Zmodyfikowany test inwazji in vitro w celu określenia potencjalnej roli hormonów, cytokin i / lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w inwazji komórek rakowych

Podsumowanie

Ten artykuł wideo opisuje zmodyfikowaną metodę in vitro do badania roli hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu w napędzaniu inwazji komórek rakowych.

Streszczenie

Surowica krwi służy jako chemoatraktant, do którego migrują i atakują komórki rakowe, ułatwiając ich przedostawanie się do mikronaczyń. Jednak rzeczywiste cząsteczki, w kierunku których migrują komórki, pozostają nieuchwytne. Ten zmodyfikowany test inwazji został opracowany w celu identyfikacji celów, które napędzają migrację i inwazję komórek. Technika ta porównuje indeks inwazji w trzech warunkach, aby określić, czy określony hormon, czynnik wzrostu lub cytokina odgrywają rolę w pośredniczeniu w inwazyjnym potencjale komórki rakowej. Stany te obejmują i) normalną płodową surowicę bydlęcą (FBS), ii) FBS pozbawioną węgla drzewnego (CS-FBS), która usuwa hormony, czynniki wzrostu i cytokiny oraz iii) cząsteczkę CS-FBS + (oznaczoną jako "X"). Znacząca zmiana w inwazji komórek z CS-FBS w porównaniu z FBS wskazuje na udział hormonów, cytokin lub czynników wzrostu w pośredniczeniu w zmianie. Poszczególne cząsteczki można następnie dodać z powrotem do CS-FBS, aby ocenić ich zdolność do odwrócenia lub uratowania fenotypu inwazji. Ponadto dwa lub więcej czynników można połączyć w celu oceny addytywnego lub synergicznego wpływu wielu cząsteczek w napędzaniu lub hamowaniu inwazji. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta umożliwia badaczowi określenie, czy hormony, cytokiny i/lub czynniki wzrostu odgrywają rolę w inwazji komórek, służąc jako chemoatraktanty lub inhibitory inwazji dla określonego typu komórki rakowej lub określonego mutanta. Identyfikując określone chemoatraktanty i inhibitory, ten zmodyfikowany test inwazji może pomóc w wyjaśnieniu szlaków sygnałowych, które kierują inwazją komórek rakowych.

Wprowadzenie

Opracowano nowy test inwazji w celu zidentyfikowania udziału określonych hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu jako chemoatraktantów w inwazji komórek rakowych. Zdolność komórek nowotworowych do inwazji przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM) jest cechą charakterystyczną fenotypu^{przerzutowego 1-3}. Komory inwazyjne są szeroko stosowane jako narzędzia in vitro do badania inwazji i migracji komórek nowotworowych i mogą dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów inwazji i przerzutów guza in vivo. Komory składają się z cylindrycznych wkładek do hodowli komórkowych zagnieżdżonych w studzienkach płytek do hodowli komórkowych. Dna wkładów to półprzepuszczalne membrany poliwęglanowe lub polistyrenowe o określonych rozmiarach porów.

W standardowym teście inwazji, komórki są umieszczane na błonie insertowej za pomocą pożywki wolnej od surowicy i umieszczane w studzienkach do hodowli komórkowych, które są wypełnione chemoatraktantami podobnymi do surowicy lub surowicy, aby wytworzyć siłę chemoatrakcyjną. Siła ta napędza komórki do przemieszczania się przez półprzepuszczalną błonę (migracja) lub alternatywnie przez powłokę macierzy zewnątrzkomórkowej (inwazja), która może być następnie barwiona przy użyciu konwencjonalnych barwników w celu wykrycia i ilościowego określenia liczby komórek. Liczba komórek jest następnie normalizowana w zależności od zakresu migracji i inwazji w nieinwazyjnej linii komórkowej. Metoda ta pozwala badaczowi ocenić potencjał inwazyjny różnych typów komórek w różnych warunkach, w tym w przypadku manipulacji genetycznych.

Hormony, cytokiny i czynniki wzrostu są kluczowymi składnikami surowicy i coraz częściej okazuje się, że są związane z napędzaniem inwazyjnego fenotypu⁴. Jednak natura, rola i specyficzność tych chemoatrakcyjnych cząsteczek surowicy w pośredniczeniu w inwazji nadal pozostają nieuchwytne. Wyzwaniem pozostaje ustalenie, jakie konkretne czynniki w chemoatraktantach podobnych do surowicy lub surowicy są odpowiedzialne za napędzanie inwazji komórek rakowych, a także jakie cząsteczki mogą hamować proces inwazji. W niniejszym raporcie opisujemy metodologię oceny potencjalnego udziału hormonów, cytokin i/lub czynników wzrostu obecnych w surowicy jako cząsteczek napędzających chemoprzyciąganie i inwazję komórek nowotworowych.

W tym proponowanym zmodyfikowanym protokole, usuwanie hormonów, cytokin i czynników wzrostu z 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu wytworzenia 2% pozbawionych węgla drzewnego FBS (CS-FBS). Zarówno 2% FBS, jak i 2% CS-FBS są używane jako czynniki do tworzenia siły chemoatrakcyjnej do napędzania inwazji komórek rakowych. Stosowanie 2% CS-FBS jako czynnika chemoatrakcyjnego w porównaniu z normalnym 2% FBS daje kilka korzyści, w tym przede wszystkim możliwość badania fenotypu inwazji raka przy zmniejszonym/względnym braku hormonów, cytokin i czynników wzrostu. Umożliwia również badaczowi ocenę, czy zbiorowe usunięcie hormonów, czynników wzrostu i cytokin powoduje wzrost czy spadek wskaźnika inwazyjnego. Test jest następnie projektowany w celu określenia, czy dodanie pojedynczego składnika, oznaczonego jako "X", może zahamować, zmniejszyć, zwiększyć lub przywrócić wskaźnik inwazyjny do jego pierwotnej wartości (patrz rysunki 2 i 3). Chociaż metodologia ta jest specyficzna dla osiągnięcia fizjologicznych poziomów składnika, który jest usuwany z surowicy podczas usuwania węgla drzewnego, należy również zauważyć, że usuwanie węgla drzewnego może również wpływać na szlaki transdukcji sygnału. Na przykład doniesiono, że usuwanie węgla drzewnego może zmniejszać aktywność fosfatazy alkalicznej komórek osteoprogenitorowych i indukować adipogenezę poprzez redukcję aktywatorów MAPK⁵. Pożywki pozbawione węgla drzewnego są dostępne na rynku i opierają się na opisanym protokole, który łączy węgiel drzewny z dekstranem i inkubuje z płodową surowicą bydlęcą O/N⁶.

Ten test został opracowany w odpowiedzi na wynik zgłoszony przez Zuckera i wsp. ⁷ Autorzy wykazali, że zmutowany fenotyp wpływający na komunikację w węzłach szczelinowych wykazał wzrost wskaźnika inwazji podczas migracji w kierunku mediów z normalnym 2% FBS. Wzrost ten został wyeliminowany poprzez zastąpienie surowicy pozbawionej węgla drzewnego. Na podstawie tego wyniku autorzy doszli do wniosku, że ten mutant wpływa na migrację w kierunku cząsteczki lipofilowej (a dokładniej hormonu, czynnika wzrostu lub cytokiny)⁷. Powszechnie wiadomo, że hormony, czynniki wzrostu i cytokiny pośredniczą w szlakach sygnałowych zaangażowanych w promocję i inwazję guza⁴. Dlatego ważne jest, aby badacze naukowi określili, jakie czynniki napędzają inwazję guza na ich konkretne badane komórki rakowe lub mutanty. Test ma na celu określenie roli poszczególnych składników w ich stężeniu fizjologicznym, określonym zgodnie z różnicą między stężeniem składnika "X" w normalnym FBS a CS-FBS. Dzięki opracowaniu tego testu badacze mogą uzyskać lepszy wgląd w specyficzny szlak inwazyjny rządzący ich systemem.

Hormony, czynniki wzrostu i cytokiny często były klasyfikowane jako promotory nowotworów⁸. Niektóre z tych czynników, takie jak EGF, są wykorzystywane jako bezpośrednie źródła chemoatraktantów w komorach inwazyjnych⁹. W związku z tym wydaje się prawdopodobne, że reprezentują one główne składniki surowicy, które kierują inwazją guza. Protokół ten proponuje prostą, ale znaczącą modyfikację konwencjonalnego testu inwazji in vitro, która pozwala badaczowi ocenić udział hormonów, czynników wzrostu i cytokin w pośredniczeniu w inwazyjnym potencjale komórek rakowych. Test ma jednak na celu dostarczenie badaczowi odpowiedzi na pytanie, czy procedura będzie skuteczna w jego badaniu na wczesnym etapie analizy, tak aby nie zużywać cennego czasu i zasobów, jeśli zostanie uznana za niepotrzebną. Metoda ta wykorzystuje CS-FBS i opiera się na uznaniu badaczy co do tego, które cząsteczki należy ścigać jako wiodące kandydaci, które potencjalnie pośredniczą w inwazji komórek rakowych. Wyniki tych analiz powinny okazać się przydatne w określeniu, które składniki surowicy służą jako chemoatraktanty lub inhibitory dla konkretnej badanej linii komórkowej lub mutanta. Ponadto podejście to może pomóc badaczowi zidentyfikować kluczowe szlaki sygnałowe promujące lub hamujące inwazję komórek rakowych; w ten sposób ukierunkowując przyszłe projektowanie leków.

Protokół

1. Przygotuj różne nośniki i dodatkowe komponenty

1. Przed eksperymentem należy przygotować pożywkę składającą się z DMEM lub innych określonych pożywek z dodatkiem zwykłego FBS, FBS pozbawionego węgla drzewnego lub FBS pozbawionego węgla drzewnego oraz komponentu, który ma być testowany. Należy pamiętać, że w każdym eksperymencie można testować wiele komponentów.
2. Odważyć i rozcieńczyć hormony, czynniki wzrostu lub cytokiny odpowiednio, aby rozpuściły się w surowicy pozbawionej węgla drzewnego w stężeniu fizjologicznym.

2. Przygotuj matrycę kolagenową na lodzie

1. Przygotuj 2 ml matrycy kolagenu I o stężeniu 2,2 mg/ml, dodając następujące sterylne przefiltrowane składniki na lodzie: 200 μl 10x PBS (pH 7,4), 5,4 μl 1 N NaOH, 600 μl podwójnie destylowanego H₂O i 1,2 ml kolagenu I (w 3,63 mg / ml).
2. Trzymaj roztwór kolagenu I na lodzie, aż będzie gotowy do talerzyka.

3. Przygotuj płytki migracyjne/inwazyjne do testu

1. Dla każdej badanej linii komórkowej należy użyć jednej płytki z 24-dołkową komorą, w której 12-dołkowa zawiera wkładki. Użyj dodatkowych 12 studzienek, które nie zawierają wkładek, do dodania pożywki chemoatraktantu i przeniesienia wkładek do zestawu eksperymentalnego.
   UWAGA: Macierz kolagenowa na płytkach z membraną z teraftalanu etylenu (PET) i wielkością porów 8 μm jest optymalna dla stosowanych tutaj linii komórkowych. Jednak matrycę macierzową w wstępnie powlekanych płytkach można również zastąpić, a wielkość porów zmniejsza się w zależności od badanej linii komórkowej.
2. Wyraźnie oznacz płytkę, używając 3 dołków na analizowany stan (migracja FBS, migracja CS-FBS, inwazja FBS i inwazja CS-FBS, a także migracja FBS dla kontrolnej, nieinwazyjnej linii komórkowej). Migracja testu przez ruch przez pory w membranie PET i inwazja testu przez ruch przez matrycę kolagenową lub matrycową, a następnie przez pory w membranie. Użyj różnych kolorowych markerów dla każdego warunku komórki, aby wspomóc proces galwanizacji.

4. Złóż Matrycę Inwazji

1. Ostrożnie odpipetować 75 μl roztworu matrycy kolagenowej do wkładek, które mają być użyte do testów inwazji. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć bąbelków. Rozproszyć pęcherzyki, przykładając odwróconą końcówkę pipety do powierzchni.
2. Przenieść płytkę z wkładkami pokrytymi kolagenem do inkubatora o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 30 minut, aby żel zastygł.

5. Umieść komórki na błonie lub matrycy inwazji

1. W międzyczasie trypsynizuj komórki i dodaj pożywkę z 10% FBS. Wirować komórki w masie 200 x g przez 5 minut na wirówce stołowej i płukać 3x w pożywce wolnej od surowicy.
2. Zawiesić w pożywce wolnej od surowicy. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika slajdów. Dodać pożywkę wolną od surowicy do końcowego stężenia 5 x 10⁴ komórek/ml.
3. Gdy matryca kolagenowa zastygnie (po 30 minutach), dodaj 700 μl pożywki z 2% zdefiniowanym FBS lub FBS pozbawionym węgla drzewnego do każdego dołka. Z 12 wkładek na płytę:
   • 3 wkładki posiadają kolagen oraz dołki z pożywką + 2% FBS
   • 3 wkładki posiadają kolagen oraz dołki z pożywką + 2% CS-FBS
   • 3 wkładki nie posiadają kolagenu i studzienki z mediami + 2% FBS
   • 3 wkładki nie posiadają kolagenu i studzienki z mediami + 2% CS-FBS
   1. Stosować dodatkowe płytki w zależności od liczby badanych czynników i z kontrolą braku kolagenu odpowiadającą każdemu schorzeniu.
4. Dodać zawiesinę komórek do wkładek w dawce 5 x 10⁴ komórek/ml, posiewając 500 μl komórek na wstawkę we wszystkich wstawkach migracyjnych i inwazyjnych.
5. Inkubować komórki przez 22 godziny w temperaturze 37 °C.

6. Określ ilościowo liczbę migrujących i atakujących komórek

1. Ustaw barwienie studzienek za pomocą utrwalacza metanolu, eozyny i hemotoksyliny w oddzielnych studzienkach.
2. Użyj bawełnianych wacików, aby usunąć komórki i matrycę z każdej studzienki. Powtórz z drugą aplikacją wacika dla każdej studzienki.
3. Za pomocą kleszczy zanurz każdą wkładkę 5 razy na 1 sekundę w każdym z 3 roztworów po kolei.
4. Pozostaw wkładki do wyschnięcia O/N.
5. Albo i) usunąć filtry za pomocą skalpela, ostrożnie nacinając krawędzie i zamontować na szkiełku podstawowym z szkiełkiem nakrywkowym i olejkiem immersyjnym, albo ii) pozostawić wkładki do wyschnięcia odwrócone O/N i użyć wkładek bezpośrednio do mikroskopii.
6. Następnego dnia obejrzyj preparaty lub wkładki pod mikroskopem z obiektywem 20X i zrób 5 zdjęć z różnych obszarów filtra. Aby poprawić spójność, weź 4 zewnętrzne pola i jeden środek.
7. Policz komórki dla wszystkich warunków za pomocą oprogramowania ImageJ i zastosuj do poniższych formuł.
8. Określ procentową inwazję w następujący sposób:
   Średnia # komórek atakujących kolagen I wstawiam = a
   Średnia # komórek migrujących przez wstawkę kontrolną = b
   % Inwazji = (a / b) * 100
9. Określ Indeks Inwazji w 2% FBS w następujący sposób:
   % inwazji oznaczanych komórek (w 2% FBS) = c
   % inwazji kontrolnych komórek nieinwazyjnych w (2% FBS) = d
   Indeks inwazji (FBS) = (c / d)
10. Określ Indeks Inwazji w 2% CS-FBS w następujący sposób:
    % inwazji oznaczanych komórek (w 2% CS-FBS) = e
    % inwazji kontrolnych komórek nieinwazyjnych w (2% CS-FBS) = f
    Indeks inwazji (CS-FBS) = (e / f)

7. Powtórz protokół eksperymentalny porównujący FBS z węglem drzewnym z FBS + X_n z wieloma czynnikami połączonymi

1. W razie potrzeby powtórz procedurę wiele razy, używając różnych komponentów dla "X" lub kombinacji składników.
2. Zastosuj obliczenia, aby określić udział każdego czynnika "X" w skutkach migracji i inwazji.

Wyniki

Wskaźnik inwazji jest obliczany dla każdego warunku poprzez normalizację do nieinwazyjnej linii komórkowej. W naszych eksperymentach jako linie inwazyjne wykorzystujemy linię komórek czerniaka 1205Lu oraz ustalone stabilne linie wariantów, a jako logiczną kontrolę – przednowotworowy wariant nieinwazyjny WM793, z którego wywodzą się komórki 1205Lu¹⁰. Jako macierz inwazyjną stosujemy kolagen I, ponieważ jest on głównym składnikiem skóry właściwej. Jest to zgodne z wcześniejszym badaniem, w którym wykazano, że op...

Dyskusja

Przerzuty nowotworowe to proces wieloetapowy. Komórki muszą przebić się przez błonę podstawną, zostać unaczynione do układu limfatycznego lub mikronaczyń krwionośnych, w których są transportowane do odległych miejsc. Komórki nowotworowe następnie wynaczyniają się i kolonizują do makroprzerzutów¹². Progresja przez przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT), inwazja guza i przerzuty zostały wzmocnione przez hormony steroidowe^13,14, czynniki wzrostu^15-18 i cytokiny^19-21. Cząste...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wkłady kontrolne BioCoat z 8.0 i mikro; m Membrana PET	Corning	354578	12 w każdej z dwóch płytek 24-dołkowych. PET = teraftalan etylenu
Kolagen I, ogon szczura	Corning	354236	Źródło = ścięgno ogona szczura, czystość = 90%
Utrwalacz; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	Utrwalacz na bazie metanolu, hematoksylina/eozyna
Płodowa surowica bydlęca	Life	Technologies 16000	Oznaczona jako FBS
Węgiel drzewny surowicy bydlęcej pozbawionej węgla Technologie	życia Life Technologies	12676	Oznaczona jako CS-FBS
Płodowa surowica bydlęca	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	Oznaczone jako FBS
Węglowa surowica bydlęca	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	oznaczona jako CS-FBS