzy się trójwymiarowe kokultury (Rysunek 1), które poddawano badaniom mikroskopowym i laserowej mikrodysekcji (Rysunek 2), a następnie analizowano za pomocą profilowania mikroRNA (miRNA) (Rysunek 3) w celu por.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj opisujemy metodę specyficznego izolowania i charakteryzowania komórek nowotworowych, które nabyły zdolność do inwazji zrębu związanego z rakiem podczas najwcześniejszych etapów progresji przerzutów w trójwymiarowym konstrukcie kokulturowym komórek nabłonka i zrębu.
Modele kohodowli składające się z komórek nabłonka CRC zestawionych z syntetycznym zrębem zawierającym ex vivo ludzkie fibroblasty okrężnicy wykorzystano do zbadania inwazji CRC w trzech wymiarach. Ten fizjologicznie .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie ujawniają potencjalnych konfliktów interesów.
Podziękowania
MB jest wspierany przez granty ze stypendium MRC. KP i AHM są wspierane przez dotacje z Wessex Medical Research and Cancer Research UK/RCS (England) (C28503/A10013). Jesteśmy wdzięczni za wsparcie Jednostki Badawczej Histochemii Uniwersytetu w Southampton.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Linie komórkowe raka jelita grubego - przykład pokazany SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Kolagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Membrana nylonowa | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Siatka metalowa | Firma siatkowa | WSS20-A4 | |
| themeshcompany.com Laser Platforma mikrodysekcyjna | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Prowadnice membranowe | Urządzenia molekularne | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
Bibliografia
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
