Modele spontanicznej progresji choroby raka nerkowokomórkowego z przerzutami (RCC) mogą być używane do oceny leczenia w klinicznie istotnych warunkach. Protokół ten demonstruje różne procedury ortotopowej implantacji komórek nowotworowych nerki, prawidłowej nefrektomii, a na koniec przedstawia przewodnik po sekcji zwłok do wizualnej i bioluminescencyjnej oceny obciążenia i lokalizacji przerzutów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego (mRCC) u myszy po nefrektomii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednym z kluczowych wyzwań dla lepszego testowania nowych eksperymentalnych terapii raka nerkowokomórkowego (RCC) jest opracowanie modeli, które wiernie odwzorowują wczesne i późne stadium progresji choroby przerzutowej. Typowe modele implantacji guza wykorzystują ektopową lub ortotopową implantację guza pierwotnego, ale niewiele z nich obejmuje układową spontaniczną chorobę przerzutową, która naśladuje warunki kliniczne. Protokół ten opisuje kluczowe kroki do rozwoju etapów progresji choroby RCC podobnych do pacjentów. Po pierwsze, wykorzystuje wysoce przerzutową linię komórek nowotworowych myszy w modelu syngenetycznym, aby pokazać ortotopową implantację komórek nowotworowych. Metody obejmują powierzchowną i wewnętrzną implantację do przestrzeni podtorebkowej za pomocą komórek połączonych z matrigelem, aby zapobiec przeciekaniu i wczesnemu rozprzestrzenianiu się. Następnie opisano procedury wycinania nerki zawierającej nowotwór (nefrektomia), z krytyczną opieką przed i po operacji na myszach. Na koniec przedstawiono kroki niezbędne do monitorowania i oceny progresji choroby mikro- i makroprzerzutowej, w tym obrazowanie bioluminescencyjne, a także przedstawiono szczegółowy wizualny przewodnik po sekcji zwłok w celu oceny rozkładu chorób ogólnoustrojowych. Celem opisu tego protokołu jest ułatwienie powszechnego stosowania klinicznie istotnych modeli przerzutowego raka nerkowokomórkowego w celu poprawy wartości predykcyjnej przyszłych badań terapeutycznych.
Wprowadzenie
Główną przyczyną śmiertelności u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym (RCC) jest ogólnoustrojowa choroba przerzutowa, która zwykle występuje po chirurgicznym usunięciu guza pierwotnego rosnącego w nerce. Jednak bardzo niewiele przedklinicznych modeli nowotworów oceniających eksperymentalne terapie u myszy obejmuje chorobę przerzutową, a jeszcze mniej wiernie oddaje kliniczne etapy zlokalizowanego wzrostu, operacji oraz spontanicznej inicjacji i progresji mikroprzerzutów 1-3. Ta luka w testach staje się coraz ważniejsza w ocenie nowych terapii, ponieważ czasami uderzające efekty przeciwnowotworowe obserwowane w modelach zwierzęcych nie zawsze przekładały się na podobnie skuteczne leczenie pacjentów 4. Takie różnice w wynikach mogą wynikać z różnic w skuteczności leków między zlokalizowanymi ektopowymi lub ortotopowymi modelami guza pierwotnego a późnym stadium choroby przerzutowej 5-7. W przypadku RCC tylko w kilku badaniach zastosowano ustalone protokoły na zwierzętach, które obejmują spontaniczne nawroty choroby, które naśladują pacjentów, którzy zazwyczaj mieli całkowicie lub częściowo usunięte nerki zawierające guz 2,3. Przyczyny tego braku w testowaniu modeli mysich są różne. Po pierwsze, istnieje wysoki koszt zwierzęcy i nieodłączna zmienność selekcji komórek nowotworowych i potencjału przerzutowego. Na przykład ludzkie linie komórkowe nerki mają tendencję do rzadkich przerzutów i muszą być selekcjonowane w wielu rundach ortotopowej implantacji pierwotnej i selekcji przerzutowej, aby uzyskać warianty, które konsekwentnie rozprzestrzeniają się i tworzą odległe zmiany (patrz opis takiej ludzkiej linii komórkowej wyprowadzonej 8-10). I odwrotnie, komórki myszy w modelach immunokompetentnych mają tendencję do agresywnego zachowania, a niskiej liczbie komórek należy wstrzyknąć matrigel, aby zmniejszyć natychmiastowe rozprzestrzenianie się ogólnoustrojowe 3. Po drugie, trudności techniczne w wykonaniu prawidłowej implantacji, resekcji chirurgicznej (nefrektomii) oraz śledzeniu (i ilościowym) spontanicznego wzrostu przerzutów mogą być wyzwaniem, a przy stosowaniu tej techniki należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych zmiennych (szczegóły w Dyskusji). Celem tego protokołu jest opisanie podstawowych etapów (a także potencjalnych pułapek) implantacji ortotopowej, resekcji (nefrektomii) i monitorowania spontanicznej przerzutowej choroby RCC oraz zaoferowanie wytycznych do standaryzowanego (i szerszego) stosowania w laboratoriach naukowych, które oceniają skuteczność eksperymentalnych środków terapeutycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Ortotopowa implantacja guza nerki
- Hodowla komórkowa
- Przed implantacją ortotopową należy wyhodować mysie komórki RENCALUC jako monowarstwę do 75% konfluencji.
- Po trypsynizacji i ponownym zawieszeniu w pożywce zawierającej 5% FBS, odwirować komórki z prędkością 1 000 obr./min, 4 °C przez 5 minut, powtarzając 3 razy, aby przemyć w PBS. Następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce bez surowicy do stężenia 5 x 104 RENCALUC/5 μl pożywki bez surowicy.
Uwaga: W zależności od użytego wariantu lub linii komórkowej, komórki mogą być ponownie zawieszone w stosunku 1:1 pożywki wolnej od matrigelu i surowicy, aby spowolnić bardzo agresywny wzrost i rozprzestrzenianie się komórek myszy po implantacji.
- Chirurgia i implantacja komórkowa
Uwaga: Wszystkie opisane w nim badania na zwierzętach, w tym utrzymanie i określenie eksperymentalnych punktów końcowych, zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) zatwierdzonym przez Roswell Park Cancer Institute.- Znieczulij jedną mysz Balb/C za pomocą izofluranu (2-3%). Uszczypnij stopę i sprawdź, czy nie ma odruchu, aby zapewnić wystarczające znieczulenie. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Umieść mysz w prawej pozycji bocznej i ogol lewą stronę między przednią a tylną kończyną. Nałóż alkohol i jod wzdłuż grzbietowej części lędźwiowej, aby aseptycznie przygotować obszar do nacięcia.
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych rozpocznij 1 cm nacięcie skóry w kierunku wzdłużnym między ostatnim żebrem a stawem biodrowym. Poluzuj tkankę łączną pod skórą za pomocą nożyczek do preparowania. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj 0,5 cm nacięcie w kierunku wzdłużnym w ścianie brzucha. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie docisnąć otwartą ranę – spowoduje to uzewnętrznienie nerki i pozwoli na delikatne unieruchomienie narządu przed wstrzyknięciem.
- Załadować do strzykawki Hamilton 5 μl przygotowanej mieszaniny komórek. W przypadku implantacji podtorebkowej można zastosować dwie metody implantacji:
- Powierzchowne: Biegnąc równolegle do nerki zorientowanej podłużnie, wprowadzić igłę pod torebkę nerkową (ale powyżej miąższu) skośną krawędzią do góry. Po umieszczeniu igły należy wstrzyknąć wszystkie komórki, aż utworzy się mały biały pęcherzyk. Powoli wyjąć igłę z kapsułki i natychmiast osuszyć wstrzyknięcie sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby wchłonąć wszelkie wycieki i zapobiec rozprzestrzenianiu się komórek.
- Wewnętrzne: Ze ściętą krawędzią do góry i zaczynając od strony nerki przeciwnej do końcowego miejsca implantacji, wprowadzić igłę przez wnętrze nerki, aż igła będzie widoczna (ale nie przebijająca) przestrzeni podtorebkowej. Wstrzyknij wszystkie komórki, aż utworzy się biała bańka i miejsce wstrzyknięcia wymazu, aby zapobiec wyciekowi.
- Delikatnie przywróć nerkę do jamy ciała. Zamknij ścianę brzucha za pomocą wchłanialnego szwu 5-0 Vicryl. Po zakończeniu ściągnij warstwę skóry do siebie i umieść 2-3 klipsy do ran. Upewnij się, że klipsy są mocne i równomiernie rozmieszczone, aby nie było odsłoniętych ran. Przed rekonwalescencją należy podać podskórnie 500 μl 0,9% NaCl i 100 μl buprenorfiny (0,01 mg/ml) za pomocą igły 25 G. Rutynowo monitoruj rozmieszczenie i stabilność klipsa i usuń go po 10 dniach.
2. Nefrektomia/Usunięcie guza pierwotnego
- Należy postępować zgodnie z identycznym protokołem znieczulenia, unieruchomienia, nacięcia i odsłonięcia nerki u myszy, jak opisano w sekcjach 1.2.1 i 1.2.2 (powyżej).
- Użyj drugiej pary kleszczy, aby odizolować nerkę, delikatnie usuwając łączącą tkankę tłuszczową z końca ogonowego i nadnercza z czaszkowego końca nerki. Delikatnie chwytając nerkę, użyj wchłanialnego szwu 5-0 Vicryl, aby utworzyć podwójny węzeł wokół moczowodu, tętnicy nerkowej i żyły. Powoli zabezpiecz, a następnie przeciąć nad węzłem, aby usunąć nerkę. Jeśli wystąpią jakiekolwiek oznaki natychmiastowej utraty krwi lub istnieje ryzyko niewystarczającego uchwycenia szwu na moczowodzie, tętnicy i żyle, użyj kauteryzatora zamiast nożyczek, aby przeciąć powyżej węzła.
- Po usunięciu nerki dokładnie sprawdź, czy nie ma krwawienia z zawiązanej tętnicy i w razie potrzeby użyj kauteryzatora. Zamknij ścianę brzucha za pomocą 5-0 Vicryl. Ściągnąć warstwę skóry i umieścić 2-3 klipsy do ran, zachowując te same środki ostrożności, jak opisano w 1.2.4. Ściśle monitoruj zwierzę codziennie po operacji pod kątem oznak niepokoju, krwawienia lub ograniczonej mobilności. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi bezpieczeństwa zwierząt.
3. Monitorowanie progresji i lokalizacji przerzutów w punkcie końcowym
- Kwantyfikacja choroby z przerzutami: monitorowanie bioluminescencyjne
- Patrz metodologia opisana wcześniej w JOVE do monitorowania przerzutów przy użyciu komórek transfekowanych lucyferazem i oznaczanych ilościowo za pomocą systemu obrazowania Xenogen IVIS 11,12.
- Wizualny przewodnik po sekcji zwłok do oceny porównawczej rozmieszczenia przerzutów
- Składanie zwierząt w ofierze zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi przy użyciu punktów końcowych, w tym oznak niepokoju, trudności w oddychaniu, utraty wagi itp.
Uwaga: Ścisłe monitorowanie zwierząt ma kluczowe znaczenie, ponieważ spontaniczna progresja przerzutów może być bardzo zmienna i szybka. - Użyj nożyczek chirurgicznych, aby zainicjować nacięcie nad cewką moczową, które biegnie w górę klatki piersiowej do dolnej żuchwy. Użyj nożyczek, aby oddzielić skórę od mięśnia ściany brzucha.
- Zainicjuj nacięcia wzdłuż rąk i nóg. Oderwij skórę. Dokładnie zbadaj powięź skóry i ścianę brzucha pod kątem guzków, a następnie powierzchowne węzły chłonne: pachwinowe, ramienne, pachowe i powierzchowne szyjne.
- Wykonaj nacięcie w ścianie brzucha i przetnij wzdłuż lewej i prawej bocznej strony aż do przepony. Jednym poziomym cięciem usuń przednią część ściany brzucha, aby odsłonić wnętrzności.
- Zbadaj niezakłócony wygląd wnętrzności pod kątem rażąco zauważalnych guzów. Zwróć również uwagę na zawartość żołądka i jelit; Jeśli są puste, mysz mogła nie być w stanie jeść. Jeśli zawartość jest ciemna, może to wskazywać na krwotok z górnego/dolnego odcinka przewodu pokarmowego.
- Wizualnie oceń każdy narząd pod kątem obecności lub braku guza, przypisując łączny wynik dla każdej grupy myszy (4 zwierzęta na grupę są używane jako przykład na rysunku 1D-i).
Uwagi: 1) Powiększenie węzłów chłonnych niekoniecznie oznacza, że jest to wzrost guza; Jeśli jest duży, bardzo jędrny i ma białawy kolor, prawdopodobnie jest to guzek przerzutowy. 2) Nadmierna mleczna lub mętna ciecz w jamie brzusznej wskazuje na wodobrzusze. Wodobrzusze może obejmować stałe nagromadzenia na narządach jamy brzusznej, szczególnie między płatami wątroby a żołądkiem. 3) W przypadku narządów, takich jak płuca, może występować wiele guzków, które można policzyć do celów porównań między poszczególnymi zwierzętami (patrz na przykład 13). - Zidentyfikuj poważne guzy lub nieprawidłowości poszczególnych narządów jamy brzusznej: wątroby, śledziony, nerek i trzustki, ostrożnie usuwając i myjąc PBS z butelki do spryskiwania.
- Po usunięciu narządów jamy brzusznej należy sprawdzić węzły chłonne jamy brzusznej, w tym węzeł chłonny lędźwiowy, krzyżowy, nerkowy i krezkowy.
- Oceń przeponę pod kątem objawów rozprzestrzeniania się przerzutów.
Uwaga: Rozległe rozproszenie na przeponie może spowodować utratę kurczliwości, co prowadzi do utrudnienia lub utraty oddechu. - Usuń przeponę i wykonaj dwa boczne nacięcia w jamie piersiowej, usuwając część czołową, aby odsłonić płuca i serce.
- Usuń płuca i serce, delikatnie chwytając i podnosząc przełyk oraz przecinając tchawicę nad sercem. Oceń tkanki pod kątem guzków. Ściśnij serce. Brak sprężystej konsystencji może wskazywać na obecność guza.
- Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć liniowo czaszkę. Delikatnie usuń małe kawałki czaszki, aż cały mózg zostanie odsłonięty. Szukaj w całym mózgu widocznych guzków lub nieprawidłowości, przebarwień.
- Składanie zwierząt w ofierze zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi przy użyciu punktów końcowych, w tym oznak niepokoju, trudności w oddychaniu, utraty wagi itp.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1A przedstawia schemat opisujący procedury szczegółowo omówione w tym podsumowaniu protokołu. Na każdym etapie należy wziąć pod uwagę kilka istotnych czynników. Na przykład w Kroku 1 pokazano dwie metody implantacji komórek nowotworowych do przestrzeni podtorebkowej nerki. Komórki nowotworowe można implantować do przestrzeni podtorebkowej, tworząc małą białą pęcherzykową strukturę potwierdzającą lokalne umieszczenie komórek, zapobiegając wyciekowi poprzez ostrożne wyjęcie igły i przetarcie nadmia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem tego protokołu jest ocena klinicznie istotnej spontanicznej choroby przerzutowej przy użyciu syngenicznego modelu guza myszy w celu opisania technik implantacji/resekcji. Obecnie większość badań przedklinicznych oceniających nowe eksperymentalne terapie nie obejmuje badań nad chorobą przerzutową, a tylko nieliczne podsumowują etapy wzrostu guza pierwotnego, resekcji chirurgicznej i ewentualnego spontanicznego rozprzestrzeniania się przerzutów. Do tej pory genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) wygenerowane w ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni laboratorium dr Roberta S. Kerbela (University of Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Kanada) za pomoc techniczną i ekspertyzę w rozwoju tej procedury. Chcielibyśmy również podziękować dr Sandrze Sexton i Departamentowi Laboratoryjnych Zasobów Zwierzęcych Instytutu Raka w Roswell Park. Praca ta została wsparta nagrodą przyznaną przez Roswell Park Alliance Foundation (dla JMLE).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM-wysoki poziom glukozy z Pyr. I L-Glutamina | Corning | 10-013-CV | |
| FBS | Invitrogen | 10437-028 | |
| 0,25% Trypsyna EDTA | Corning | 25-053-CL | |
| 1x DPBS bez wapnia & Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | musi być trzymany na lodzie |
| Maść okulistyczna ze sztucznymi łzami i smarem | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
| Kieszonkowy trymer dla zwierząt | Braintree scientific | CLP9931B | |
| Wacik nasączony alkoholem | VWR | 326895 | |
| wacik z roztworem betadyny | VWR | 67618-152-01 | |
| MICRO DISSECTING sissors proste, - Ostrza 25 mm - 4.5" | Southpointe chirurgiczne | kleszcze do tęczówki RS-5982 | |
| , ząbkowane, zakrzywione, INS15915 | naukowe Kent | potrzebują dwóch z tych | |
| 10 i mikro; l Strzykawka Hamilton | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 G, 45 stopni, igła RN | Hamilton | 7803-07 | |
| Sterylny aplikator z bawełnianą końcówką | VWR | 10805-144 | |
| Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej | Kent scientific | INS500392 | |
| 5-0 powlekany Vicryl, konwencjonalna igła do cięcia | Ethicon | J834 | |
| Aplikator do klipsów Reflex do klipsów 7 mm Kent | scientific | INS500343 | |
| Klipsy refleksyjne, 7 mm, niesterylne | Kent scientific | INS500344 | |
| Kleszcze do usuwania, długość 12 cm | Kent scientific | INS500347 | |
| 0,9% Chlorek sodu | Baxter Healthcare | 2B1322 | |
| Buprenorfina 0,01 mg/ml | |||
| Igła 25 G 5/8" | VWR | BD305122 | |
| strzykawka 1 ml bez igły | VWR | BD309659 | |
| D-Luciferin | Gold Bio | LUCK-1G |
Bibliografia
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma. Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).
- Amagai, Y., et al. Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models. Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).
- Steeg, P. S., et al. Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).
- Guerin, E., Man, S., Xu, P. A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs. Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).
- Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin. Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).
- Ebos, J. M., Kerbel, R. S. Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).
- Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice. Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice. Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).
- Saiki, I., et al. Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Ebos, J. M., et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).
- Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences. Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
