Artykuł metodologiczny

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

DOI:

10.3791/51506

⸱

31 sierpnia 2014

 ,  , 
1Emory Vaccine Center at Yerkes National Primate Research Center, Emory University, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeneza HIV-1 jest definiowana zarówno przez cechy wirusa, jak i czynniki genetyczne gospodarza. W tym miejscu opisujemy solidną metodę, która pozwala na powtarzalne pomiary w celu oceny wpływu zmienności sekwencji genu gag na zdolność replikacji wirusa in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ochronny wpływ wielu alleli HLA klasy I na patogenezę HIV-1 i postęp choroby jest częściowo przypisywany ich zdolności do celowania w konserwatywne części genomu HIV-1, które z trudem się wydostają. Zmiany sekwencji przypisywane komórkowemu ciśnieniu immunologicznemu pojawiają się w całym genomie podczas infekcji, a jeśli zostaną znalezione w konserwatywnych regionach genomu, takich jak Gag, mogą wpływać na zdolność wirusa do replikacji in vitro. Przenoszenie polimorfizmów związanych z HLA w Gag do niedopasowanych biorców HLA wiąże się ze zmniejszoną wartością zadaną wiremii. Przypuszczaliśmy, że może to być spowodowane zmniejszoną zdolnością replikacji wirusa. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską metodę oceny replikacji in vitro wirusa HIV-1 pod wpływem genu gag wyizolowanego z ostrych punktów czasowych od Zambijczyków zakażonych podtypem C. Metoda ta wykorzystuje klonowanie oparte na enzymach restrykcyjnych w celu wprowadzenia genu gag do powszechnego szkieletu prowirusa HIV-1 podtypu C, MJ4. To sprawia, że jest bardziej odpowiedni do badania sekwencji podtypu C niż poprzednie metody oparte na rekombinacji, które oceniały replikację in vitro przewlekle uzyskanych sekwencji gag-pro. Niemniej jednak protokół może być łatwo zmodyfikowany do badań nad wirusami z innych podtypów. Co więcej, protokół ten szczegółowo opisuje solidną i powtarzalną metodę oceny zdolności replikacji chimerycznych wirusów Gag-MJ4 na linii komórek T opartej na CEM. Metoda ta została wykorzystana do badania chimerycznych wirusów Gag-MJ4 pochodzących od 149 podtypów C ostro zakażonych Zambijczyków i pozwoliła na identyfikację reszt w Gag, które wpływają na replikację. Co ważniejsze, wdrożenie tej techniki ułatwiło głębsze zrozumienie, w jaki sposób replikacja wirusa definiuje parametry wczesnej patogenezy HIV-1, takie jak wartość zadana wiremii i podłużny spadek limfocytów T CD4+.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie zarówno cech gospodarza, jak i wirusa, które wpływają na patogenezę HIV-1 i postęp choroby, jest kluczowe dla racjonalnego projektowania szczepionek. Komórkowa odpowiedź immunologiczna jest kluczowym elementem ludzkiej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie HIV-1. Cytotoksyczne limfocyty T (CTL) są niezbędne do wstępnej kontroli ostrej wiremii i umożliwiają gospodarzowi ustalenie stanu ustalonego (wartości zadanej) wiremii1,2. Eksperymentalne zubożenie tych komórek efektorowych powoduje utratę kontroli nad wirusem3,4. Mimo to w genomie wirusa powstają mutacje ucieczki, które podważają rozpoznawanie CTL komórek zakażonych wirusem5-9.

Niektóre allele HLA są związane z niższymi wiremiami i wolniejszym postępem choroby, w tym B*57, B*27 i B*8110-15. Część korzyści ochronnych alleli HLA klasy I można przypisać faktowi, że są one ukierunkowane na funkcjonalnie ograniczone regiony genomu, takie jak Gag, i wybierają mutacje ucieczki, które zmniejszają zdolność wirusa do replikacji in vitro16-21. Chociaż ucieczka z komórkowego układu odpornościowego jest korzystna dla wirusa w kontekście selekcji allelu HLA klasy I, efekt tych mutacji może mieć zróżnicowane konsekwencje dla gospodarza po transmisji na osobę niedopasowaną do HLA22,23. W związku z tym zrozumienie wpływu przenoszonych mutacji ucieczki związanych z HLA na zdolność replikacji wirusa będzie ważne dla pogłębienia naszej wiedzy na temat wczesnej patogenezy HIV-1.

Chociaż poczyniono duży postęp w identyfikowaniu i charakteryzowaniu defektów dopasowania poszczególnych mutacji ucieczki związanych ze specyficznymi allelami HLA klasyI 24-29, naturalnie występujące izolaty HIV-1 mają unikalne i złożone ślady polimorfizmów związanych z HLA, prawdopodobnie wynikających z ciśnienia immunologicznego o różnym podłożu immunogenetycznym za pośrednictwem HLA30. W poprzedniej analizie Goepfert i wsp. wykazały, że akumulacja mutacji związanych z HLA w przekazywanych sekwencjach Gag pochodzących od 88 ostro zakażonych Zambijczyków wiązała się ze zmniejszeniem wartości zadanej wiremii31. Sugeruje to, że przenoszenie szkodliwych mutacji ucieczki, szczególnie w Gag, do biorców niedopasowanych do HLA zapewnia korzyści kliniczne i może być spowodowane osłabioną replikacją wirusa. Idąc dalej, konieczne jest zbadanie, w jaki sposób złożone kombinacje polimorfizmów Gag w naturalnie występujących izolatach współpracują ze sobą w celu zdefiniowania cech przenoszonego wirusa, takich jak zdolność replikacji, oraz jak wczesna replikacja może z kolei wpływać na parametry kliniczne HIV-1 i późną patogenezę.

Brockman i wsp. po raz pierwszy wykazali związek między zdolnością replikacji sekwencji gag-pro wyizolowanych podczas przewlekłej infekcji a wiremią zarówno w podtypie C, jak i B infekcji32-35. Podejście eksperymentalne przedstawione w tych badaniach, chociaż odpowiednie do badania zdolności replikacji in vitro sekwencji pochodzących od osób przewlekle zakażonych, ma kilka technicznych zastrzeżeń i ograniczeń, które utrudniają badanie zdolności replikacyjnych HIV-1 u osób z ostrym zakażeniem podtypem C. Metoda ta opiera się na rekombinacji populacyjnych sekwencji amplifikowanych PCR do podwirusa NL4-3 podtypu B, który pochodził częściowo z LAV, laboratoryjnie zaadaptowanego zapasu wirusa36. Wytwarzanie wirusa osiągnięto poprzez jednoczesną transfekcję linii komórek T37 opartej na CEM z amplikonami PCR i strawionym DNA delta-gag-pro NL4-3. Metoda ta wymaga wzrostu wirusa w okresie od tygodni do miesięcy, co może zniekształcić charakter odzyskanego zasobu wirusa w stosunku do quasi-gatunku wirusa in vivo, a tym samym zmienić pomiar zdolności replikacji in vitro. Metoda ta jest bardziej odpowiednia do badania osób przewlekle zakażonych, gdzie skutecznie selekcjonuje wirusa o najwyższej zdolności replikacji i gdzie klonowanie wielu różnych wariantów wirusa od dużej liczby osób przewlekle zakażonych jest dość pracochłonne, a zatem niewykonalne. Jednak u osoby z ostrym zakażeniem na ogół obecny jest jeden do dwóch wariantów, a zatem wyeliminowanie ryzyka wypaczenia charakteru odzyskanego zasobu wirusa poprzez presję selekcyjną in vitro pozwala na dokładniejszą ocenę zdolności replikacji in vitro. Po drugie, metoda ta wymaga ponownego połączenia sekwencji gag-pro podtypu C w szkielet pochodzący z podtypu B i może wprowadzić do analizy błędy niezgodności kręgosłupa. Ze względu na te ograniczenia, duża liczba sekwencji musi być analizowana w celu przezwyciężenia wszelkich potencjalnych wprowadzonych uprzedzeń.

Tutaj opisujemy alternatywne podejście eksperymentalne odpowiednie do badania sekwencji pochodzących od osób zakażonych podtypem C. Używamy strategii klonowania opartej na enzymach restrykcyjnych, aby wprowadzić gen gag pochodzący z punktów czasowych ostrej infekcji osób zakażonych HIV-1 podtypem C do podtypu C rdzenia prowirusa, MJ4. Wykorzystanie MJ4 jako wspólnego szkieletu, w którym można klonować geny gag, ma kluczowe znaczenie dla analizy sekwencji pochodnych podtypu C. MJ4 pochodzi z pierwotnego izolatu38, a zatem byłoby mniej prawdopodobne, że wprowadzi błąd systematyczny z powodu niezgodności podtypu między genem szkieletowym a genem gag. Ponadto podejście polegające na zastosowaniu klonowania restrykcyjnego opartego na enzymach pozwala na bezpośrednią transfekcję konstruktów prowirusowych do komórek 293T oraz na odzyskanie klonalnego zapasu wirusa identycznego ze sklonowaną sekwencją gag.

Metoda przedstawiona poniżej to metoda o wysokiej przepustowości do oceny zdolności replikacji chimerycznych wirusów Gag-MJ4 pochodzących z podtypu C. Transfekcja do komórek 293T jest prosta, a powrót do zdrowia wirusa trwa tylko trzy dni. Zdolność replikacji in vitro jest testowana na tej samej linii komórek T opartej na CEM-CCR5, stworzonej przez Brockmana i wsp.37, ale przy użyciu ważnych modyfikacji protokołu niezbędnych do pomyślnej replikacji chimerycznych wirusów MJ4 podtypu C. Zastosowanie odpowiedniej linii limfocytów T, a nie PBMC, pozwala na przetestowanie dużej liczby wirusów chimerycznych MJ4 podtypu C z wysoką powtarzalnością testu. Wreszcie, użycie znakowanego radioaktywnie testu odwrotnej transkryptazy do ilościowego oznaczania wirusa w supernatancie jest bardziej opłacalne niż stosowanie dostępnych na rynku zestawów ELISA p24. Daje również wyższy zakres dynamiki, co było ważne dla wykrywania zarówno słabo, jak i wysoce replikujących się wirusów w ramach tego samego testu oraz dla wykrywania subtelnych różnic w replikacji między izolatami.

Podsumowując, przedstawiona tutaj metoda pozwoliła na dogłębne badanie zdolności replikacji sekwencji gagowych pochodzących od osób zakażonych podtypem C HIV-1 z Zambii i jak napisano, może być również rozszerzona do badania innych populacji zakażonych podtypem C. Zaobserwowano duży stopień zmienności zdolności replikacyjnych między różnymi izolatami Gag. Ponadto udało nam się wykazać statystyczny związek między zdolnością replikacji przenoszonego Gag a nastawą wiremii, a także ze spadkiem CD4 + w okresie trzech lat39. Wyniki te podkreślają znaczenie badania, w jaki sposób przenoszone cechy wirusa, takie jak zdolność replikacji, oddziałują z układem odpornościowym gospodarza, wpływając na patogenezę we wczesnym okresie infekcji i będą stanowić integralną rolę w opracowywaniu skutecznych interwencji szczepionkowych, a także leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Amplifikacja genu HIV-1 gag z zakażonego, zamrożonego osocza

  1. Ekstrakcja wirusowego RNA ze 140 μl rozmrożonego osocza zakażonego wirusem HIV-1 za pomocą zestawu do ekstrakcji.
    1. Jeśli to możliwe, natychmiast przystąp do syntezy cDNA po ekstrakcji RNA, ponieważ niezamrożone wirusowe RNA daje najlepsze wyniki amplifikacji. Jeśli to możliwe, przygotuj główną mieszankę PCR do pierwszej rundy amplifikacji DNA i przechowuj w temperaturze 4 °C przed ekstrakcją wirusowego RNA.
  2. Odwrotna transkrypcja cDNA z RNA i amplifikacja produktów DNA pierwszej rundy przy użyciu odwrotnej transkryptazy i termostabilnej polimerazy DNA w jednoetapowym RT-PCR.
    1. Wyjmij RNA z zamrażarki o temperaturze -80 °C (jeśli konieczne było zamrożenie) i krótko rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić w zimnym bloku. Przenieść 5 μl RNA do każdej probówki PCR zawierającej 45 μl mieszanki wzorcowej, aby uzyskać końcową objętość 50 μl. Pozostałe próbki RNA należy natychmiast umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    2. Po dodaniu enzymu do głównej mieszanki pierwszej rundy PCR (tabela 1A), podwielokrotność 45 μl do każdej cienkościennej probówki do amplifikacji PCR dla pożądanej liczby reakcji. Upewnij się, że używasz probówek do PCR z indywidualnymi nakrętkami, a nie z paskami, aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie krzyżowe między próbkami. Umieść probówki PCR w zimnym bloku, aby chronić wrażliwy na temperaturę enzym RT i matrycę RNA. Uwaga: Próbki należy pobrać w trzech egzemplarzach w celu odpowiedniego pobrania próbek quasispecies wirusa. Ważne jest również, aby wykorzystać produkt z enzymem polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zminimalizować błędne włączenie wprowadzone przez PCR. Proszę zapoznać się z listą odczynników, aby uzyskać zalecany produkt.
    3. Po dodaniu matrycy RNA do wszystkich probówek reakcyjnych, należy przenieść probówki PCR do termocyklera w celu amplifikacji przy użyciu programu cyklera opisanego w tabeli 1B. Uwaga: Produkt tej amplifikacji zostanie użyty w drugiej rundzie zagnieżdżonego PCR.
  3. Wykonać zagnieżdżoną amplifikację PCR w drugiej rundzie, używając 1 μl amplifikacji PCR w pierwszej rundzie (1.2) jako matrycy DNA.
    1. Porcję 49 μl głównej mieszanki drugiej rundy PCR (tabela 2A) do każdej cienkościennej probówki do PCR w celu uzyskania pożądanej liczby reakcji. Przenieść 1 μl z amplifikacji PCR w pierwszej rundzie do każdej probówki reakcyjnej, aby uzyskać końcową objętość 50 μl. Uwaga: Będzie to służyć jako matryca DNA do amplifikacji w drugiej rundzie. Ważne jest również, aby wykorzystać polimerazę DNA o bardzo wysokiej wierności i możliwościach korekty, aby zminimalizować błędną inkorporację wprowadzoną przez PCR. Proszę zapoznać się z listą odczynników, aby uzyskać zalecany produkt.
    2. Przenieść mieszaninę reakcyjną drugiej rundy PCR do termocyklera i uruchomić program opisany w tabeli 2B. Uwaga: Po zakończeniu programu produkty tej reakcji zostaną uruchomione na żelu agarozowym w celu potwierdzenia produkcji produktu.
  4. Dodać 3 μl 5-krotnie obciążającego barwnika do 5 μl 50 μl objętości reakcji drugiej rundy i uruchomić pod napięciem 120 V na 1% żelu agarozo-TAE zawierającym barwienie DNA fluorescencyjnym promieniami UV, aż prążki się rozpęczątką. Wizualizuj pasma 1,6 kb na iluminatorze światła niebieskiego (patrz rysunek 1A).
  5. Uruchomić pozostałą objętość reakcyjną 45 μl na 1% żelu agaroza-TAE zawierającym barwienie DNA i wyciąć odpowiednie pasma czystą żyletką.
    1. Wyekstrahować DNA z wycinka żelu za pomocą zestawu do oczyszczania żelu, wymyć w wodzie wolnej od nukleaz, połączyć trzy pozytywne reakcje na osobę i zamrozić produkt w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.

2. Przygotowanie amplikonów gagowych do klonowania poprzez wprowadzenie niezbędnych miejsc z ograniczeniami

  1. Amplifikować część plazmidu MJ4 z długim powtórzeniem końcowym (LTR)/5' UTR (patrz Tabela 3).
  2. Wizualizuj produkty PCR o wielkości 1,3 kb na iluminatorze, amplikony dodatnie akcyzy, oczyszczanie żelu i zamrażanie, jak opisano wcześniej (1.4,1.5; patrz rysunek 1B).
  3. Stwórz stopione amplikony MJ4 LTR-gag za pomocą PCR "spaw-zakładka-rozszerzenie" (patrz Tabela 4).
  4. Uwidocznić, wyciąć, oczyścić i zamrozić amplikony 3,2 kb, jak w 1.4,1.5 (patrz rysunek 1C).

3. Klonowanie wzmocnionych genów knebla do MJ4, podtyp C, zakaźny klon molekularny

  1. Trawić 1,5 μg plazmidu MJ4 i 1,5 μg oczyszczonego produktu PCR LTR-gag za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BclI (wrażliwej na metylację) przez 1,5 godziny w temperaturze 50 °C (patrz Tabela 5A).
  2. Dodać 1 μl NgoMIV do reakcji wytrawiania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Dodaj 5-krotny barwnik ładujący do reakcji trawienia restrykcyjnego i powoli elektroforezuj całkowitą objętość na 1% żelu agaroza-TAE zawierającym barwnik żelowy DNA przez 1-2 godziny przy 100 V. Wizualizuj, wycinaj i oczyszczaj wskazane prążki do klonowania, jak opisano wcześniej (patrz rysunek 2).
  4. Przygotuj reakcje ligacji przy użyciu oczyszczonej wkładki LTR-gag i DNA wektora MJ4 w stosunku 3:1 insertu do wektora. Reakcje ligacji inkubować przez noc w temperaturze 4 °C (patrz tabela 5B).
  5. Przekształć chemicznie kompetentne bakterie JM109 za pomocą produktów ligacji i rozprowadź na płytkach agarowych LB za pomocą 100 μg/ml ampicyliny i rosły w temperaturze 30 °C przez 22+ godziny.
    1. Rozmrażać kompetentne komórki JM109 na lodzie przez 15 minut. Oznaczyć 1,5 ml probówek do mikrowirówek i schłodzić na lodzie.
    2. Podać 50-100 μl komórek JM109 do wstępnie schłodzonych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Dodać 2,5-5 μl reakcji ligacji do komórek JM109, lekko przesuwając probówkę do wymieszania i natychmiast wracając do lodu. Inkubować właściwe komórki z produktem ligacji na lodzie przez 30 minut.
    3. Szok termiczny 1,5 ml probówek mikrowirówkowych zawierających kompetentne komórki JM109 i reakcję ligacji w bloku grzewczym o temperaturze 42 °C przez 45 sekund i powrót do lodu na co najmniej 3 minuty.
    4. Dodać 50 μl pożywki SOC do każdej probówki mikrowirówkowej i umieścić całą reakcję przemiany na płytkach LB-agar o temperaturze pokojowej uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny.
    5. Przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 30 °C i pozostawić na 20 godzin lub do momentu, gdy kolonie będą wyraźnie uformowane.
  6. Wybierz izolowane kolonie i hoduj w 4 ml LB ze 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 30 °C przez 22+ godziny.
  7. Odwiruj kultury w ilości 3 200 x g przez 15 minut, odlej bulion i wyekstrahuj plazmidowe DNA.
  8. Aby potwierdzić wierność klonowania, należy przeciąć miniprep DNA enzymami restrykcyjnymi NgoMIV i HpaI w podwójnym trawieniu w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Analizować na 1% żelu agaroza-TAE (patrz Tabela 5C).
  9. Sekwencjonuj region wstawienki LTR-gag każdego plazmidu przy użyciu następujących starterów: GagInnerF1, GagF2, Rev1, Rev3 i GagR6 (Tabela 6), aby potwierdzić tożsamość sekwencji.
  10. Porównaj uzyskane sklonowane sekwencje z sekwencjami populacji pochodzącymi z początkowego oczyszczonego amplikonu z 1.5.1. Uwaga: Ważne jest, aby ostatecznie ocenić zdolność replikacji dwóch niezależnych klonów w celu zapewnienia, że wszelkie fenotypy replikacji in vitro nie są spowodowane błędami szkieletu wprowadzonymi podczas procesu klonowania.

4. Generowanie i miareczkowanie replikacji kompetentnych wirusów chimerycznych Gag-MJ4

  1. Wygeneruj wirusa kompetentnego do replikacji poprzez transfekcję 1,5 μg chimerycznego plazmidu MJ4 miniprep DNA do komórek 293T przy użyciu stosunku 4:1 Fugene HD, jak opisano przez Prince'a i wsp. 39.
  2. Miano zebrało zapasy wirusa na komórkach TZM-bl, jak opisano poniżej oraz w Prince i wsp. 39.
    1. Płytkie komórki TZM-bl 24 godziny przed zakażeniem wirusem, aby następnego dnia uzyskać 30-40% zlewającą się monowarstwę komórek. Zwykle można to osiągnąć, dodając 5 x 104 komórek w całkowitej objętości 800 μl na dołek w 24-dołkowej płytce.
    2. Po dodaniu komórek do dołka delikatnie przesuwaj 24-dołkową płytkę do przodu i do tyłu, a następnie z boku na bok, aby skutecznie rozprowadzić komórki. Nigdy nie obracaj – spowoduje to gromadzenie się komórek w środku płytki.
    3. Następnego dnia przygotuj 1% FBS w DMEM; zostanie on użyty do rozcieńczenia DEAE-Dekstranu i rozcieńczenia zapasów wirusa. Podstawowy DEAE-Dextran wynosi 10 mg/ml lub 125x, a pożądane jest końcowe stężenie 80 μg/ml lub 1x.
    4. Z zamrażarki w temperaturze -80 °C wyjąć materiał z wirusem do badania i umieścić na shakerze do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
    5. Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć zapasy wirusa na okrągłodennej kulturze tkankowej poddanej działaniu 96-dołkowej płytki z pokrywką. Jest to protokół 3-krotnego rozcieńczenia. Schemat rozcieńczania znajduje się w tabeli 7.
    6. Usuń pożywkę z 24-dołkowych płytek TZM-bl z nasionami za pomocą aspiratora próżniowego, uważając, aby nie naruszyć monowarstwy komórek. Pożywkę należy usuwać tylko z jednej płytki 24-dołkowej na raz, aby komórki nie wyschły.
    7. Dodaj 150 μl 1x DEAE-Dekstran + 1% FBS w mieszaninie DMEM do każdego dołka za pomocą pipety 1,000 μl. Nie należy używać wielokrotnych pipet, ponieważ powoduje to uszkodzenie monowarstwy.
    8. Dodać 150 μl każdego rozcieńczenia wirusa do odpowiedniego studzienki. Dodaj wirusa do środka studzienki i delikatnie zamieszaj, aby równomiernie rozprowadzić wirusa w monowarstwie komórki. Inkubować zakażone komórki przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    9. Po 2-godzinnej inkubacji dodać 0,5 ml 10% FBS w DMEM do każdej studzienki i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 48 godzin.
    10. Po 48 godzinach komórki powinny być w 100% zlewne. Ponieważ MJ4 jest wirusem kompetentnym do replikacji, nastąpi pewna śmierć komórki, ale należy się tego spodziewać.
    11. Usunąć pożywkę z każdej studzienki i dodać 400 μl/studzienkę roztworu utrwalającego (patrz Tabela 8A dla przepisu). Napraw tylko jedną płytę na raz. Dodać roztwór utrwalający za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i odstawić na 5 minut w temperaturze pokojowej.
    12. Usunąć roztwór utrwalający i przemyć 3x PBS z Ca2+/Mg2+. Użyj butelki ze spryskiwaczem, aby delikatnie dodać PBS z boku studzienki, aby uniknąć przerwania monowarstwy. Po trzecim praniu osuszyć płytkę na chłonnym papierze.
    13. Dodać 400 μl/basenik roztworu barwiącego (patrz tabela 8B dla przepisu) do każdego dołka na płytce 24-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny. Dopuszczalne są dłuższe czasy inkubacji, ale czasy inkubacji powinny być utrzymywane na stałym poziomie między doświadczeniami z określaniem miana.
    14. Przemyć 2x PBS z Ca2+/Mg2+ i naciąć na infekcję lub dodać PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego nacięcia. Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do czterech dni, o ile monowarstwa jest nawodniona.
    15. Aby ocenić infekcję, użyj markera permanentnego, aby podzielić dołki 24-dołkowej płytki na ćwiartki. Policz wszystkie niebieskie komórki w polu widzenia, używając całkowitego powiększenia 200X, raz w każdym z czterech kwadrantów studni.
    16. Oblicz jednostki zakaźne na μl w następujący sposób: [(# niebieskie krwinki/4) x 67] / (dodano μl wirusa) = IU/μl. Patrz Tabela 8C, aby uzyskać informacje na temat objętości w μl wirusa dodanego do każdej studzienki. Uśrednij kilka studni razem; Liczby powinny być stosunkowo podobne, aby zapewnić dokładne miareczkowanie.

5. Przygotowanie pożywek hodowlanych i rozmnażanie komórek GXR25 do testu replikacji in vitro

  1. Przygotuj pełne RPMI (cRPMI) do propagacji komórek GXR25. UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby hodować komórki GXR25 co najmniej 4 miesiące przed planowanymi eksperymentami replikacyjnymi (patrz Tabela 9).
  2. Dziel komórki 1:10 dwa razy w tygodniu i utrzymuj gęstość komórek między 1 x 105 do 2 x 106 komórek/ml.

6. Replikacja in vitro chimer Gag-MJ4 w komórkach GXR25 (CEM-CCR5-GFP)

  1. Dzień przed zakażeniem należy podzielić komórki na stężenie 2-3 x 105 komórek/ml tak, aby w dniu zakażenia znajdowały się w logarytmicznym wzroście.
  2. W dniu zakażenia usunąć zapasy wirusa z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić. Obliczyć objętość wirusa potrzebną z każdego stada na podstawie miana IU/μl z testu komórkowego TZM-bl w celu zakażenia 5 x 105 komórek GXR25 przy wielokrotności infekcji 0,05, stosując wzór:
    Objętość wirusa do zakażenia (μl) = 1 μl/X IU x 0,05 x 500 000
    UWAGA: Wybraliśmy MOI równy 0,05, ponieważ powoduje to logarytmiczną fazę wzrostu dla wszystkich testowanych przez nas wirusów. Ważne jest, aby przeprowadzić wstępne eksperymenty w celu określenia optymalnego MOI w celu uchwycenia logarytmicznego wzrostu wirusa, który ma być testowany.
  3. Rozcieńczyć wirusa w cRPMI do objętości 100 μl (w celu uzyskania 0,05 MOI) i dodać do dołka na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu kultury tkankowej V-Bottom. Uwaga: W każdym zestawie eksperymentów replikacyjnych należy uwzględnić zarówno pozytywną (zakażone MJ4 WT), jak i negatywną (pozorowane zakażone komórki) kontrolę. Ustaw płytę tak, aby co druga kolumna była pusta, aby ograniczyć zanieczyszczenie krzyżowe między studzienkami. Kontrola pozytywna jest konieczna, ponieważ zostanie później wykorzystana jako wzorzec do normalizacji nachyleń replikacji, które są miarą szybkości replikacji kontrprób eksperymentalnych.
  4. Policz komórki GXR25 za pomocą automatycznego licznika komórek. Oblicz łączną liczbę komórek potrzebnych do wszystkich infekcji (5 x 10,5 x # infekcji). Podwielokrotność wymaganej objętości przelać do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować do granulowania komórek. Zawsze kalkuluj na 25% więcej infekcji niż to konieczne.
  5. Ostrożnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić w cRPMI w stężeniu 5 x 105 komórek/100 μl.
  6. Odpipetować komórki do sterylnego koryta i dokładnie wymieszać. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej rozcieńczonego wirusa. Dokładnie wymieszaj.
  7. Dodać 2 μl 5 mg/ml (100x) roztworu polibrenu do każdej studzienki i dokładnie wymieszać komórki.
  8. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych z 5% CO2 przez 3 godziny.
  9. W celu umycia zainfekowanych komórek należy odwirować 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do komórek osadkowych. Następnie ostrożnie usuń 150 μl pożywki i zastąp ją świeżymi 150 μl cRPMI bez naruszania osadu komórkowego. Powtórz jeszcze 2 razy (łącznie z wirowaniem), aby wystarczająco umyć komórki.
  10. Po ostatnim odwirowaniu i dodaniu 150 μl cRPMI, ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pipety wielokanałowej i dodać całą mieszaninę komórka/wirus (około 200 μl) z każdej studzienki niezależnie do 800 μl cRPMI do dołka z 24-dołkową płytką do hodowli tkankowej.
  11. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  12. Co dwa dni usuwać 100 μl supernatantu z powierzchni dołka hodowlanego i przenosić na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U i przechowywać zamrożone w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia testu ilościowego wirusa. UWAGA: Staranne ułożenie supernatantów w 96-dołkowych płytkach pozwoli na wielokanałowy transfer supernatantów z hodowli pipetą podczas kwantyfikacji wirionów za pomocą znakowanego radioaktywnie testu odwrotnej transkryptazy (RT). Każda płytka powinna zawierać próbki z wzorca infekcji w celu normalizacji zmienności między płytkami w odczycie testu RT.
  13. Po usunięciu każdej próbki o objętości 100 μl należy podzielić komórki w stosunku 1:2, dokładnie ponownie zawieszając komórki i usuwając połowę pozostałej objętości (450 μl). Przywróć pierwotną objętość (1 ml), dodając 550 μl świeżego cRPMI do każdej studzienki.

7. Analiza odwrotnej transkryptazy (RT) w supernatantach hodowli komórkowych

Protokół zaadaptowany z Ostrowski et al40.

  1. Zainstaluj kaptur bezpieczeństwa biologicznego w obiekcie BSL-3 do użytku z materiałami radioaktywnymi.
    1. Umieść papier chłonny w kapturze i wymień aspirator na aspirator przeznaczony do użytku radioaktywnego. Uwaga: Wszystkie odpady radioaktywne muszą być odpowiednio utylizowane zgodnie z przepisami bezpieczeństwa.
  2. Dodać 1-2 μl 10 mCi/ml [α-33P] dTTP i 4 μl 1 M ditiotreitolu (DTT) do każdej 1 ml podwielokrotności głównej mieszanki RT (patrz Tabela 10 oraz Ostrowski i wsp.Rozdział 40).
  3. Ostrożnie wymieszać każdą 1,5 ml probówki mikrowirówki RT master mix, DTT i [α-33P] dTTP za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść do sterylnego koryta.
  4. Dozować 25 μl znakowanej mieszanki RT do każdego dołka 96-dołkowej cienkościennej płytki PCR. Uwaga: Uwzględnij miejsce na kontrolę pozytywną (zakażenie MJ4 WT) i kontrolę negatywną (pozorowana infekcja).
  5. Dodać 5 μl każdego supernatantu do płytki PCR zawierającej główną mieszankę RT.
  6. Uszczelnić płytkę PCR samoprzylepną folią i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w termocyklerze. Ze względów bezpieczeństwa końcówki pipet należy przepłukać preparatem Amphyl i wyrzucić je do małego pojemnika zawierającego odpady Amphyl, które później zostaną wyrzucone wraz z odpadami radioaktywnymi.
  7. Po inkubacji należy wykonać małe otwory w pokrywie foliowej za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 200 μl. Uwaga: Jeśli końcówki pipet dobrze dotykają cieczy w wodzie, wymień końcówki przed przejściem do następnej kolumny lub wiersza.
  8. Wymieszać próbki 5x i przenieść 5 μl każdej próbki na papier DE-81. Suszenie na powietrzu 10 min.
  9. Przemyć bloty 5x 1x SSC (chlorek sodu, cytrynian sodu), a następnie 2x 90% etanolem po 5 minut na pranie. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
    1. Umieść każdą kleksa w osobnym pojemniku do mycia, takim jak pudełko do przechowywania kanapek, dodaj wystarczającą ilość buforu do mycia (1x SSC lub 90% EtOH), aby przykryć blot i wstrząsaj przez 5 minut.
    2. Wlej bufor do mycia do osobnego pojemnika i powtórz. Uwaga: Pierwsze 3 prania są uważane za radioaktywne i należy je odpowiednio zutylizować. Ostatnie 2 prania można regularnie wyrzucać.
  10. Po wyschnięciu ostrożnie zawiń blot w folię Saran i wystawij na działanie fosfoekranu w szczelnie zamkniętej kasecie przez noc w temperaturze pokojowej.
  11. Analiza fosfoekranów za pomocą luminowizora i ilościowe określenie radioaktywnych transkryptów.
  12. Narysuj okrąg wokół każdego sygnału radioaktywnego za pomocą oprogramowania OptiQuant. Wykres wartości Digital Light Unit (DLU) w celu wygenerowania krzywych replikacji.
  13. W celu wygenerowania wyników wydajności replikacji wartości DLU zostały przekształcone w logarytm10, a nachylenia obliczono przy użyciu punktów czasowych dnia 2, 4 i 6. Nachylenia replikacji są następnie dzielone przez nachylenie WT MJ4 w celu wygenerowania wyników wydajności replikacji. Ważne jest, aby znormalizować na podstawie wartości MJ4 WT uzyskanych z tej samej płytki RT, aby zmniejszyć zmienność wewnątrz testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby poprawnie wykonać ten protokół, który tworzy plazmid prowirusowy zdolny do tworzenia w pełni funkcjonalnych, zakaźnych chimer Gag-MJ4, należy dołożyć wszelkich starań, aby wygenerować odpowiednie amplikony PCR. Kluczowe znaczenie ma ustalenie, czy PCR wygenerował amplikon gagowy o odpowiedniej wielkości. Produkty powinny znajdować się w zakresie 100 par zasad (bp) od amplikonu o wartości około 1 700 pz przedstawionego na rysunku 1A. Dokładna długość tego fragmentu będzie się różnić w zależno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na długość i techniczny charakter tego protokołu, istnieje kilka etapów, które mają kluczowe znaczenie zarówno dla pomyślnej budowy chimerycznych plazmidów Gag-MJ4, jak i dla ilościowego określenia zdolności replikacji wirusa. Chociaż strategia klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu wprowadzenia obcych genów gag do MJ4 opisana w tym protokole ma wiele zalet w porównaniu z wcześniej stosowanymi metodami opartymi na rekombinacji, protokół może być technicznie trudny, jeśli krytyczne kroki n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badacze dziękują wszystkim ochotnikom w Zambii, którzy wzięli udział w tym badaniu oraz całemu personelowi Zambia Emory HIV Research Project w Lusace, dzięki któremu to badanie było możliwe. Badacze chcieliby podziękować Jonowi Allenowi, Smicie Chavan i Mackenzie Hurlston za pomoc techniczną i zarządzanie próbkami. Chcielibyśmy również podziękować dr Markowi Brockmanowi za jego dyskusje i hojne przekazanie komórek GXR25.

To badanie zostało sfinansowane przez R01 AI64060 i R37 AI51231 (EH) oraz Międzynarodową Inicjatywę Szczepień przeciwko AIDS. Praca ta była możliwa częściowo dzięki hojnemu wsparciu narodu amerykańskiego za pośrednictwem Agencji Stanów Zjednoczonych ds. Rozwoju Międzynarodowego (USAID). Autorzy badania ponoszą odpowiedzialność za ich treść i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy USAID lub rządu Stanów Zjednoczonych. Prace te były również częściowo wspierane przez Rdzeń Wirusologiczny w Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC i JP były częściowo wspierane przez stypendia Action Cycling Fellowships. Prace te były częściowo wspierane przez grant bazowy Yerkes National Primate Research Center (2P51RR000165-51). Projekt ten został również częściowo sfinansowany przez Narodowe Centrum Zasobów Badawczych P51RR165 i jest obecnie wspierany przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej/OD P51OD11132.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Odczynniki do oznaczania ilościowego odwrotnej transkryptazy

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynniki PCR
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDTDNA Niestandardowe Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDTDNANiestandardowe Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDTDNANiestandardowe Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR3'IDT DNANiestandardowy Oligo25 nmol, standardowy odsalanie
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDTDNANiestandardowy Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCTCTCTCTAGC 3'IDTDNANiestandardowe Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT3'IDT DNACustom Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDTDNACustom Oligo25 nmol, standardowe odsalanie
CoolRack PCR 96 XTBiocisionBCS-529
CoolRack M15BiocisionBCS-125
Woda wolna od nukleazFisherSH30538FSWyprodukowane przez Hyclone
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
Simport PCR 8 probówek paskowych, niebieskie (płaska nasadka)Daigger
SuperScript IIILife Technologies/Invitrogen12574035
Phusion Hot-start II Polimeraza DNANukleotyd FisherF-549L
PCR MixRoche4638956001
Agaroza, wysoka moc żeluFisher50-213-128
TAE 10XLife Technologies/InvitrogenAM9869
Promega 1 kb drabinka DNAFisherPRG5711Wyprodukowana przez Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10 000xLife Technologies/InvitrogenS33102
Wizard SV Gel i System oczyszczania PCRPromegaA9282
Żyletki, jednosieczneFisher12-640Wyprodukowane przez Surgical Design
Thermocycler, PTC-200MJ Research
Microbiology & Odczynniki do klonowania
LB Agar, MillerFisherBP1425-2
LB Broth, LennoxFisherBP1427-2
Sterylne polistyrenowe szalki Petriego 100 x 15 mmFisher08-757-12
Sól sodowa ampicylinySigma-AldrichA9518-5G
Falcon 14 ml Polipropylenowe probówki okrągłodenneBD Biosciences
Endonukleaza restrykcyjna NgoMIVNew England BioLabsR0564L
Endonukleaza restrykcyjna BclINew England BioLabsR0160L
Endonukleaza restrykcyjna HpaINew England BioLabsR0105L
Ligaza DNA T4, 5 U/μ l
JM109, >108 jtk/μ gSystemL2001
PureYieldPromegaA1222
Safe Imager 2.0 Nadajnik światła niebieskiegoWirówka InvitrogenG6600
Microfuge 18 BeckmanCoulter367160
Odczynniki do hodowli komórkowych
Amphyl środek czyszczący/dezynfekującyFisher22-030-394
Fugene HD, 1 mlVWRPAE2311wyprodukowany przez Promega
Bromek heksadimetryny (polibren)Sigma-AldrichH9268-5G
Płytki Costar, 6-dołkowe, płaskieFisher07-200-83Wyprodukowane przez Corning Life
Costar Plates, 24-dołkowe, płaskieFisher07-200-84Wyprodukowane przez Corning Life
Costar Plates, 96-dołkowe, okrągłeFisher07-200-95Produkowane przez Corning Life
Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2Fisher10-126-37
Kolby, górna część filtra Corning/skośna szyjka, 150 cm2Fisher10-126-34Wyprodukowane przez Corning Life
Rurki stożkowe, 50 ml, niebieska nakrętkaFisher14-432-22Wyprodukowane przez BD Biosciences
Probówki stożkowe, 15 ml, niebieska nakrętkaFisher14-959-70CWyprodukowane przez BD Biosciences
Trypsyna-EDTAFisherMT25052CIWyprodukowane przez Mediatech
RPMI, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11875-119
DMEM, 500 mlLife Technologies/Invitrogen11965-118
Penicylina/ Streptomycyna/Glutamina, 100xLife Technologies/Invitrogen10378-016
PBS z magnezem i wapniem, 500 mlLife Technologies/Invitrogen14040-133
PBS bez magnezu i wapniaLife Technologies/Invitrogen20012-050
Rurki Sarstedt, różne kolorySarstedt72.694.996
Tacki na zbiorniki do Wielokanałowy, 55 mlFisher13-681-501
DEAE-DextranFisherNC9691007
Corning 96 well clear V bottom tissue culture microplateFisher07-200-96Wyprodukowany przez Corning Life
HEPES, 1 M Buffer SolutionLife Technologies/Invitrogen15630-080
FBS, Zdefiniowany, 500 mlFisherSH30070 03
X-galVWRPAV3941Wyprodukowany przez Promega
Aldehyd glutarowy, klasa II, 25% w H2OSigma-AldrichG6257-100ML
1 M roztwór chlorku magnezuSigma-AldrichM1028-100ML
Roztwór formaldehydu, do biologii molekularnej, 36,5%Sigma-AldrichF8775-500ML
Potas trójwodzian heksacyjanożelazianu(II)Sigma-AldrichP9387-100G
Heksacyjanożelazian(III) potasuSigma-AldrichP8131-100G
Wirówka Allegra X15-R BeckmanCoulter392932
TC10 Automatyczny licznik komórekBio-Rad1450001
Mikroskop odwrócony VistaVisionVWR
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCiPerkin-ElmerNEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8,0Life Technologies/Invitrogen15568025Musi być dostosowany do pH 7,8 za pomocą KOH
2 M Chlorek potasu (KCl)Life Technologies/InvitrogenAM9640GAdjust do 1 M roztwór
0,5 M EDTALife Technologies/Invitrogen15575-020
Nonidet P40Roche11333941103
Kwas poliadenylowy (Poly rA) sól potasowa Midland Reagent Co.P-3001
Oligo d(T) primerLife Technologies/Invitrogen18418-012
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815-1G
- SR - Ekran fosforowy o super rozdzielczości, małyPerkin-Elmer7001485
Corning Costar Thermowell 96-well plate model (M) PoliwęglanFisher07-200-245wyprodukowany przez Corning Life
Corning 96-dołkowa aluminiowa taśma uszczelniająca z mikropłytkami, niesterylnaFisher07-200-684Wyprodukowana przez Corning Life
DE-81 Papier anionowymiennyWhatman3658-915
Cytrynian trisodowy dwuwodnySigma-AldrichS1804-1KG
Chlorek soduFisherS671-3
Kaseta autoradiograficznaFisherFB-CA-810
Cyclone storage phoshpor screenPackard
Jednoetapowy system RT-PCR EF3647BX 352059 Kompetentne komórki Roche 10799009001 minipreparacji plazmidu Promega <td colspan="4">

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
  2. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. Journal of virology. 68, 4650-4655 (1994).
  3. Jin, X., et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. The Journal of experimental medicine. 189, 991-998 (1999).
  4. Schmitz, J. E., et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 283, 857-860 (1999).
  5. Brumme, Z. L., et al. Marked epitope- and allele-specific differences in rates of mutation in human immunodeficiency type 1 (HIV-1) Gag, Pol, and Nef cytotoxic T-lymphocyte epitopes in acute/early HIV-1 infection. Journal of virology. 82, 9216-9227 (2008).
  6. Leslie, A. J., et al. HIV evolution: CTL escape mutation and reversion after transmission. Nature medicine. 10, 282-289 (2004).
  7. Phillips, R. E., et al. Human immunodeficiency virus genetic variation that can escape cytotoxic T cell recognition. Nature. 354, 453-459 (1991).
  8. Price, D. A., et al. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T lymphocyte escape variants during primary infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 1890-1895 (1997).
  9. Goulder, P. J., et al. Late escape from an immunodominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nature. 3, 212-217 (1997).
  10. Tang, J., et al. Favorable and unfavorable HLA class I alleles and haplotypes in Zambians predominantly infected with clade C human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 76, 8276-8284 (2002).
  11. Prentice, H. A., et al. HLA-B*57 versus HLA-B*81 in HIV-1 infection: slow and steady wins the race. Journal of virology. 87, 4043-4051 (2013).
  12. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 2709-2714 (2000).
  13. Leslie, A., et al. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. Journal of virology. 84, 9879-9888 (2010).
  14. Kaslow, R. A., et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nature medicine. 2, 405-411 (1996).
  15. Altfeld, M., et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS. 17, 2581-2591 (2003).
  16. Kiepiela, P., et al. CD8+ T-cell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nature medicine. 13, 46-53 (2007).
  17. Mothe, B., et al. Definition of the viral targets of protective HIV-1-specific T cell responses. Journal of translational medicine. 9, 208(2011).
  18. Peyerl, F. W., Barouch, D. H., Letvin, N. L. Structural constraints on viral escape from HIV- and SIV-specific cytotoxic T-lymphocytes. Viral immunology. 17, 144-151 (2004).
  19. Rolland, M., et al. Broad and Gag-biased HIV-1 epitope repertoires are associated with lower viral loads. PloS one. 3, e1424(2008).
  20. Wagner, R., et al. Molecular and functional analysis of a conserved CTL epitope in HIV-1 p24 recognized from a long-term nonprogressor: constraints on immune escape associated with targeting a sequence essential for viral replication. J Immunol. 162, 3727-3734 (1999).
  21. Wang, Y. E., et al. Protective HLA class I alleles that restrict acute-phase CD8+ T-cell responses are associated with viral escape mutations located in highly conserved regions of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 83, 1845-1855 (2009).
  22. Chopera, D. R., et al. Transmission of HIV-1 CTL escape variants provides HLA-mismatched recipients with a survival advantage. PLoS pathogens. 4, e1000033(2008).
  23. Crawford, H., et al. Evolution of HLA-B*5703 HIV-1 escape mutations in HLA-B*5703-positive individuals and their transmission recipients. The Journal of experimental medicine. 206, 909-921 (2009).
  24. Boutwell, C. L., et al. Frequent and variable cytotoxic-T-lymphocyte escape-associated fitness costs in the human immunodeficiency virus type 1 subtype B Gag proteins. Journal of virology. 87, 3952-3965 (2013).
  25. Brockman, M. A., et al. Escape and compensation from early HLA-B57-mediated cytotoxic T-lymphocyte pressure on human immunodeficiency virus type 1 Gag alter capsid interactions with cyclophilin A. Journal of virology. 81, 12608-12618 (2007).
  26. Crawford, H., et al. Compensatory mutation partially restores fitness and delays reversion of escape mutation within the immunodominant HLA-B*5703-restricted Gag epitope in chronic human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 81, 8346-8351 (2007).
  27. Martinez-Picado, J., et al. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. Journal of virology. 80, 3617-3623 (2006).
  28. Schneidewind, A., et al. Escape from the dominant HLA-B27-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in Gag is associated with a dramatic reduction in human immunodeficiency virus type 1 replication. Journal of virology. 81, 12382-12393 (2007).
  29. Wright, J. K., et al. Impact of HLA-B*81-associated mutations in HIV-1 Gag on viral replication capacity. Journal of virology. 86, 3193-3199 (2012).
  30. Kawashima, Y., et al. Adaptation of HIV-1 to human leukocyte antigen class I. Nature. 458, 641-645 (2009).
  31. Goepfert, P. A., et al. Transmission of HIV-1 Gag immune escape mutations is associated with reduced viral load in linked recipients. The Journal of experimental medicine. 205, 1009-1017 (2008).
  32. Brockman, M. A., et al. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated for in chronic infection. Journal of virology. 84, 11937-11949 (2010).
  33. Huang, K. H., et al. Progression to AIDS in South Africa is associated with both reverting and compensatory viral mutations. PloS one. 6, e19018(2011).
  34. Wright, J. K., et al. Gag-protease-mediated replication capacity in HIV-1 subtype C chronic infection: associations with HLA type and clinical parameters. Journal of virology. 84, 10820-10831 (2010).
  35. Wright, J. K., et al. Influence of Gag-protease-mediated replication capacity on disease progression in individuals recently infected with HIV-1 subtype. C. Journal of virology. 85, 3996-4006 (2011).
  36. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. Journal of virology. 59, 284-291 (1986).
  37. Brockman, M. A., Tanzi, G. O., Walker, B. D., Allen, T. M. Use of a novel GFP reporter cell line to examine replication capacity of CXCR4- and CCR5-tropic HIV-1 by flow cytometry. Journal of virology. 131, 134-142 (2006).
  38. Ndung'u, T., Renjifo, B., Essex, M. Construction and analysis of an infectious human Immunodeficiency virus type 1 subtype C molecular clone. Journal of virology. 75, 4964-4972 (2001).
  39. Prince, J. L., et al. Role of transmitted Gag CTL polymorphisms in defining replicative capacity and early HIV-1 pathogenesis. PLoS pathogens. 8, e1003041(2012).
  40. Ostrowski, M. A., Chun, T. W., Cheseboro, B., Stanley, S. K., Tremblay, M., et al. Detection assays for HIV proteins. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan ... [et al.]. 12 (Unit 12 15), Forthcoming.
  41. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  42. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  43. Bichara, M., Pinet, I., Schumacher, S., Fuchs, R. P. Mechanisms of dinucleotide repeat instability in Escherichia coli. Genetics. 154, 533-542 (2000).
  44. Ackerson, B., Rey, O., Canon, J., Krogstad, P. Cells with high cyclophilin A content support replication of human immunodeficiency virus type 1 Gag mutants with decreased ability to incorporate cyclophilin A. Journal of virology. 72, 303-308 (1998).
  45. Dudley, D. M., et al. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates. BioTechniques. 46, 458-467 (2009).
  46. Ganser-Pornillos, B. K., von Schwedler, U. K., Stray, K. M., Aiken, C., Sundquist, W. I. Assembly properties of the human immunodeficiency virus type 1 CA protein. Journal of virology. 78, 2545-2552 (2004).
  47. Forshey, B. M., von Schwedler, U., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. Journal of virology. 76, 5667-5677 (2002).
  48. Gottlinger, H. G., Dorfman, T., Sodroski, J. G., Haseltine, W. A. Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 3195-3199 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

HIV 1 Replication CapacityGag MJ4 Chimeric VirusesRestriction Enzyme CloningSubtype C HIV 1CEM Based T Cell LineRadio Labeled Reverse Transcriptase AssayViral Stock TiteringNested RT PCR AmplificationBCL One Restriction DigestionGXR25 Cell Infection

Powiązane artykuły