Artykuł metodologiczny

Dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii

DOI:

10.3791/51513

⸱

23 maja 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Virginia, 2Department of Obstetrics & Gynecology, University of Virginia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ustalenie pierwotnych systemów hodowli komórek zrębu endometrium na podstawie próbek z histerektomii jest cenną techniką biologiczną i kluczowym krokiem przed realizacją szerokiego wachlarza celów badawczych. W tym miejscu opisujemy dwie metody stosowane do ustanawiania kultur zrębu z chirurgicznie wyciętych tkanek endometrium u ludzi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele wysiłku zostało włożone w stworzenie systemów hodowli komórkowych in vitro. Systemy te są przeznaczone do modelowania ogromnej liczby procesów in vivo. Systemy hodowli komórkowych powstałe z próbek ludzkiego endometrium nie są wyjątkiem. Zastosowania obejmują zarówno normalne cykliczne procesy fizjologiczne, jak i patologie endometrium, takie jak nowotwory ginekologiczne, choroby zakaźne i niedobory rozrodcze. W tym miejscu przedstawiamy dwie metody ustalania pierwotnych komórek zrębu endometrium z chirurgicznie wyciętych próbek histerektomii endometrium. Pierwsza metoda jest określana jako "metoda skrobania" i obejmuje mechaniczne skrobanie za pomocą ostrzy chirurgicznych lub żyletek, podczas gdy druga metoda jest określana jako "metoda trypsyny". Ta ostatnia metoda wykorzystuje aktywność enzymatyczną trypsyny do promowania separacji komórek i pierwotnego wzrostu komórek. Metodologię krok po kroku ilustrujemy za pomocą obrazów cyfrowych i mikroskopii. Podajemy również przykłady walidacji linii komórek zrębu endometrium za pomocą ilościowych reakcji łańcuchowych polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) i immunofluorescencji (IF).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciało ludzkiej macicy składa się z trzech warstw: perimetrium (lub surowiczej), mięśniówki macicy i endometrium. Rozróżnienie każdej z tych warstw jest ważnym krokiem w kierunku ustalenia linii komórek endometrium. Perimetrium jest najbardziej zewnętrzną warstwą macicy i składa się z cienkich, surowiczych komórek. Mięśniówka macicy to gruba, środkowa warstwa macicy składająca się z komórek mięśni gładkich. Endometrium jest identyfikowane jako wewnętrzna warstwa macicy i obejmuje populacje komórek nabłonka i zrębu.

Endometrium jest dalej dzielone na warstwę podstawną, której populacja komórek macierzystych jest przypuszczalnie rezapulowana warstwą funkcjonalną mniej więcej co 28 dni 1. Warstwa funkcjonalna ludzkiego endometrium ulega znaczącym zmianom biochemicznym i morfologicznym w odpowiedzi na krążące hormony. Hormony te pochodzą z przysadki mózgowej i jajników.

Skoordynowana produkcja i uwalnianie hormonów powoduje cykl reprodukcyjny. Cykl rozrodczy ma na celu przygotowanie błony śluzowej macicy do potencjalnych zdarzeń implantacji zarodka. U ludzi cykl rozrodczy jest znany jako "cykl menstruacyjny" i dzieli się na trzy fazy – proliferacyjną, wydzielniczą i menstruacyjną. Faza proliferacyjna polega na proliferacji funkcjonalnej warstwy endometrium, podczas gdy faza wydzielnicza charakteryzuje się dojrzewaniem funkcyjnym. W szczególności zmiany zewnątrzkomórkowe, wydzieliny i różnicowanie komórkowe sygnalizują potencjalną implantację. Jeśli implantacja nie nastąpi przed końcem fazy wydzielniczej, funkcjonalna warstwa endometrium jest złuszczana w fazie miesiączkowej. Znaczenie menstruacji i wydarzeń, które powodują zrzucanie warstwy funkcjonalnej, są nadal przedmiotem dyskusji. U ludzi postawiono, że miesiączka jest wynikiem specyficznego zdarzenia różnicowania w środkowej fazie wydzielniczej, znanego jako "spontaniczne decydualizowanie" 2. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółową metodologię zarówno metod izolacji komórek zrębu endometrium, jak i wykorzystujemy kombinację immunofluorescencji i obrazów cyfrowych, aby wykazać skuteczność tych podejść. Ponadto stosujemy powszechnie stosowany model spontanicznej decydualizacji in vitro w celu potwierdzenia izolacji komórek zrębu endometrium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki histerektomii użyte w tym manuskrypcie zostały zebrane zgodnie z zatwierdzonym przez IRB protokołem etycznym o numerze IRB-HSR #14424.

1. Pobieranie próbki ze źródła klinicznego

  1. Przed rozpoczęciem należy uzyskać wytyczne etyczne i dokumenty zatwierdzające oparte na rządach i instytucjach.
  2. Wszystkie kroki należy wykonywać w sterylnych warunkach.
  3. Tkankę pobraną od pacjenta należy przechowywać w pożywce (RPMI lub DMEM/o wysokiej zawartości glukozy) w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C, jeżeli próbki nie można natychmiast przetworzyć w hodowli. Próbki mogą być przechowywane w tym stanie maksymalnie przez 24 godziny.
  4. Umyj próbkę tkanki trzykrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i wyrzuć roztwór między płukaniami.

2. Przygotowanie pierwotnych linii komórkowych za pomocą metody skrobania

  1. Dodać 4-10 ml pożywki wzrostowej (RPMI lub DMEM/High Glucose uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną) do tkanki i dodać Fungizone (0,25 μg/ml stężenia końcowego) przez 30 min.
  2. Wyrzuć pożywkę wzrostową.
  3. Umyj chusteczkę dwukrotnie 1X PBS.
  4. Umieść tkankę na 6 cm płytce do hodowli komórkowej, aby rozróżnić warstwy mięśniówki macicy i endometrium (patrz rysunki 2A-2C w celu uzyskania dalszego opisu). Oddziel błonę śluzową macicy.
  5. Za pomocą skalpela lub żyletki przetnij tkankę na małe kawałki, drapiąc jednocześnie 6-centymetrową miskę do hodowli komórek. Zadrapania te ułatwiają przyczepianie się pojawiających się pierwotnych komórek endometrium. W porównaniu z metodą trypsyny potrzeba więcej tkanki (patrz rysunek 2D w przybliżeniu).
  6. Delikatnie dodaj 2 ml pożywki wzrostowej do podrapanego naczynia (fragmenty tkanek będą widoczne i najlepiej unieruchomione od ruchu drapania).
  7. Przenieść płytkę (płytki) do wyznaczonego inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C i 5 % CO2 ). Wyznacz miejsce na pierwszorzędowe linie komórkowe, z dala od innych naczyń do hodowli komórkowych. Kultury pierwotne są bardziej wrażliwe na infekcje i zanieczyszczenia.
  8. Codziennie badaj komórki pod mikroskopem świetlnym. Małe populacje komórek powinny pojawić się w drugim lub trzecim dniu z okolic pokrojonych tkanek (patrz ryc. 3B).
  9. Aby utrzymać kultury, delikatnie przemyj 1X PBS i dodawaj świeże podłoże wzrostowe (2 ml) co trzy dni. Gdy szybkość namnażania wzrasta, do 6 cm płytki hodowlanej można dodać dodatkowe pożywki wzrostowe (3-4 ml).
    Uwaga: Podczas mycia i wymiany pożywki kawałki tkanki prawdopodobnie zostaną zassane. Nie wpłynie to na wzrost przylegających komórek. Fragmenty tkanki należy odessać w kolejnym etapie (2.10), ponieważ jest mało prawdopodobne, aby nowe kolonie pojawiły się po tygodniu.
  10. Gdy płytka o średnicy 6 cm jest w około 75 - 80% zlewająca się (patrz rysunek 3B), pasaż przy użyciu 0,05% trypsyny. Komórki pierwotne nie mogą być pasażowane w nieskończoność - zamroź jedną płytkę komórek, gdy tylko dwie lub trzy płytki zostaną utrzymane. Jeśli wymaganych jest więcej fragmentów, postępuj zgodnie z protokołem unieśmiertelnienia (omówionym w Ref 3).

3. Przygotowanie pierwotnych linii komórkowych metodą trypsyny

  1. Umieścić mały kawałek tkanki endometrium (patrz rysunek 2D w przybliżeniu) w 2 ml 0,25% trypsyny uzupełnionej kanamycyną (końcowe stężenie 0,03 mg/ml).
  2. Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C na platformie obrotowej przez 30 minut.
  3. Krótko odwiruj tkankę.
  4. Odwirować próbkę o masie 200-400 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.
  5. Dodaj świeżą trypsynę i kanamycynę.
  6. Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C, obracając ją przez godzinę.
  7. Wiruj tkankę przez 5-10 sekund.
  8. Dodaj 2 ml pożywki wzrostowej (uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny-streptomycyny), aby dezaktywować trypsynę.
  9. Odwirować komórki przy 200-400 x g przez 2-3 min.
  10. Odrzucić supernatant i dodać 2 ml pożywki wzrostowej do granulowanych komórek.
  11. Ułożyć płytkę na 6 cm naczyniu do hodowli komórkowych. Skrobanie płytki jak w kroku 2.5 przygotowania pierwotnych linii komórkowych przy użyciu metody skrobania nie jest konieczne, ale zwiększa przyczepianie i wyrastanie kultur pierwotnych.
  12. Codziennie monitoruj komórki pod mikroskopem świetlnym. Komórki są zwykle widoczne pod mikroskopem świetlnym po 24-48 godzinach (patrz rysunek 3C).
  13. Aby utrzymać hodowle, monitoruj komórki i zmieniaj pożywkę co 2-3 dni, jak w kroku 2.9.
  14. Aby przejść przez komórki, użyj 0,05% lub 0,25% trypsyny, gdy komórki osiągną 75-80% konfluencji (patrz ryc. 3C).

4. Oszczędzanie dodatkowej tkanki do analizy (szybkie zamrażanie i utrwalanie formaliny)

  1. Umyć próbkę dwukrotnie 1X PBS.
  2. Zassać jak najwięcej płynu.
  3. W przypadku zamrażania zatrzaskowego umieść próbkę tkanki endometrium w probówce wirówkowej 1.7 (patrz rysunki 2F i 2G). Umieść probówkę wirówkową 1.7 w ciekłym azocie na 10 sekund lub do momentu, gdy będzie widać, że tkanka zamarzła.
    Uwaga: Należy uważać, aby nie dotykać bezpośrednio ciekłego azotu podczas przygotowywania próbek. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania lub analizy.
  4. W celu utrwalenia formaliny wytnij mały kawałek tkanki endometrium (patrz ryc. 2H) i zanurz w 10% buforowanej formalinie cynkowej. Po 24 godzinach wyrzuć formalinę i dodaj 70% etanolu do próbek tkanek do czasu dalszego przetwarzania.

5. Immunofluorescencja (IF)

  1. Utrwalanie komórek
    1. Przygotuj komórki na szkiełku hodowlanym lub płytce.
    2. Delikatnie umyj komórki 1X PBS.
    3. Dodać wstępnie schłodzony (4 °C) metanol i aceton (zmieszane w stosunku 1:1) przez 5 minut.
    4. Wysuszyć szkiełko na powietrzu przed kontynuowaniem. W razie potrzeby szkiełko można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie.
  2. Przetwarzanie IF
    1. Nawadniaj komórki za pomocą 1X PBS przez 10 min. W poniższych krokach 1-6 przeprowadź wszystkie mycia i inkubacje na obrotowej platformie.
    2. Blokuj za pomocą 1X PBS uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 1% surowicą specyficzną dla gatunku (źródło przeciwciała 2nd) przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Inkubować w przeciwciałie pierwszorzędowym (patrz zalecenia producenta dotyczące rozcieńczania przeciwciał). Zapoznaj się z sekcją Materiały, aby uzyskać informacje o konkretnych przeciwciałach. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w świeżym buforze blokującym, jak w kroku 5.2.2. Inkubację można prowadzić przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Umyj 3 razy 1X PBS przez 5 minut każdy.
    5. Inkubować w przeciwciałie drugorzędowym (patrz zalecenia producenta dotyczące rozcieńczeń przeciwciał). Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w świeżym buforze blokującym, jak w kroku 5.2.2. Aby zapobiec wybielaniu fotograficznemu, ważne jest, aby przeprowadzić ten i kolejne kroki przy braku światła.
    6. Umyj 3 razy 1X PBS przez 5 minut każdy.
    7. Dokładnie wysusz szkiełka.
    8. Dodaj media montażowe i roztwór do barwienia DAPI.
    9. Nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie za pomocą szczeliwa (szczeliwa). Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do 2 tygodni.

6. Ekstrakcja RNA

  1. Osad 1 x 107 komórek przez odwirowanie. Wszystkie materiały i odczynniki w tym protokole powinny być wolne od RNAzy.
  2. Lizować komórki w 1 ml odczynnika TRIZOL i inkubować homogenizowane próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej do całkowitej dysocjacji kompleksów nukleoproteinowych.
  3. Dodać 200 μl chloroformu na 1 ml TRIZOLU. Wstrząsać energicznie ręką przez 15 sekund i inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.
  4. Wirować z maksymalną prędkością (15 000 x g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Powstaną trzy warstwy.
  5. Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki. Dodać 1 μl glikogenu, aby zwiększyć wydajność RNA; jednak ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy przewiduje się niewielką ilość RNA.
  6. Dodać 0,5 ml alkoholu izopropylowego do warstwy wodnej i odwrócić próbki 3-5 razy. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Aby zwiększyć wydajność, próbki można umieszczać w temperaturze -20 °C lub -80 °C na 30 minut.
  7. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  8. W tym momencie powinna być widoczna niewielka osadka RNA. Odrzucić supernatant.
  9. Przemyć RNA 1 ml 75% etanolu.
  10. Wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut i wyrzucić supernatant. Próbki można ponownie umyć w celu usunięcia zanieczyszczeń nieorganicznych, ale ten krok nie jest konieczny.
  11. Krótko wysuszyć osad RNA, aż pastylka RNA wyschnie (zwykle trwa to 7-10 minut).
    Uwaga: Można zastosować jeden dodatkowy krok, aby zmniejszyć ilość materii nieorganicznej i skrócić czas schnięcia. Po wyrzuceniu supernatantu z płuczki etanolem należy wirować próbki z maksymalną prędkością przez dodatkową minutę i odessać pozostałą ciecz. Uważaj, aby nie zassać granulatu.
  12. Rozpuść RNA w wodzie wolnej od RNaz, w zależności od wielkości osadu RNA. Objętości zwykle wahają się od 10 do 50 μl.
  13. Inkubować próbki w temperaturze 55 °C przez 10 minut i mierzyć stężenie RNA.
  14. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania.

7. Odwrotna transkrypcja

  1. Doprowadzić próbkę RNA (1-3 μg) do objętości 9 μl za pomocąH2O.
  2. Podgrzewać RNA do temperatury 70 °C przez 10 min.
  3. Aby wygenerować główną mieszankę AMV, połącz następujące odczynniki: 5 μl dNTP (stężenie robocze 50 μM), 5 μl oligonukleotydów N6 DNA (stężenie robocze 80 μM), 5 μl buforu 5X AMV i 1 μl AMV. Ten roztwór mieszania wzorcowego jest przeznaczony dla jednej próbki.
  4. Dodać 16 μl mieszanki wzorcowej do podgrzanego RNA. Końcowa objętość reakcji wyniesie 25 μl reakcji.
  5. Do odwrotnej transkrypcji należy stosować następujące warunki PCR: (Etap 1) 42 °C przez 90 minut, (Etap 2) 95 °C przez 5 minut i (Etap 3) 4 °C do dalszego przetwarzania.

8. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Przeprowadzaj reakcje PCR przy użyciu starterów, temperatur wyżarzania, numerów cykli i odczynników znajdujących się w tabeli 1.
    Uwaga: Idealnie jest postępować zgodnie z instrukcjami producenta podczas używania odczynników PCR (patrz numer firmy i numer katalogowy w Materiałach).

9. Protokół decydualizacji in vitro (Pochodzi z Ref 4 i 5)

  1. Płytkie komórki endometrium.
  2. Dorastaj do zbiegu 75-85%.
  3. Po tym, jak komórki zaczną się zlewać, przemyj raz 1X PBS.
  4. Szybko dodaj pożywkę bez hormonów (RPMI bez fenolu uzupełnioną 5% paskiem węgla drzewnego FBS i 1% penicyliną-streptomycyną).
  5. Po 24 godzinach dodać pożywkę wolną od hormonów uzupełnioną octanem medroksyprogesteronu (MPA) o końcowym stężeniu 1 μM i 3',5'-cyklicznym monofosforanem 8-bromoadenozyny (cAMP) o końcowym stężeniu 0,5 mM.
  6. Po upływie co najmniej 48 godzin należy przerwać reakcję i zachować płytkę (płytki) do dalszej obróbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak podkreślono w sekcji Protokół, upewnij się, że wszystkie metody są zgodne z wytycznymi rządowymi, instytucjonalnymi i etycznymi podczas obchodzenia się z ludzką tkanką i jej przygotowania.

W tym manuskrypcie znajduje się ilustracja ogólnego przepływu pracy "metody skrobania" (Rysunek 1A) i "metody trypsyny" (Rysunek 1B) używanych do zakładania pierwotnych hodowli endometrium. Metody te są szczegółowo opisane w rozdziale Protokół

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inne grupy opisały i dostosowały metodologię przygotowania kultur zrębu endometrium, z których większość wykorzystuje kolagenazę 4,12,13,15-18. W tym manuskrypcie przedstawiliśmy metodologię i dowody na dwie uproszczone metody pierwotnej hodowli zrębu endometrium, z których obie są wykorzystywane przez nasze laboratorium ze względów ekonomicznych i wygodnej dostępności trypsyny i / lub żyletki.

Porównując nasze dwie metody, obie z powodzeniem generują żywotne kultury pierwotne. Nasz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wspólnym wysiłkom dr Thao Dang i członków jej laboratorium za korzystanie z ich sprzętu do obrazowania i mikroskopu. Dziękujemy również rdzeniowi Biorepository and Tissue Research Facility (BTRF), Jeffowi Harperowi, oraz mieszkańcom Uniwersytetu Wirginii za dostarczenie nam tkanki macicy. Dziękujemy Karolowi Szlachcie za pomoc w przygotowaniu Przeglądu Schematów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25 trypsyny lub 0,05% trypsyny SH3023602 hyklonowalub SH30004202
1,7 mikro   Genesee Scientific22-272A
1 &mikro; l, 20 i mikro; l, 200 ml oraz 1 000 &mikro; l Pipeta   Genesee Scientific24-401,24-402, 24-412, 24-430
Probówka stożkowa 15 ml Hyclone339650
50 ml Rurka stożkowa Hyclone339652
6 cm Naczynie do hodowli komórkowych Thermo scientific12-556-002
Komory 8-dołkowe Octan Thermo ScientificAB-4162
 Fisher scientificC4-100
AMV RT Enzym/bufor Bio LabsM077L
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Fisher ScientificBP-1605-100
Buforowana formalina cynkowa Thermo59201ZF
Taśma węglowa FBS FisherNC9019735
Chloroform Fisher ScientificBP1145-1
Szkiełko nakrywkowe Marka Fisher12-544D
Cykliczny wzmacniacz (cAMP) SigmaB7880
DMEM/Wysoki poziom glukozy HydrokonSH30243FS
dNTP BiolineBIO-39025
Osioł Anty Koza -TRITC Santa CruzSC-3855
Serum z osła Jacksona' s lab017-000-002
E Przeciwciało kadherynowe   Epitomika1702-1
Etanol Fisher ScientificBP2818-1
Surowica bydlęca dla płodu (FBS) Fisher Scientific03-600-511
Fungizone Amfoterycyna B Sonda Gibco15290-018
GAPDH Technologie życiaHS99999905
glikogen 5Prime2301440
Goat Anti Mouse - FITC Jacksona' s Lab115-096-003
Izopropanol Fisher ScientificBP2618-1
Kanamycyna   Fisher ScientificBP906-5
Octan medroksyprogesteronu (MPA) SigmaM1629
MeOH (metanol) Fisher ScientificA4-08-1
Nośnik montażowy (z DAPI) Wektorowe laboratoriaH-1500
N6 DNA Oligos Skrobak Invitrogen
numer 15   BD371615
Pan Cytokeratin  Mysz mAB Sygnalizacja komórkowa4545
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) Fisher ScientificBP-399-4
Penicylina-Streptomycyna Roztwór Glutaminy 100X   HycloneSV30082.01
PML Anti Goat Anti body Santa CruzSC-9862
Podkład(y) Eurofins
RPMI HyclonSH30027FS
RPMI (bez fenolu) Gibco11835
Sybr Zielony   Thermo ScientificAB-4162
Taqman ThermoAB-4138
Trizol Technologie życia15596018
przeciwciała wimentyny Epitomika4211-1
Rurka wirówkowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heller, D. in The endometrium: a clinicopathologic approach. Heller, D. , 56-75 (1994).
  2. Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness. Bioessays. 34, 26-35 (2011).
  3. Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
  4. Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
  5. Jones, M. C., et al. Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).
  6. Salamonsen, L. A., et al. Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery. Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).
  7. Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data. Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).
  8. Chen, J. I., et al. Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium. J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).
  9. Talbi, S., et al. Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women. Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).
  10. Punyadeera, C., et al. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium. Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).
  11. Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).
  12. Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges. J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).
  13. Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression). Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).
  14. Gellersen, B., Brosens, J. Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair. J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).
  15. Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture. J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).
  16. Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. Histochemical identification of cultured cells from human endometrium. In Vitro. 20, 25-32 (1984).
  17. Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha. J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).
  18. Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).
  19. Sakai, N., et al. Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells. J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).
  20. Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells. Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).
  21. Tamura, I., et al. Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells. Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).
  22. American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , Available from: http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322 (2013).
  23. Salker, M., et al. Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss. PLoS One. 5, (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pierwotna hodowla kom rekmetoda skrobaniametoda trypsynowatechnika izolacji kom rekobserwacje mikroskopowewalidacja qPCRwalidacja immunofluorescencyjnautrata cytokeratyny

Powiązane artykuły