Method Article

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

DOI:

10.3791/51510

⸱

February 21st, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, Institute for Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin, 4Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, 5Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia syntetyczna z dołu prezentuje nowatorskie podejście do badania i odtwarzania systemów biochemicznych oraz, potencjalnie, minimalnych organizmów. Ta rozwijająca się dziedzina angażuje inżynierów, chemików, biologów i fizyków do projektowania i łączenia podstawowych komponentów biologicznych w złożone, działające systemy od podstaw. Takie oddolne systemy mogłyby doprowadzić do opracowania sztucznych komórek na potrzeby podstawowych badań biologicznych i innowacyjnych terapii1,2. Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) mogą służyć jako platforma modelowa dla biologii syntetycznej ze względu na ich strukturę i rozmiar błony przypominającej komórkę. Natryskiwanie mikroprzepływowe lub mikrojetting to technika, która pozwala na generowanie GUV o kontrolowanym rozmiarze, składzie błony, transbłonowym włączeniu białek i enkapsulacji3. Podstawową zasadą tej metody jest wykorzystanie wielu impulsów płynu o wysokiej częstotliwości generowanych przez piezoaktywowane urządzenie atramentowe w celu deformacji zawieszonej dwuwarstwy lipidowej w GUV. Proces ten jest podobny do wydmuchiwania baniek mydlanych z folii mydlanej. Zmieniając skład roztwóru, skład roztworu otaczającego i/lub składniki zawarte w dwuwarstwie, naukowcy mogą zastosować tę technikę do tworzenia niestandardowych pęcherzyków. W artykule opisano procedurę generowania prostych pęcherzyków z dwuwarstwy interfejsu kropelkowego za pomocą mikrostrumieniowania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staje się coraz bardziej jasne, że biologia komórki to wieloskalowy problem, który wymaga integracji naszego zrozumienia od molekuł do komórek. W związku z tym dokładna wiedza o tym, jak cząsteczki działają indywidualnie, nie wystarcza do zrozumienia złożonych zachowań komórkowych. Wynika to częściowo z istnienia emergentnych zachowań układów wieloskładnikowych, czego przykładem jest odtworzenie interakcji sieci aktynowej z pęcherzykami lipidowymidwuwarstwowymi 4, montaż wrzeciona mitotycznego w ekstrakcie Xenopus 5 oraz dynamika przestrzenna maszynerii podziału komórek bakteryjnych6. Jednym ze sposobów uzupełnienia redukcjoni....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja Komory Nieskończoności

  1. Zaprojektuj komorę nieskończoności (nazwaną tak ze względu na jej kształt) za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) i zapisz plik tak, aby był kompatybilny z wycinarką laserową. Aby utworzyć ten kształt, należy oddzielić dwa okręgi o średnicy 0,183 cala odległością od środka do środka wynoszącą 0,15 cala. Wytnij komorę od 1/8 do 3/16 w przezroczystym akrylu za pomocą wycinarki laserowej. Kształt nieskończoności ułatwia tworzenie dwuwarstwowych warstw i stabilność interfejsu kropel.
  2. Wywierć otwór 1/16 cala przez krawędź akrylowej komory do studni w kształcie nieskończoności. Powtó....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmontowaliśmy zestaw do natryskiwania mikroprzepływowego na konwencjonalnym odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z niestandardowym stolikiem złożonym z obrabianych części i ręcznych mikrometrów (Rysunek 1). Charakterystyka drukarki atramentowej zapewnia wgląd w proces powstawania pęcherzyków. Zmiana odległości między dyszą atramentową a dwuwarstwą lipidową wpływa na przyłożoną siłę, która powoduje deformację membrany. Bliskie sąsiedztwo dwuwarstwy skupia prąd strumieniowy i zapobiega rozpraszaniu ener.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano wiele technik generowania pęcherzyków, w tym elektroformację, emulsję i generowanie kropelek14-16. Niezbędne są jednak nowe techniki eksperymentalne, aby umożliwić projektowanie systemów biologicznych o rosnącym podobieństwie do systemów żywych. W szczególności metody mikroprzepływowe zapewniły zwiększony poziom kontroli nad jednowarstwowością błony, monodyspersją wielkości i zawartością wewnętrzną17,18, zbliżając modele pęcherzyków do biologii. Ponadto charakterystyka i eksperymenty z wy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Mike'owi Vaheyowi z Laboratorium Fletchera na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley za porady dotyczące parametrów mikroodrzutu. Praca ta była sponsorowana przez grant NIH DP2 HL117748-01.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piezoelektryczna drukarka atramentowaMicroFab TechnologiesMJ-AL-01-xxxxxx oznacza średnicę kryzy w mikronach
Sterownik Jet Drive IIIMicroFab TechnologiesCT-M3-02
Szybka kameraVision ResearchMiroEX2
DPhPC lipid w chloroformieAvanti850356CZamawiany w małych porcjach w fiolkach
33 mm PVDF filtry, 0,2 i mikro; mFisher ScientificSLGV033RS
Strzykawki 1 mlFisher Scientific14823434
n-DecaneAcros Organics111871000
GlukozaAcros Organics410950010
SacharozaSigma-AldrichS7903-1KG
MetylocelulozaFisher ScientificNC9084958
1/8 cala AkrylMcMaster Carr8560K239Projekty CAD dla komory w kształcie nieskończoności są dostępne na życzenie
0,2 mm AkrylAstra ProductsClarex clear 001
Cement akrylowyTAP Plastics10693
Loctite 495 SuperglueFisher ScientificNC9011323
Loctite 3494 Wzmacniający UV klejStrobele Dostawa30765
Kauczuk naturalnyMcMaster Carr85995K14
Niestandardowe projekty CAD na scenierobotysądostępne na życzenie
domowej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
  2. Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipid Bilayer VesiclesMicrofluidic JettingGiant Unilamellar VesiclesDroplet Interface BilayerPiezoelectric InkjetVesicle GenerationMembrane CompositionVesicle EncapsulationVesicle Size ControlVesicle Mono Dispersity

Related Articles