Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność do badania zdefiniowanych obwodów neuronowych u obudzonych, swobodnie poruszających się zwierząt ze specyficznością typu komórki, precyzją przestrzenną i wysoką rozdzielczością czasową była od dawna poszukiwanym narzędziem dla neurobiologów w poszukiwaniu na poziomie systemów obwodów neuronowych zarządzających złożonymi stanami behawioralnymi. Optogenetyka jest najnowocześniejszym narzędziem, które rewolucjonizuje dziedzinę neuronauki i stanowi jedno z pierwszych systematycznych podejść umożliwiających testowanie przyczynowe dotyczące związku między zdarzeniami sygnalizacji neuronalnej a zachowaniem. Dzięki połączeniu podejścia optycznego i genetycznego sygnalizacja neuronalna może być dwukierunkowo kontrolowana poprzez ekspresję światłoczułych kanałów jonowych (opsyn) w komórkach ssaków. Obecny protokół opisuje dostarczanie określonych długości fal światła do komórek wyrażających opsynę w głębokich strukturach mózgu obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoni w celu modulacji obwodów neuronalnych. Teoretyczne zasady transmisji światła jako rozważania eksperymentalne omówiono w kontekście wykonywania stymulacji optogenetycznej in vivo. Protokół szczegółowo opisuje projektowanie i budowę zarówno prostych, jak i złożonych konfiguracji laserowych oraz opisuje strategie uwięzi, aby umożliwić jednoczesną stymulację wielu zwierząt w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych testów behawioralnych.
Wprowadzenie
Optogenetyka zrewolucjonizowała neurobiologię na poziomie systemowym w poszukiwaniu elementów obwodów nerwowych napędzających normalne i istotne dla choroby stany behawioralne. Odkrycie, że światłoczułe opsyny mikrobiologiczne1 mogą ulegać funkcjonalnej ekspresji w komórkach ssaków, stworzyło platformę do wykorzystania światła w celu uzyskania bezprecedensowej kontroli nad aktywnością neuronalną z wysoką precyzją przestrzenną i czasową2. W przeciwieństwie do tradycyjnych elektrofizjologicznych lub farmakologicznych podejść do manipulacji aktywnością neuronalną, optogenetyka pozwala na kontrolę określonych typów komórek (w oparciu o identyfikację genetyczną lub projekcję przestrzenną) w heterogenicznych populacjach i w fizjologicznie odpowiednich skalach czasowych. Późniejsze wprowadzenie interfejsu neuronowo-optycznego dostarczyło praktycznego narzędzia do dostarczania światła do zachowujących się zwierząt3. Pozwoliło to na modulację w czasie rzeczywistym zdefiniowanych obwodów neuronalnych u obudzonych gryzoni zachowujących się w stanie czuwania w celu przyczynowego przetestowania roli tych obwodów nerwowych w zarządzaniu stanami behawioralnymi istotnymi dla chorób neurologicznych i psychiatrycznych4-6. Optogenetyka stanowi zatem potężne narzędzie, które można wprowadzić do każdego laboratorium zainteresowanego badaniem funkcjonalnego związku między aktywnością mózgu a pomiarami behawioralnymi lub fizjologicznymi w modelach zwierzęcych.
Pomyślne zaprojektowanie i zakończenie eksperymentu optogenetycznego wymaga różnych kroków i rozważań (patrz Rysunek 1). Celem obecnego protokołu jest zapewnienie osobom fizycznym narzędzi i komponentów, wraz z wiedzą teoretyczną i praktyczną, niezbędną do przeprowadzenia stymulacji optogenetycznej u rozbudzonych gryzoni zachowujących się. Obecnie istnieją dwa dominujące zakresy długości fal używane do aktywacji kanałów opsyny drobnoustrojów: w widmach niebieskich (zwykle 473 nm) i widmach zielono-żółtych (zwykle 532 lub 591 nm). Zarówno lasery, jak i diody elektroluminescencyjne (LED) mogą być używane jako źródła światła do dostarczania określonych długości fal światła do tkanki mózgowej. Niespójne światło emitowane przez diody LED utrudnia jednak skuteczną transmisję światła w przypadku sprzężenia z małymi włóknami rdzeniowymi wymaganymi do stymulacji gryzoni in vivo. Decyzja o odpowiednim montażu lasera jest kluczowym początkowym krokiem i będzie zależeć od zamierzonego zastosowania optogenetyki w laboratorium. Obecny protokół opisuje dwie podstawowe konfiguracje, które różnią się łatwością montażu i użytkowania: pojedyncze lasery sprzężone i systemy z dwoma laserami (patrz rysunek 2). Pojedyncze systemy laserowe, które są wstępnie sprzężone przez producenta, są zasadniczo gotowe do pracy po przybyciu i nie wymagają żadnej konfiguracji, ale mają tę wadę, że można je minimalnie dostosować do potrzeb użytkownika końcowego. Podwójny system laserowy umożliwia dostarczanie dwóch różnych długości fal tym samym włóknem. Stanie się to coraz ważniejsze wraz z pojawieniem się optogenetyki kombinatorycznej, w której różne długości fal mogą być wykorzystywane do aktywacji/hamowania różnych typów komórek, które są przestrzennie kolokalizowane. Jest to również niezbędne do stosowania z bistabilnymi opsynami o funkcji krokowej, w których fotoprądy są inicjowane i kończone przez odpowiednio niebieskie i żółte światło7,8. Systemy podwójnego lasera można również dostosować, ponieważ użytkownik może dodawać lub usuwać komponenty (np. zewnętrzne żaluzje, filtry wiązki, wbudowane mierniki mocy) ze ścieżki wiązki zgodnie z wymaganiami. Ze względu na swoją wszechstronność, konfiguracja z podwójnym laserem jest zalecana, jeśli optogenetyka ma być ciągłym narzędziem stosowanym w laboratorium. Sprzężenie laserów może jednak stanowić wyzwanie, dlatego w tym protokole przewidziano szybki, łatwy i niezawodny mechanizm sprzęgania. Należy pamiętać, że protokół ten szczegółowo opisuje montaż komponentów optycznych i wykorzystuje krosowe oraz komponenty, które są zoptymalizowane pod kątem światłowodów wielomodowych o indeksie krokowym z rdzeniem 200 μm i aperturą numeryczną (NA) 0,22. W sprzedaży dostępne są różne rozmiary rdzeni i NA, jednak wszystkie komponenty powinny idealnie pasować pod względem rozmiaru rdzenia i NA, aby uniknąć strat światła w punktach połączeń światłowodowych. Alternatywnie, przy połączeniu światłowodowym, światło może przechodzić od mniejszego do większego rozmiaru rdzenia; i/lub z włókna o niższym NA do włókna o wyższym NA, bez dodatkowych strat.
Strategie tetheringu pozwalają na jednoczesną stymulację wielu myszy do wysokoprzepustowych testów behawioralnych. Dostarczone protokoły zakładają użycie przewlekłych włókien wszczepialnych do testów behawioralnych, ale mogą być modyfikowane w przypadku protokołów ostrej stymulacji. Ostro wszczepione włókna są korzystne w łączeniu stymulacji optogenetycznej z manipulacją farmakologiczną, ponieważ ta sama kaniula może być używana do dostarczania leków i końcówki światłowodu w to samo miejsce. Stosowanie przewlekle wszczepionych włókien jest jednak wysoce zalecane do wielodniowych testów behawioralnych, ponieważ zmniejsza uszkodzenia tkanek związane z wielokrotnym wprowadzaniem i usuwaniem włókien oraz zwiększa dokładność pod względem spójnego umieszczania włókien w celu oświetlenia tkanek3. W połączeniu z opisanymi tutaj konfiguracjami tetheringu zachowanie może być niezawodnie rejestrowane przez wiele dni. Rzeczywiście, niezawodna transmisja światła została zgłoszona kilka miesięcy po implantacji światłowodu9, tak że paradygmaty chronicznej stymulacji i testów behawioralnych można teoretycznie przeprowadzać przez wiele dni i tygodni. Do protokołu dodano dodatkowe uwagi dotyczące komponentów sprzętowych, aby umożliwić czytelnikowi wybór najlepszego produktu, który będzie odpowiadał jego indywidualnym potrzebom, w tym opłacalnych alternatyw i produktów, które mogą być wytwarzane we własnym zakresie. Podano również ważne wskazówki, które są przydatne podczas konfiguracji i implementacji.
Protokół
! UWAGA: Protokół ten obejmuje użycie laserów klasy 3b i będzie wymagał odpowiedniego szkolenia i przestrzegania wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Podczas obsługi laserów należy zawsze nosić okulary ochronne, ponieważ procedury ustawiania stanowią szczególnie wysokie ryzyko. Skontaktuj się z dostawcą lasera, aby określić okulary, które zapewnią maksymalne tłumienie dla danego lasera. Jeśli to możliwe, zapisz się na instytucjonalny kurs szkoleniowy w zakresie bezpieczeństwa laserowego. Nigdy nie używaj lasera bez odpowiednich okularów ochronnych i przeszkolenia.
1. Konfiguracja aparatury laserowej
Tam, gdzie to konieczne, kroki w sekcji 1 są oznaczone jako (A) lub (B) w celu rozróżnienia odpowiednio między pojedynczymi lub podwójnymi systemami laserowymi.
- Przymocuj i zabezpiecz lasery do płytki stykowej. Płytki stykowe są doskonałymi przewodnikami ciepła i działają jak radiator, zapobiegając uszkodzeniom wewnętrznych elementów lasera przy długotrwałym użytkowaniu.
- (A) Przymocuj wstępnie sprzężony laser do płytki stykowej 10" x 12" (lub zgodnie z wymaganiami) za pomocą z walcowym 1/4-20" i podkładek (Rysunek 2A). Jeśli otwory na płytkę stykową nie pokrywają się z otworami montażowymi lasera, użyj małych "zacisków stołowych", aby przymocować laser do płytki stykowej.
- (B) Jeśli 2 lasery, które mają być użyte, mają bardzo różne wysokości wiązki (> ~ 1 cm), użyj małych płytek stykowych o wymiarach 4 "x 6", aby stworzyć platformę dla jednego z laserów. Przymocuj te tablice do głównej dużej płytki stykowej 12" x 18" za pomocą z walcowym 1/4-20" z podkładkami, a następnie przymocuj laser do mniejszych płyt za pomocą z walcowym lub stołu clamps, jak pokazano na rysunku 2B. Przymocuj drugi laser bezpośrednio do płytki stykowej za pomocą z walcowym lub stołu o zmiennej wysokości clamp.
Krok krytyczny: Płytki stykowe, i komponenty optyczne można kupić w wersji calowej lub metrycznej, więc bądź konsekwentny przy zakupie przedmiotów; Domyślnym parametrem dla tego protokołu jest Imperial. - (A) Podłącz krosowy z grubym płaszczem do płaskiego rozszczepiania/kontaktu fizycznego (FC/PC) do łącznika (zwanego linkiem sprzęgającym; patrz rysunek 3), który jest fizycznie przymocowany z przodu lasera (rysunek 2A).
- (B) Nakręć łącznik na słupek optyczny 3/4", a następnie pokryj żywicą epoksydową połączenie między łącznikiem a górną częścią słupka za pomocą J-B Kwik lub podobnej żywicy epoksydowej, aby zapobiec poluzowaniu i niewspółosiowości podczas użytkowania. Przymocuj słupek do płytki stykowej (ponieważ otwory na płytce stykowej nie zawsze pokrywają się z wymaganym rozmieszczeniem elementów optycznych, uchwyt słupka, adapter podstawy cokołu i widelec zaciskowy służą do zabezpieczenia słupka optycznego łącznika na miejscu). Podłącz krosowy z grubą osłoną (przewód sprzęgający) z tyłu łącznika.
- (B) Włóż pierwsze lusterko sterujące niebieskiego lasera do uchwytu kinematycznego i przymocuj je do płytki stykowej za pomocą słupka optycznego 3/4". Przymocuj ten słupek do adaptera podstawy i widelca zaciskowego. Umieść widły zaciskowe i zespół słupków bezpośrednio przed niebieskim laserem z lustrem ustawionym pod kątem 45°, aby skierować laser w kierunku lustra dichroicznego. Użyj wzoru siatki otworów na płytce stykowej jako prowadnicy zgrubnego wyrównania. Po zgrubnym ustawieniu użyj z walcowym 1/4"-20, aby przymocować clampwidelec do płytki stykowej (patrz rysunki 2B,C).
- (B) Włóż zwierciadło dichroiczne do uchwytu kinematycznego i przymocuj je do 1-calowego słupka optycznego i przymocuj bezpośrednio do płytki stykowej. Ustaw lustro dichroiczne po lewej stronie i w jednej linii z niebieskim lustrem laserowym. Ustawić lusterko dichroiczne pod kątem 45° tak, aby niebieskie światło odbite od pierwszego lusterka odbijało się od łącznika, a następnie dokręcić mocującą uchwyt kinematyczny do słupka (patrz rysunki 2B,C).
- (B) Przymocuj pierwsze lusterko kierownicze żółtego lasera do słupka optycznego 3/4". Przymocuj słupek optyczny do adaptera podstawy i clampwidelec. Ustaw widły zaciskowe i zespół słupków bezpośrednio przed żółtym laserem i ustaw lusterko pod kątem 45° tak, aby żółte światło było skierowane w kierunku drugiego lusterka kierowniczego. Zamocuj clampwidelec na miejscu za pomocą z walcowym 1/4"-20 i podkładki.
- (B) Przymocuj drugie lusterko kierownicze żółtego lasera do 1-calowego słupka optycznego. Ustaw lusterko pod takim kątem, aby wiązka światła żółtego z pierwszego lusterka została odbita przez dichroik i do sprzęgu (rysunek 2C). Przymocuj słupek bezpośrednio do płytki stykowej i dokręć mocującą, gdy lustro zostanie ustawione pod odpowiednim kątem. Precyzyjna regulacja lusterek zostanie dokonana za pomocą mocowań lusterek kinematycznych w późniejszym etapie.
- (B) Przymocuj koło filtra o neutralnej gęstości do słupka optycznego 3/4" i umieść słupek w uchwycie słupka przymocowanym do podstawy montażowej. Przymocuj zestaw do płytki stykowej między pierwszym i drugim żółtym lustrem za pomocą jednej z walcowym 1/4"-20. To koło służy do regulacji mocy żółtego światła laserowego docierającego do łącznika.
napiwek: Pojedynczo dokręć wszystkie elementy (takie jak mocujące uchwyty lusterek kinematycznych do górnej części słupków oraz gwinty mocujące adaptery podstawy do dolnej części słupków) przed przymocowaniem ich do podstawy. Użyj trzonka małego klucza imbusowego w dostarczonych otworach przelotowych w słupkach optycznych, aby uzyskać wystarczający moment obrotowy. Zapobiegnie to poluzowaniu się elementów podczas użytkowania, co wymagałoby ponownego wyrównania. - Podłącz adapter wspornika L FC/PC do FC/PC do płytki stykowej.
- Opcjonalnie: Przymocuj rozdzielacz włókien 1 x 2 50/50 mini cube bezpośrednio do płytki stykowej, aby uzyskać jednoczesną stymulację in vivo dwóch lub więcej zwierząt. Dodatkowo można dodać uchwyty, aby pomóc w przemieszczaniu zespołu płytki stykowej (jak pokazano na rysunku 2A).
2. Sprzężenie laserowe (bezdotykowe sprzężenie)
Ta sekcja dotyczy konfiguracji z podwójnym laserem (Rysunek 2B). Wyrównaj wewnętrzną ścieżkę niebieskiego lasera przed wyrównaniem zewnętrznej żółtej ścieżki lasera.
! UWAGA: Użyj złącza o słabym oświetleniu (~1 mW), aby zapewnić bezpieczeństwo oczu. Nosić okulary ochronne do włączania lasera i do momentu, gdy natężenie światła zostanie zmierzone i uznane za bezpieczne.
- Ustaw przełączniki z tyłu lasera w pozycji "Curr" (prąd) i tryb logiczny tranzystor-tranzystor (TTL)+, aby uzyskać stałe oświetlenie (w przeciwieństwie do trybu analogowego). Upewnij się, że pokrętło zasilania z przodu sterownika jest ustawione na zero. Włącz laser, włączając najpierw sterownik, a następnie lasera.
- Powoli wyreguluj pokrętło zasilania znajdujące się z przodu sterownika lasera, tak aby emitowane było światło laserowe o mocy ~1 mW. Odczekaj 10 - 15 minut (lub zgodnie z zaleceniami producenta), aż laser się rozgrzeje.
- Podłącz tester światłowodowych bezpośrednio do wolnego końca krosowego łącznika i włącz tester (Rysunek 3A). Wyreguluj kąt łącznika tak, aby czerwona wiązka biegła prosto z powrotem w kierunku środka lustra dichroicznego. Ścieżka wiązki czerwonego światła emitowanego przez tester jest dokładną drogą, którą będzie musiało podążać przychodzące światło laserowe, aby zostać sprzężone z laserem.
- Wykonaj zgrubne wyrównanie: Użyj bocznych i poziomych pokręteł na lusterkach kinematycznych, aby skierować wiązkę światła laserowego do łącznika. Zaciski cokołu mogą wymagać poluzowania, aby nieznacznie zmienić położenie lusterek i łącznika. Mocowania kinematyczne powinny mieć jeszcze pewien skok w celu dalszych precyzyjnych regulacji. Nie przejmuj się, jeśli w tym czasie z krosowego podłączonego do łącznika nie jest emitowane niebieskie światło.
- Umieść pojedynczy kawałek półprzezroczystego papieru bezpośrednio przed lustrem dichroicznym, pomiędzy dichroicznym a łącznikiem. Na tym papierze będzie zarówno niebieska, jak i czerwona kropka odpowiednio z lasera i testera. Użyj papieru, który jest wystarczająco przezroczysty, aby widzieć jednocześnie czerwone i niebieskie plamy z tej samej strony papieru.
- Dokonaj precyzyjnej regulacji pierwszego lusterka sterującego (tj. tego, które znajduje się bliżej lasera, a nie dichroicznego), ostrożnie regulując boczne i poziome pokrętła, aby wyrównać środek czerwonej kropki z niebieską kropką.
- Przesuń papier z powrotem w kierunku łącznika, tak aby znajdował się bezpośrednio przed łącznikiem i wyreguluj pokrętła na drugim (tj. dichroicznym) lustrze, aby wyrównać wiązkę laserową z wiązką czerwoną.
- Iteruj po krokach 2.6 i 2.7, aż środek niebiesko-żółtej i czerwonej belki zostanie dokładnie wyrównany w obu pozycjach (tj. do momentu, gdy czerwona i niebieska wiązka staną się współliniowe).
- Wyjmij tester z przewodu złącza. Światło laserowe powinno być teraz emitowane z końca krosowego łącznika.
- Określ wydajność sprzężenia, mierząc moc światła emitowaną przez końcówkę światłowodu krosowego łącznika za pomocą miernika mocy. Użyj ustawienia 500 mW na fotodiodzie miernika mocy i zmień ustawienie długości fali (λ) na niebieskie (473 nm) lub żółte (635 nm) widmo światła w zależności od używanego lasera.
- Umieść końcówkę światłowodu prostopadle do fotodiody, aby uzyskać odczyt mocy. Porównaj moc światła wchodzącego do łącznika z mocą światła emitowaną z końca światłowodu. Sprawność sprzężenia na poziomie >80% jest uważana za bardzo dobrą. Bardzo małe dalsze regulacje drugiego lusterka kierowniczego mogą czasami nieznacznie poprawić sprzęganie. Ogólnie rzecz biorąc, gdy wzór wiązki od końca włókna sprzęgającego jest małym, ciasnym, centralnym punktem (bez otaczających go pierścieni), wydajność sprzężenia z rdzeniem światłowodu jest optymalna.
- Powtórzyć kroki 2.1 - 2.11 dla sprzęgania żółtego lasera, z wyjątkiem użycia dwóch lusterek kierowniczych dla żółtego lasera (patrz rysunek 2C). Nie reguluj położenia lustra dichroicznego, ponieważ wyrównanie niebieskiego lasera zostanie utracone.
3. Stymulacja optogenetyczna in vivo
Upewnij się, że wszelkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i krajowymi wytycznymi oraz zatwierdzone przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
- Konfiguracja światłowodu (patrz rysunek 3B w celu identyfikacji różnych typów krosowych, o których mowa poniżej). Aby stymulować pojedynczą mysz, podłącz krosowy łącznika do krosowego z grubą osłoną za pomocą adaptera wspornika L FC/FC podłączonego bezpośrednio do płytki stykowej (patrz Rysunek 4A). Aby stymulować dwa zwierzęta z jednego lasera, podłącz krosowy łącznika do dwóch krosowych z grubą osłoną za pomocą mini kostki 1 x 2 50/50 (patrz rysunek 4B). Aby stymulować trzy lub więcej zwierząt, podłącz przewód sprzęgający do rozdzielacza światłowodowego wielomodowego za pomocą mini kostki 1 x 2 już przymocowanej do płytki stykowej (patrz rysunek 4C).
- Przymocuj komutator/złącze obrotowe do wolnych końców krosowego/rozdzielacza światłowodowego z grubym płaszczem. Komutatory są niezbędne, ponieważ umożliwiają obracanie włókna wraz z ruchem gryzonia, co zapobiega gromadzeniu się momentu obrotowego na krosowym. Zbyt duży moment obrotowy może skręcać przewody, prowadzić do ich pękania i zakłócać naturalny ruch zwierzęcia podczas testowania.
- Podłącz krosowy dla zwierząt do komutatora.
- Przymocuj dzieloną tuleję łączącą do wolnego metalowego końca tulejki krosowego dla zwierząt (Rysunek 5). Nie wciskaj tulei na siłę do końca w górę tulejki; pozostawić odsłonięte ~0,5 cm rękawa, ponieważ to właśnie on łączy się z wszczepionym światłowodem przymocowanym do zwierzęcia (Rysunek 6).
Krok krytyczny: Zawsze kupuj tuleje, które zawierają podział, aby umożliwić rozszerzenie tulei nad wszczepioną tuleją światłowodową podczas łączenia i zdejmowania. Zbyt ciasne dopasowanie może spowodować poważny uraz zwierzęcia, jeśli implant oderwie się od czaszki podczas próby odłączenia tulei od implantu. Jeśli tak się stanie, zwierzę powinno zostać usunięte z badania i otrzymać natychmiastową opiekę lekarza weterynarii. Podobnie, przed pierwszym użyciem nowej tulei, należy ją "włamać", podłączając i odłączając tuleję, aż rozłączy się z żądaną siłą.
napiwek: Łatwo jest złamać włókno podczas zdejmowania tulei, która jest mocno przymocowana do skuwki. Aby tego uniknąć, wypchnij skuwkę, wkładając mały drewniany pręt do otwartego końca rękawa (uchwyt standardowego wacika ma odpowiedni rozmiar). - Podłącz sterownik niebieskiego lasera do generatora impulsów za pomocą BNC i włącz generator impulsów.
- Załóż odpowiednie okulary ochronne. Ustaw przełączniki z tyłu lasera w trybie "Curr" i "TTL+". Upewnij się, że pokrętło zasilania z przodu sterownika jest ustawione na zero i włącz laser (najpierw włącz sterownik, a następnie lasera).
- Wyreguluj pokrętło mocy z przodu lasera tak, aby z końcówki światłowodu zwierzęcego emitowane było 5 - 10 mW, mierzone za pomocą miernika mocy światła. 5 - 10 mW to ogólna wytyczna – dokładne natężenie mocy wymagane do oddziaływania na daną objętość tkanki powinno być obliczone przed rozpoczęciem eksperymentu, jak w Aravanis i wsp. 3
- Przełącz niebieski laser w tryb "analogowy" do stymulacji in vivo. Uwaga: Żółte lasery DPSS działają w trybie TTL+, co zapewnia stałe oświetlenie. Odczekaj 10-15 minut, aż laser się rozgrzeje.
- Delikatnie przytrzymuj mysz i podłącz dzieloną tuleję na zwierzęcym krosowym do przewlekłego wszczepialnego włókna (patrz rysunek 6). Upewnij się, że końce obu włókien stykają się ze sobą fizycznie. Użyj szczeliny na tulei łączącej jako okna, aby zobrazować bezpośredni kontakt między nimi. Krok krytyczny: Czasami zanieczyszczenia mogą gromadzić się na metalowej skuwce wszczepialnego włókna zwierzęcia i zakłócać prawidłowe połączenie. W takim przypadku użyj chusteczki etanolowej, aby delikatnie wyczyścić skuwkę na głowie zwierzęcia przed przymocowaniem. Nigdy nie wciskaj tulei łączącej na siłę przez skuwkę, ponieważ może to spowodować poważne obrażenia zwierzęcia. Jeśli po oczyszczeniu nie można uzyskać fizycznego połączenia między końcami włókien, należy usunąć zwierzę z badania.
napiwek: Wyciek światła może wystąpić w punkcie połączenia między wszczepionym włóknem a zwierzęcym krosowym. Wizualizacja tego światła przez gryzonie może stanowić eksperymentalne zamieszanie10. Rurki termokurczliwe można przymocować do krosowych i nasunąć na punkt połączenia, aby zminimalizować zewnętrzne światło. - Pozwól myszy na regenerację przez kilka minut przed rozpoczęciem testów behawioralnych.
napiwek: W zależności od testu behawioralnego, który ma być przeprowadzony, najlepiej jest przyzwyczaić myszy do procesu łączenia i wiązania na uwięzi 2-3 dni wcześniej, ponieważ obchodzenie się z nim wymagane do połączenia zwierzęcia może wywołać stres i zakłócić testy behawioralne. - Umieść mysz w aparacie do testów behawioralnych, upewniając się, że przewód połączeniowy jest wolny od zaczepów. Nigdy nie zostawiaj zwierzęcia bez opieki podczas stymulacji. Nawet przy użyciu komutatorów, krosowe mają tendencję do skręcania się przez dłuższy czas i mogą zakłócać testy behawioralne.
- Użyj generatora impulsów, aby impulsować niebieski laser z określoną częstotliwością, która aktywuje wybraną opsynę. W przypadku zastosowania żółtego lasera: impulsuj żółty laser za pomocą zewnętrznych przesłon lub po prostu blokując ścieżkę wiązki nieprzezroczystym, nieodblaskowym, niepalnym przedmiotem.
4. Uwagi dotyczące stymulacji in vivo
Ta sekcja nie ma być kompletnym protokołem, ale jest oferowana jako wskazówka dla dodatkowych procedur, które powinny być rozważone po stymulacji optogenetycznej in vivo.
- Po zakończeniu eksperymentu potwierdź histologicznie rozmieszczenie wirusa i błonnika, aby uzyskać dokładną interpretację wyników behawioralnych. Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i poddaj je perfuzji lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 4% (w/v) paraformaldehydu w PBS.
- Usuń wszczepiony światłowód, mocno chwytając odsłoniętą metalową skuwkę szczypcami lub hemostatami. Pociągnij się jednym płynnym, ale szybkim ruchem. Ważne jest, aby przetestować integralność wszczepionego włókna, mierząc strumień świetlny na końcu każdego eksperymentu.
- Po utrwaleniu mózgów w paraformaldehydzie przez co najmniej 24 - 48 godzin przed przecięciem przez obszar zainteresowania. (Jeśli używasz mikrotomu do zamrażania, inkubuj mózgi w 30% roztworze sacharozy przez kilka dni przed sekcją). Przeprowadź immunohistochemię przy użyciu standardowych protokołów wykrywania odpowiednich fluoroforów znakowanych opsyną, tj. białka zielonego fluorescencyjnego (GFP), wzmocnionego białka żółtego fluorescencyjnego (eYFP) lub mCherry.
- Sprawdź miejsce ekspresji opsyny i implantu włóknistego pod mikroskopem i wizualnie potwierdź prawidłowe umiejscowienie iniekcji wirusa i implantu na podstawie wybranych współrzędnych.
Wyniki
Uzyskane wyniki behawioralne in vivo stymulacja optyczna zależy całkowicie od ukierunkowania na określony obwód nerwowy, użytego modelu zwierzęcego oraz parametrów modulacji. W celach obecnej demonstracji neurony wytwarzające dopaminę w przyśrodkowym obszarze pokrywy (VTA) myszy tyrozynhydroksylaza::Cre zostały przetransfekowane stabilnym opsynem o działaniu trwającym (SSFO)8lub wirusa kontrolnego (eYFP), a następnie wszczepiono implant światłowodowy. Użycie transgenicznych myszy TH::Cre zapewnia ograniczenie ekspresji opsyn do komórek TH+ (dopaminergicznych) w VTA. Rycina 7 przedstawia reprezentatywne wyniki behawioralne uzyskane przy użyciu opisanego obecnie układu laserowego do jednoczesnej stymulacji wielu myszy. W tym przypadku myszy były przywiązane i stymulowane jednocześnie za pomocą oddzielnych laserów (3 myszy/laser, jak w Rycina 4C) i zachowanie lokomotoryczne rejestrowano przez 1 godz. Powtarzalne podrażnianie neuronów dopaminergicznych w VTA skutkowało fenotypem hiperaktywnym, który utrzymywał się przez cały czas podrażniania. U myszy eYFP nie zaobserwowano zmian w zachowaniu lokomotorycznym (patrz Wideo 1). Po przeprowadzeniu testów behawioralnych wykonano immunohistochemię w celu potwierdzenia precyzyjnego docelowania wirusa do neuronów dopaminergicznych VTA, a poprawne umieszczenie włókna potwierdzono wizualnie (patrz Rycina 7).
Rysunek 1. Etapy doświadczenia dla in vivo stymulacja optyczna Istnieją cztery ogólne kroki związane z projektowaniem i wykonywaniem in vivo stymulacja optyczna. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje kroki związane z dostarczaniem światła ze źródła laserowego do głębokich struktur mózgu u gryzonia w trakcie badania zachowania i obejmuje: 1) montaż systemu laserowego oraz sprzęganie światła; 2) strategie przyłączania wielu zwierząt do źródła światła w celu testowania zachowania z dużą przepustowością oraz 3) wytyczne potwierdzania strategii celowania światła – krok, który jest niezbędny do interpretacji danych. Uwaga: choć ten protokół nie jest przeznaczony wyłącznie do chronicznych implantowalnych światłowodów w celach przyłączania, jest on zalecany i zakłada się jego stosowanie w połączeniu stymulacji optycznej z testowaniem behawioralnym. Zobacz zarówno Ung & Arenkiel, 201218 i Sparta i in.., 20129 do produkcji wewnętrznej i wszczepiania chronicznych światłowodów. Linie ciągłe = kroki objęte niniejszym protokołem.
Rysunek 2. Systemy laserowe wykorzystywane do in vivo stymulacja optyczna. (A) Pojedynczy system laserowy do in vivo stymulacja. Ten laser jest fizycznie wstępnie sprzężony przez producenta i wymaga niewielkiej konfiguracji ze strony użytkownika. (B) System podwójnego lasera. Dwa lasery są sprzęgane do pojedynczego światłowodu za pomocą zwierciadeł, które kierują każdą ścieżkę wiązki do sprzęgacza bezstykowego. Jest to najbardziej uniwersalne ustawienie, ponieważ elementy optyczne można usuwać lub dodawać w miarę potrzeb, jednak stanowi większe wyzwanie pod względem efektywnego sprzęgania laserów. (C) Schemat systemu z dwiema wiązkami laserowymi pokazany na (B) wskazując rozmieszczenie laserów i zwierciadeł oraz odpowiadającą ścieżkę wiązki światła laserowego (strzałki). Tutaj, zwierciadło dychroiczne “D” służy do odbijania fal światła o barwie niebieskiej, przepuszczając jednocześnie fale żółte do sprzęgacza “C” i do dołączonego przewodu łączącego. B = laser niebieski; C = sprzęgło bezstykowe; D = lustro dichroiczne; FW = tarcza filtrów; M = Lustro; Y = laser żółty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3. (A) Tester kabli używany w protokole bez fizycznego sprzęgania. Na dole: tester kabli bezpośrednio podłączony do przewodu łączącego. Wkładka przedstawia punkt połączenia testera z kablem. (B) Patch cords wspomniane w całym protokole. Od zewnątrz do wewnątrz: rozgałęźnik światłowodu wielomodowego, przewód łączący dla zwierząt w czarnej osłonie z białym tulejem rozdzielczym z cyrkonii przyczepionym do końca z płaskim ścięciem (FC), przewód łączący w grubej osłonie (nazywany również “przewód sprzęgający”). Kabliki zgrubne są pokryte rurką z polichlorku winylu (PVC) w celu dodatkowej ochrony. W przypadku tych kabli stosowane są standardowe kodowania kolorami branżowymi w celu odróżnienia różnych typów światłowodów, przy czym pomarańczowy oznacza światłowód wielomodowy. Kabliki do zwierząt mają cieńsze osłony, aby zapewnić elastyczność podczas ruchu zwierząt w trakcie testów behawioralnych. Należy pamiętać, że gdy kable nie są używane, na końcówkach FC/PC zakładane są kapturki ochronne przed kurzem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 4. Strategie wiązania dla in vivo stymulacja optyczna (A) pojedynczego zwierzęcia, (B) dwóch zwierząt; (C) trzech lub czterech zwierząt. Możliwe konfiguracje nie ograniczają się do tych pokazanych powyżej – możliwe są różne konfiguracje dzięki unikalnemu połączeniu adapterów, rozdzielaczy światłowodowych oraz przewodów rozgałęziających, dostępnych komercyjnie lub na specjalne zamówienie. Uwaga: przewody łączące i rozdzielacze światłowodowe mają złącza FC/PC na obu końcach (na rysunku pokazano tylko jeden koniec). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 5. Poprawne i niepoprawne (czerwone krzyżyki) połączenie przewodu światłowodowego z implantowanym światłowodem za pomocą rozłącznej tulejki (Lewy panel) Złącze rozdzielane z cyrkonii jest używane do połączenia przewodu łączącego z końcówką implantowanego światłowodu (pokazane tutaj bez przyczepienia do zwierzęcia). Strzałka wskazuje punkt połączenia przewodu łączącego z implantowanym światłowodem. Porównaj do (panel po prawej) gdzie występuje szczelina między przewodem łączącym a wszczepialną sondą światłowodową, co widać na podstawie rozwarstwienia połączeniowego rękawa. Zwróć uwagę na wyciek światła, który może wystąpić przy nieprawidłowym połączeniu (prawy dolny róg). Dolne wstawki na górnym lewym panelu przedstawiają używane poszczególne komponenty. Od góry do dołu: wszczepialna światłowodowa kanulka Doric, biały zirconowy rozdzielony rękaw, płaski koniec (FC) przewodu łączącego w czarnej osłonie (pełny przewód łączący pokazany na Rycina 3B). We wszystkich panelach zwróć uwagę, że tulejka łączeniowa nie jest na wprost z końcówką FC kordem złącznym. Pozostaw około 0,5 cm nadmiaru długości do połączenia z implantowanym światłowodem przymocowanym do zwierzęcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 6. Widok boczny (po lewej) i czołowy (po prawej) myszy z wszczepionym światłowodem podłączonym do przewodu łączącego. Użyj rozdzielczości na połączeniowej tulei, aby ułatwić wizualizację poprawnego połączenia przewodu łączącego z końcówką światłowodu wszczepionego. Punkt połączenia został zaznaczony czerwonym przerywanym prostokątem oraz pokazany na górnym wstawionym obrazku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 7. Przykładowe wyniki. (Lewo) Odczyt behawioralny in vivo stymulacja optyczna. Przykład zachowania, które można uzyskać za pomocą opisanego zestawu laserowego i protokołu przyłączania. Aktywność lokomotoryczną rejestrowano podczas optycznej stymulacji obszaru przyśrodkowego (VTA) u myszy z ekspresją tyrozynhydroksylazy (TH)::Cre (n = 7–8/grupa) zakażonych wirusem niosącym białko kanałowe o przedłużonym działaniu (AAV5-DIO-SSFO-eYFP) lub wirusem kontrolnym (AAV5-DIO-eYFP) w regionie VTA. Trzy myszy w każdej grupie były jednocześnie przyłączone do jednego lasera, jak pokazano na ilustracji Rycina 4C i stymulowano 5-sekundowym impulsem światła o długości fali 447 lub 473 nm, podawanym co 15 minut. Dwuczynnikowa analiza wariancji z powtarzanymi pomiarami ujawniła istotne oddziaływanie grupa x czas (F3,39 = 15,27, p < 0,0001) oraz istotny główny efekt czasu (F3,39 = 4,67, p = 0,007), przy czym stymulacja optyczna zwiększała aktywność lokomotoryczną jedynie u myszy SSFO (Bonferroni test post-hoc p < 0,05) < 0,0001, w porównaniu z oknem czasowym t = 0–15), co skutkuje ogólnym wzrostem aktywności lokomotorycznej w porównaniu z myszami eYFP (główny efekt grupy: F1,39 = 10,69, p = 0,0061; poprawka Bonferroniego, test post-hoc p < 0,01 przy t = 15–30 i p < 0,001 przy t = 30–45 i t = 45–60). Parametry światłowodu: 200 μrdzeń m, 0,22 NA. Natężenie światła = 6 – 66 mW/mm2, odpowiadające odległości końcówki światłowodu od miejsca iniekcji wirusa w zakresie 0,1–0,6 mm przy mocy światła 5 mW emitowanego z końcówki światłowodu przed przyłączeniem kabla. Słupki błędów reprezentują standardowy błąd średniej. eYFP w porównaniu z SSFO: **p < 0,01; ***p < 0,001; efekt czasu: #### p < 0.0001. (Prawo) Potwierdzenie histologiczne lokalizacji wirusa i światłowodu. Obraz fluorescencyjny uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP5 w celu wizualizacji położenia światłowodu (linia przerywana) oraz ekspresji pośredniczonej przez wirusa (zielony kolor) w dolnej części obszaru pokrywy śródmózgowia u myszy po in vivo stymulacja optyczna. Neurony dopaminergiczne (TH+) widoczne są na niebiesko. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Wideo 1. in vivo stymulacja optyczna: nadmierna aktywność podczas stymulacji VTA za pomocą SSFO u myszy TH::Cre Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.
| Tabela 1. Natężenia światła niezbędne do aktywacji powszechnie stosowanych opsyn. | ||||
| Wariant opsyny | λ | Gęstość mocy (/mm2) | Właściwości | |
| Kinetyka włączania/wyłączania | ||||
| Wzbudzenie optyczne: szybko działające kanałorodopsyny | ||||
| ChR22 | 470 | 1 – 5 mW | 1,21/12 ms | Pali z częstotliwością do 40 Hz |
| ChETA19 | 490 | 5 mW | 0,86/8,5 ms | Płonie z częstotliwością do 200 Hz |
| ChIEF20 | 450 | 1,65 mW | 1,62/12 ms | Forma niemieszkająca ChR2 |
| C1V18 | 540 - 630 | 8 mW (540 nm) | 5/34 ms przy 540 nm | Przesunięty ku czerwieni |
| 3,2 mW (630 nm) | 67 ms (włączone) przy 630 nm | |||
| Wzbudzenie optyczne: Wolno działające kanałowe rodopsyny | ||||
| Stabilna opsyna o funkcji skokowej (SFO)8 | 470/590 | 8 μW (470 nm) | 20 ms/29 min | Nowy wariant SFO; dłuższy stan otwarty. Otwierany przez 470 nm, zamykany przez 590 nm |
| Inhibicja optyczna | ||||
| eNpHR3.021 | 560 - 630 | 3 - 5 mW | 2,5 ms/<10 ms | Długotrwałe hamowanie przez 30 min22 przy stałym oświetleniu* |
| ArchT3.011,23 | 520 - 560 | 1–5 mW | 2/<10 ms | Wrażliwszy z większymi prądami fotoelektrycznymi niż eNpHR3.0 |
| Niniejsza tabela stanowi jedynie wskazówkę; konkretne wartości natężenia światła wymagane do modulacji nerwowej należy potwierdzić niezależnie. | ||||
| Weryfikacja eksperymentalna jest ważna, aby potwierdzić, że opsyna, strategia docelowa oraz parametry stymulacji światłem wpływają na pobudzanie neuronów w zamierzany sposób5. | ||||
| Gęstość mocy (mW/mm)2) odnosi się do mocy światła padającego na określoną powierzchnię tkanki mózgowej i nie odnosi się do mocy światła emitowanego z końcówki światłowodu. | ||||
| *należy zawsze stosować możliwie najniższe natężenie światła, szczególnie przy długotrwałym podrażnieniu światłem. | ||||
Tabela 1. Natężenia światła niezbędne do aktywacji powszechnie stosowanych opsyn
Skróty
AAV = wirus adeno-związany
DPSS = diodowo wzbudzany laser na ciele stałym
eYFP = wzmocniony żółty białko fluorescencyjne
FC/PC = płaskie ścięcie/kontakt fizyczny
GFP = zielony białko fluorescencyjne
PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami
PVC = polichlorek winylu
mW = miliwat
NA = apertura liczbową
SSFO = stabilna opsyna o funkcji skokowej
TH = hydroksylaza tyrozynowa
TTL = logika tranzystorowo-tranzystorowa
V = napięcie
VTA = obszar pokrywy podstawy śródmózgowia
Dyskusja
Obecnie opisywane konfiguracje laserowe i strategie uwięzi są kompatybilne z szerokim zakresem testów behawioralnych gryzoni. Rzeczywiście, po lub towarzysząc stymulacji optogenetycznej in vivo , zastosowano różne testy behawioralne, które obejmują emocjonalne zadania behawioralne, warunkowanie behawioralne, paradygmaty uczenia się i pamięci, sen, pobudzenie i zadania apetytywne, aby wymienić tylko kilka (patrz Nieh i wsp.6 w celu uzyskania kompleksowej recenzji). Optogenetyka zmieniła sposób, w jaki przeprowadza się tradycyjne testy behawioralne, ponieważ wielodniowe badania można teraz skondensować w jednej sesji, w której zachowanie jest porównywane w obrębie badanych podczas różnych epok światła "włączonego" i "wyłączonego"5. Warto zauważyć, że aparaty behawioralne, które zawierają drzwi, zamknięte przedziały lub inne przeszkody, mogą wymagać modyfikacji, aby dostosować się do przejścia włókien na uwięzi.
Opisane strategie tetheringu pozwalają na jednoczesną stymulację wielu myszy za pomocą jednego lasera. Wysokowydajne optogenetyczne testy behawioralne można zatem osiągnąć dzięki zastosowaniu wielu laserów i sprzętu testowego. Liczba zwierząt, które mogą być jednocześnie stymulowane, będzie jednak ograniczona przez maksymalną moc światła, jaką można osiągnąć na każdej końcówce włókna. Maksymalna moc wyjściowa na końcówce światłowodu zależy od 1) mocy rozruchowej lasera; 2) wydajność sprzęgania i 3) liczba podziałów belki. W przypadku niebieskiego lasera o mocy 100 mW z ~80% wydajnością sprzężenia i maksymalnie 4 podziałami wiązki (jak pokazano na rysunku 4C), średnia moc na końcówce światłowodu może wynosić od 5 do 10 mW przy użyciu rdzenia 200 μm, kabli światłowodowych 0,22 NA (uwaga, spodziewaj się, że straty transmisji ze złączy obrotowych wyniosą <15%). Pomiar strumienia świetlnego na końcówce światłowodu jest niezbędny do określenia odpowiedniej mocy świetlnej do aktywacji opsyny, ponieważ opsyny różnią się wrażliwością na światło, a tym samym gęstością mocy światła (mW/mm2) wymaganą do aktywacji11. Na przykład stabilna opsyna krokowa (SSFO) działa jak akumulator fotonów i dlatego do aktywacji wymaga bardzo małej gęstości mocy światła (<8 μW/mm2)8. Porównaj to z tradycyjną rodopsyną kanałową (ChR2), która wymaga co najmniej 1 mW/mm2 światła do wywołania potencjałów czynnościowych2. Tabela 1 służy jako skrócone odniesienie do znanych minimalnych natężeń światła wymaganych do aktywacji najczęściej używanych obecnie opsyn. Na koniec należy wziąć pod uwagę, że światło rozprasza się i pochłania, gdy przemieszcza się przez tkankę mózgową, tak że więcej energii świetlnej jest potrzebne do głębszych struktur mózgu3. Pod adresem http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php dostępny jest przydatny zasób internetowy, który obliczy natężenie światła na różnych głębokościach przez tkankę mózgową, biorąc pod uwagę rozmiar rdzenia włókna, aperturę numeryczną, długość fali użytego światła oraz początkową moc światła na końcówce światłowodu. Doskonały przegląd zasad teoretycznych leżących u podstaw tych obliczeń można znaleźć w Foutz et al. (2012)12. Przykłady zastosowania tych zasad i obliczeń do projektowania eksperymentalnego przedstawiono w Aravanis et al. (2007)3 i Tye et al. (2012)13. Wykonanie tych obliczeń przed rozpoczęciem eksperymentu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia odpowiedniego natężenia promieniowania dla aktywacji opsyny. Biorąc pod uwagę te względy, korzystne jest zakupienie laserów o większej mocy, aby zapewnić odpowiednią moc wyjściową. Lasery o mocy wyjściowej od 100 do 200 mW są na ogół wystarczające do kompensacji małych włókien rdzeniowych, pękania wielu włókien, nieefektywności sprzęgania i strat transmisyjnych7. W przypadku korzystania z laserów o dużej mocy należy jednak zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia neuronów lub artefaktów związanych z ciepłem i światłem, które mogą wystąpić przy długotrwałym i/lub silnym oświetleniu światłem7. Bezpieczny zakres dla eksperymentów in vivo wynosi do 75 mW/mm2. 14
Decyzja o rodzaju zakupionego lasera może być skomplikowana, ponieważ należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Na przykład lasery diodowe zapewniają bardziej stabilny i powtarzalny impulsowy sygnał wyjściowy niż lasery półprzewodnikowe pompowane diodami (DPSS) i są bardziej niezawodne w czasie w środowisku laboratoryjnym. Jednak w niektórych przypadkach bezpośrednie lasery diodowe mogą emitować niższą moc światła, ~0,1 mW, nawet gdy napięcie sterujące wynosi 0 V ze względu na stały prąd polaryzacji przesyłany do diody przez elektronikę sterującą lasera. Ta "spontaniczna" emisja ma szersze spektrum niż emisja laserowa z tego samego lasera, więc można ją specjalnie zmniejszyć, instalując filtr wąskoprzepustowy (lub "czyszczący") między laserem a sprzęgaczem (patrz lista części). Filtr ten zmniejszy również moc wyjściową o ~50% podczas laserowania, więc kup odpowiednio laser o większej mocy. Należy zauważyć, że żółte lasery DPSS są niezwykle czułe i mogą zachowywać się nieregularnie oraz mieć skróconą żywotność, jeśli są szybko modulowane przez generator impulsów. Regulacja mocy lasera żółtego powinna odbywać się za pomocą kół filtrów gęstości zewnętrznej umieszczonych na ścieżce wiązki (rozdział 1.7) podczas pracy lasera w trybie TTL+. Alternatywnie, zakup zielonego lasera DPSS o długości fali 532 nm jest opłacalną alternatywą, która może aktywować zarówno halorodopsyny, jak i archaerodopsyny.
Apertura numeryczna (NA) światłowodu jest ważna do rozważenia podczas projektowania i zakupu komponentów światłowodowych do montażu lasera. NA światłowodu określa kąty promieni świetlnych, które mogą być akceptowane i emitowane na końcówce światłowodu. Jeśli włókno o wyższej NA zostanie połączone ze włóknem o niższym NA, na tym interfejsie nastąpi znaczna strata, dlatego ważne jest, aby być spójnym ze światłowodem NA w ramach jednej konfiguracji (lub zapewnić, że NA wzrasta wzdłuż ścieżki światła). Wpływ włókna NA na objętość oświetlonej tkanki mózgowej jest mniej ważny, ponieważ tkanka mózgowa jest silnie rozpraszana, a światło sprzężone ze źródła laserowego będzie miało tendencję do "niedopełniania" włókien o wysokiej zawartości NA; jednak powszechnie stosowane są światłowody o NA 0,22 i 0,37. Podobnie, sprzężenie z większego rdzenia do włókna o mniejszym rdzeniu również spowoduje znaczne straty, więc zawsze upewnij się, że używasz rosnących lub równych średnic rdzenia podczas przechodzenia od źródła lasera do implantu zwierzęcego. Ogólnie rzecz biorąc, końce włókien powinny być zawsze zakryte, gdy nie są używane, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu i cząstek stałych. Dobrym pomysłem jest regularne czyszczenie końcówek i łączników światłowodów (dobrze sprawdza się 70% alkohol izopropylowy), aby zapewnić maksymalną moc wyjściową światła, a także testowanie mocy wyjściowej światła przez "atrapę implantu" przed rozpoczęciem eksperymentów każdego dnia.
Podczas testów behawioralnych konieczne jest podjęcie kroków w celu kontrolowania wpływu infekcji wirusowej, ekspresji białek egzogennych, światła widzialnego oraz możliwych efektów ogrzewania tkanek i artefaktów na zachowanie zwierząt. Dlatego właściwa grupa kontrolna powinna składać się ze zwierząt transdukowanych wirusem kontrolnym (np. GFP, eYFP, mCherry), które otrzymują identyczne parametry stymulacji świetlnej. Weryfikacja eksperymentalna jest kluczowym ostatnim krokiem, ponieważ dane behawioralne wykorzystywane do analizy są całkowicie zależne od prawidłowego rozmieszczenia opsyny i światłowodu w obszarze zainteresowania. W szczególności u zwierząt, u których nie wykryto żadnego sygnału immunohistochemicznego lub u których umieszczenie sygnału lub włókna nie znajduje się w obszarze zainteresowania, dane behawioralne dla tego zwierzęcia powinny zostać usunięte z eksperymentu. Dodatkowo konieczne jest przetestowanie strumienia świetlnego na końcówce światłowodu zarówno przed implantacją chirurgiczną, jak i ponownie po sekcji zwłok, aby zapewnić odpowiednią moc światła do aktywacji opsyny. U zwierząt, u których po doświadczeniach nastąpiła znaczna utrata światła przez włókno (>30%)9, należy rozważyć usunięcie danych dotyczących tego zwierzęcia. Kryteria usuwania powinny być ustalane a priori. Na koniec należy wziąć pod uwagę częstotliwość impulsów wymaganą do modulacji odpalania neuronów, która będzie zależeć od struktury mózgu i podtypów neuronów, które są celem ataku. Opublikowane parametry optogenetycznej stymulacji światłem istnieją dla wielu podtypów neuronów, jednak zdolność do modulowania odpalania neuronów powinna być niezależnie potwierdzona za pomocą zapisów elektrofizjologicznych in vivo lub wycinków mózgu.
W miarę jak ktoś nabiera wprawy w używaniu lasera i modyfikacji ustawień laserowych, kombinacje różnych długości fal mogą być przywiązane do wielu włókien na jednym zwierzęciu lub dostarczane tym samym włóknem w optogenetyce kombinatorycznej8. Stymulacja na wielu długościach fal będzie stawać się coraz ważniejsza, biorąc pod uwagę szybki rozwój rodosyn kanałowych przesuniętychku czerwieni 8, inżynierię hiperpolaryzujących opsyn z przesunięciem ku błękitowi15, zastosowanie bistabilnych opsyn o funkcji krokowej8,16,17 i ogólną rozszerzającą się listę opsyn z wyraźnymi widmami aktywacji11. To rozszerzenie zestawu narzędzi optogenetycznych pozwoli na bezprecedensową kontrolę wielu podtypów neuronalnych zarówno w obrębie obszarów mózgu, jak i między nimi, w celu określenia ich roli w zarządzaniu złożonymi stanami behawioralnymi.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.
Podziękowania
Te badania były finansowane z grantów otrzymanych od NIH (MH082876, DA023988).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1. Zestaw laserowy | |||
| 100 mW 473nm lub 488nm System lasera diodowego, < 2% Stabilność (ilość: 1) | Omicron | Luxx/Phoxx 473/488-100 | Opcjonalne akcesorium zawiera pilot zdalnego sterowania skrzynka z przełącznikiem kluczykowym i wyświetlaczem LED |
| 100 mW 594nm laser DPSS (ilość: 1) | Colbolt | 0594-04-01-0100-300 | seria 04-01 żółty laser; wrażliwy na odbicie wsteczne z włókien |
| 200 mW 532 nm laser DPSS; 5% stabilności mocy (ilość: 1) | Shanghai Lasers | GL532T3-200 | Ekonomiczna alternatywa dla żółtego lasera DPSS do aktywacji halorodopsyn i archaerodopsyny |
| Bezkontaktowy laser do wielomodowego łącznika światłowodowego (ilość: 1) | OZ Optics | HPUC-23-400 / 700-M-20AC-11 | Do użytku z podwójnym laserem; Specyfikacja: 33 mm OD dla 400 - 700 nm; Gniazdo FC, obiektyw f = 20 mm z adapterem głowicy laserowej do montażu na słupku #11 |
| Aluminiowa płytka stykowa, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Gwintowane (ilość: 1) | Thorlabs | MB1213 | Do podwójnego systemu laserowego |
| Aluminiowa płyta stykowa, 10 "x 12" x 1/2". 1/4"-20 Gwintowane (ilość: 1) | Thorlabs | MB1012 | Do pojedynczego systemu laserowego |
| Aluminiowa płyta stykowa, 4 "x 6" x 1/2", 1/4"-20 Gwintowane (ilość: 2) | Thorlabs | MB4 | Do niebieskiego lasera; podwójny system laserowy |
| Kompaktowy zacisk o zmiennej wysokości, 1/4"-20 Gwintowany (ilość: 4) | Thorlabs | CL3 | |
| 3/4" (ilość: 1) | Słupek ze stali nierdzewnej Thorlabs | TR075 | |
| 1" (ilość: 4) | Thorlabs | TR1 | |
| ze sprężynową blokadą sześciokątną śruba skrzydełkowa (ilość: 2) | Adapter podstawy cokołu Thorlabs | PH1 | |
| (ilość: 3) | Thorlabs | BE1 | |
| (ilość: 3) | Thorlabs | CF1253 | |
| Montaż kinematyczny do optyki 1" z widocznym lustrem o jakości laserowej (ilość: 3) | Thorlabs | KM100-E02 | |
| Koło gęstości filtra neutralnego (ilość: 1) | Thorlabs | NDC-50C-2M | |
| 1" Longpass zwierciadło dichroiczne 50% (ilość: 1) | Thorlabs | DMLP505 | |
| Montaż kinematyczny do optyki 1" (ilość: 1) | Thorlabs | KM100 | Do lustra dichroicznego |
| 20-częściowy zestaw kluczy imbusowych ze stojakiem (ilość: 1) | Thorlabs | TC2 | |
| 1/4"-20 śruba z walcowym i zestaw osprzętu (ilość: 1) | Thorlabs | HW-KIT2 | |
| Podstawa montażowa 1" x 2.3" x 3/8" (ilość: 1) | współpracująca z Thorlabs | BA1S | |
| FC/PC do FC/PC L-Bracket (ilość: 2) | Uchwyt Thorlabs | ADAFCB1 | Dual FC/PC L dostępny również |
| Uchwyty do podnoszenia listwy stykowej (ilość: 3) | Thorlabs | BBH1 | |
| Ø 1" Filtr pasmowo-przepustowy, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (ilość: 1) | Thorlabs | FB450-10 | Do stosowania z laserami diodowymi, które spontanicznie emit |
| 2. Sprzężenie laserowe | |||
| ! Okulary ochronne do lasera (ilość: 1 dla każdego użytkownika na każdej długości fali) | Różne | ! Skonsultuj się z dostawcą lasera, aby upewnić się, że jest prawidłowo dobór okularów, które zapewnią maksymalne tłumienie światła dla zakupionego lasera | |
| Tester światłowodowych (ilość: 1) | Eclipse | 902-186N | |
| Jednoetapowy środek do czyszczenia złączy światłowodowych (ilość: 1) | łącznik Thorlabs | FBC1 | |
| (0,75 metra) (ilość: 1) | Thorlabs | 0,75 m 200 μ m rdzeń, 0.22 NA, złącza FC/PC światłowody wielomodowe; do podwójnego systemu laserowego | |
| Łącznik krosowego (0,5 metra) (ilość: 1) | Thorlabs | 0,5 m 200 μ rdzeń M, 0,22 Na, złącza FC/PC, wielomodowe; do pojedynczego systemu laserowego | |
| Doric mini cube (ilość: 2) | DORIC | DMC_1x2_FC-2FC | |
| Kompaktowa konsola licznika mocy i energii (ilość: 1) | Thorlabs | PM100D | Digital 4" LCD |
| C-series slim czujnik mocy 5 - 500 mW (ilość: 1) | Thorlabs | S130C | Dostępnych jest wiele typów detektorów; sprawdź z vendor |
| 3. In vivo Stymulacja optogenetyczna | |||
| Wielomodowe rozdzielacze światłowodowe (ilość: 2) | FONT Canada | Rozdzielacz światłowodowy 1 x 2 z dużym rdzeniem, stosunek 50/50, złącza FC, wzmocnione. Długość, rozmiar rdzenia i aperturę numeryczną można określić przy składaniu zamówienia; Opłacalne Dostępne mniejsze rozmiary rdzeni | |
| Generator funkcji przebiegu arbitralnego (2 kanały) (ilość: 1) | Rigol | DG1022 | Może sterować do 2 laserów jednocześnie |
| Światłowodowe złącze obrotowe (komutator) (ilość: 6 - 8) | DORIC* | FRJ_1X1_FC-FC* | Dostępne również przez Thorlabs i Prizmatix |
| krosowe dla zwierząt (niestandardowa kaniula światłowodowa mono z tulejkami 10 mm, złącze FC / PC) (ilość: 8) | DORIC | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | Długość, rozmiar rdzenia i przysłona numeryczna mogą być określone przy składaniu zamówienia; Alternatywnie, te mogą być wykonane na zamówienie we własnym zakresie (patrz Sparta et al. 2012)9. |
| Ceramiczna tuleja dzielona PFP, średnica wewnętrzna 2,5 mm, długość 11,40 mm (25 / opakowanie) (ilość: 1) | Światłowód precyzyjny Produkty | SM-CS1140S1 | Służy do mocowania wszczepionego światłowodu na zwierzę do dostarczającego światło światłowodowego z płaska końcówka cleeve (FC) |
| Przezroczyste osłony przeciwpyłowe do Ø Okucia 2,5 mm (25/szt.) (ilość: 1) | Thorlabs | CAPF | |
| Metalowa nasadka do tulei współpracujących FC/PC i FC/APC (ilość: 1) | Thorlabs | CAPF1 | |
| krosowe z grubym płaszczem (na zamówienie) (ilość: 4) | Thorlabs | 200 μ m rdzeń, 0.22 NA, złącza FC/PC światłowody wielomodowe; Długość, rozmiar rdzenia i aperturę numeryczną można określić przy zamówieniu |
Bibliografia
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).
- Sidor, M. M. Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders. J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).
- Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors. Brain Res. 1511, 73-92 (2013).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477, 171-178 (2011).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).
- Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Res. 1511, 21-32 (2013).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nat Methods. 9, 159-172 (2012).
- Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron. J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).
- Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).
- Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463, 98-102 (2010).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K. Bi-stable neural state switches. Nat Neurosci. 12, 229-234 (2009).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. J Vis Exp. , e50004(2012).
- Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13, 387-392 (2010).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Goshen, I., et al. Dynamics of retrieval strategies for remote memories. Cell. 147, 678-689 (2011).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).
Przedruki i uprawnienia
