Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Podsumowanie

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Streszczenie

Przez ponad 20 lat, farmakologia odwrotna była najważniejszą strategią odkrywania ligandów aktywujących receptory sprzężone z sierocym białkiem G (GPCR). Początek odwrotnego testu farmakologicznego polega na klonowaniu, a następnie transfekcji GPCR będącego przedmiotem zainteresowania w komórkowym systemie ekspresji. Heterologiczny receptor eksprymowany jest następnie poddawany próbie wykorzystania złożonej biblioteki ligandów kandydujących w celu zidentyfikowania liganda (ligandów) aktywującego receptor. Aktywację receptora można ocenić, mierząc zmiany w stężeniu cząsteczek reporterowych drugiego przekaźnika, takich jak wapń lub cAMP. Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest często stosowanym średnioprzepustowym testem farmakologii odwrotnej. Sierocy GPCR ulega przejściowej ekspresji w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 293T (HEK293T), a rozwiązły konstrukt Gα₁₆ jest kotransfekowany. Po związaniu liganda aktywacja podjednostki Gα₁₆ indukuje uwalnianie wapnia z retikulum endoplazmatycznego. Przed badaniem przesiewowym ligandów komórki wykazujące ekspresję receptora są ładowane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, Fluo-4 acetoksymetylowym. Sygnał fluorescencyjny Fluo-4 jest znikomy w komórkach w warunkach spoczynku, ale może być wzmocniony ponad 100-krotnie po interakcji z jonami wapnia, które są uwalniane po aktywacji receptora. Opisana technika nie wymaga czasochłonnego tworzenia stabilnie transfekowanych linii komórkowych, w których transfekowany materiał genetyczny jest integrowany z genomem komórki gospodarza. Zamiast tego przejściowa transfekcja, generująca tymczasową ekspresję genu docelowego, jest wystarczająca do przeprowadzenia testu przesiewowego. Konfiguracja umożliwia średnioprzepustowe badania przesiewowe setek związków. Kotransfekcja rozwiązłego Gα₁₆, który łączy się z większością GPCR, umożliwia przekierowanie wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego w kierunku uwalniania wapnia, niezależnie od natywnego szlaku sygnałowego w warunkach endogennych. Komórki HEK293T są łatwe w obsłudze i przez lata udowodniły swoją skuteczność w testach desierotyzacji receptorów. Jednak optymalizacja testu dla określonych receptorów może pozostać konieczna.

Wprowadzenie

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią jedną z największych i najbardziej zróżnicowanych rodzin spośród wszystkich białek powierzchniowych komórek. Ich obecność u kręgowców, bezkręgowców, roślin, drożdży i śluzowców, a także u pierwotniaków i najwcześniejszych diploblastycznych Metazoa wskazuje, że GPCR należą do najstarszych cząsteczek związanych z transdukcją sygnału¹. Ich naturalne ligandy aktywujące obejmują szeroką gamę bodźców zewnętrznych, w tym peptydy, aminy biogenne, substancje zapachowe, glikoproteiny i fotony². W związku z tym systemy sygnalizacyjne receptor-ligand są zaangażowane w ogromną różnorodność procesów fizjologicznych. Szerokie spektrum funkcjonalne sprawia, że są one idealnie odpowiednie do opracowywania leków terapeutycznych obejmujących szeroki zakres ludzkich schorzeń. Około 50-60% obecnych celów terapeutycznych reprezentują GPCR^3,4. Poza dużym znaczeniem w przemyśle farmaceutycznym, GPCR są również w centrum uwagi przy opracowywaniu nowej generacji gatunkowo specyficznych insektycydów^5,6 i pestycydów w ogóle. Ponieważ naturalne ligandy wielu GPCR pozostają niezidentyfikowane, są one klasyfikowane jako sieroce receptory GPCR. Deorfanizacja tych receptorów pozwoli lepszego zrozumieć ich role fizjologiczne w organizmach i może ujawnić potencjalne cele dla nowych zastosowań terapeutycznych⁷.

Od czasu ery genomiki strategia farmakologii odwrotnej jest szeroko stosowana w celu deorphanizacji receptorów GPCR⁸. Podejście to polega na wykorzystaniu receptora sierocego jako „haczyka” do „wyłowienia” jego aktywującego ligandu z ekstraktu biologicznego lub biblioteki związków syntetycznych. W związku z tym interesujący receptor GPCR jest klonowany, a następnie transfekowany do komórkowego systemu ekspresyjnego. W najczęściej stosowanych metodach aktywację receptora określa się poprzez pomiar zmian w stężeniu cząsteczek drugiego przekaźnika⁹. Główne testy przesiewowe receptorów opierają się na białkach bioluminescencyjnych wrażliwych na wapń (np. aequorin)¹⁰ lub fluorescencyjnych wskaźnikach wapnia (np. Fluo-4)¹¹. Testy oparte na fluorescencji, w których komórki wykazujące ekspresję receptora są nasycane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia przed przesiewaniem ligandów, mają tę zaletę, że pozwalają na wysokoprzepustowe badania dzięki łatwości użycia, krótki czas odczytu oraz możliwość badania wielu receptorów sierocych na jednej płytce¹².

W niniejszym materiale szczegółowo opisano i zilustrowano test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji, wykorzystując proces deorfanizacji receptora krótkiego neuropeptydu F (sNPF) u Drosophila melanogaster. Ten neuropeptydowy system sygnalizacyjny został pierwotnie scharakteryzowany przez Mertensa et al. w 2002 roku¹³ za pomocą testu bioluminescencji wapnia przeprowadzonego w komórkach jajnika chomika syryjskiego (CHO)¹⁴ oraz przez Fenga et al. w 2003 roku za pomocą testu elektrofizjologicznego z wykorzystaniem oocytów Xenopus¹⁵. Obecność systemu sygnalizacyjnego sNPF wydaje się być ograniczona do typu Arthropoda, gdzie jest on zaangażowany w szeroki zakres procesów, w tym w regulację żywienia, wzrostu, reakcji stresowych, lokomocji oraz rytmów okołodobowych¹⁶.

Badania nad systemami sygnalizacji neuropeptydergicznej u owadów mogą nie tylko prowadzić do wyznaczenia nowych celów dla opracowywania insektycydów, ale wiedza o ich funkcjonowaniu może być również ekstrapolowana na inne organizmy, ponieważ wiele systemów sygnalizacyjnych jest ogólnie dobrze zachowanych w toku ewolucji¹⁷. W ostatniej dekadzie dokonano dużego postępu w procesie deorfanizacji neuropeptydowych receptorów GPCR u owadów. Pomimo tych wysiłków, tylko niewielka liczba receptorów została dopasowana do ich kognatywnych ligandów, a dzięki dynamicznemu rozwojowi genomiki dostępna stała się ogromna ilość informacji sekwencyjnych dla nowych sierocych receptorów GPCR¹⁸. Dostępność metod przesiewowych o średniej i wysokiej przepustowości, takich jak oparty na fluorescencji test mobilizacji wapnia, który okazał się techniką szeroko stosowaną^9,18, jest zatem nieoceniona.

Opisany tutaj fluorescencyjny test mobilizacji wapnia jest przeprowadzany na linii komórkowej ludzkich embrionalnych nerek 293T (HEK293T) i wykorzystuje sondę fluorescencyjną do określania zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach wapnia po aktywacji receptora. Aby zagwarantować wysoki poziom ekspresji i translacji receptora, do końca 5’ sekwencji kodującej receptor dodaje się konsensusową sekwencję Kozaka¹⁹, która następnie jest klonowana w wektorze ekspresyjnym (np. seria wektorów pcDNA dla linii komórkowych ssaków). Ponieważ na podstawie samych informacji o sekwencji trudno jest przewidzieć endogenne sprzęganie z białkiem G sierocych receptorów GPCR, cząsteczki drugiego przekaźnika (np. wapń lub cAMP), które są modulowane po aktywacji receptora, często pozostają nieznane przed identyfikacją ligandu. Aby rozwiązać ten problem, można współekspresować^20,21,22 niespecyficzne białka G z rodziny G_q (np. mysi Gα₁₅ lub ludzki Gα₁₆ [użyty tutaj]) lub chimeryczne białka G (np. Gα_qi5), które oddziałują z większością GPCR i indukują uwalnianie wapnia. Po związaniu ligandu z receptorem, GPCR ulega zmianie konformacyjnej, która prowadzi do aktywacji specyficznych szlaków wewnątrzkomórkowych. Cząsteczka guanozynodifosforanu (GDP), związana w warunkach spoczynkowych z podjednostką Gα₁₆, zostanie zastąpiona cząsteczką guanozynotrifosforanu (GTP). Powoduje to dysocjację heterotrymerycznego białka G na podjednostkę Gα₁₆ oraz podjednostkę Gβγ. Podjednostka Gα₁₆ aktywuje fosfolipazę Cβ (PLCβ), która z kolei hydrolizuje związany z błoną fosfatydyloinozytobisfosforan (PIP₂), co prowadzi do powstania diacyloglicerolu (DAG) i inozytolo-trifosforanu (IP₃). IP₃ rozprzestrzenia się w cytoplazmie i aktywuje zależne od IP₃ kanały wapniowe obecne w błonie retikulum endoplazmatycznego, co indukuje uwalnianie wapnia do cytoplazmy.

Uwalnianie wapnia po aktywacji receptora następuje w ciągu kilku sekund i może być wykrywane poprzez załadowanie komórek przed testem przesiewowym barwnikiem wrażliwym na wapń, takim jak Fluo-4 acetometyl (AM)¹¹. Grupa estrowa AM umożliwia fluoroforowi przenikanie przez błonę komórkową i jest odcinana przez esterazy cytoplazmatyczne po dostaniu się do wnętrza komórki. W konsekwencji ładunki ujemne barwnika fluorescencyjnego zostają odsłonięte, co zapobiega jego dyfuzji na zewnątrz komórki i pozwala na oddziaływanie z jonami wapnia. Sygnał fluorescencyjny Fluo-4 jest pomijalny w komórkach w stanie spoczynku, w których stężenia wapnia znajdują się jedynie w zakresie nanomolarnym. Jednakże, gdy wapń zostaje uwolniony po aktywacji receptora, sygnał może wzrosnąć zależnie od stężenia ponad 100-krotnie, co zapewnia wysoki stosunek sygnału do szumu. Fluo-4 wykazuje również szeroki zakres dynamiczny w raporcie [calcium] przy K_d(calcium) wynoszącym 345 nM, co czyni go odpowiednim do pomiaru fizjologicznie istotnych zmian poziomu wapnia w szerokim zakresie komórek. Wzbudzenie Fluo-4 zachodzi przy 488 nm, a fluorescencję emisyjną mierzy się przy 525 nm¹¹. Fluorymetry, takie jak fluorescencyjny obrazujący czytnik płytek (FLIPR)²³, NOVOstar lub FlexStation (urządzenie stacjonarne)¹², to systemy o średniej lub wysokiej przepustowości, które umożliwiają jednoczesne dodawanie związków i detekcję sygnału Fluo-4 po aktywacji receptora dla każdej studzienki na płytce testowej. Opisany tutaj test mobilizacji wapnia opiera się na stacjonarnym systemie mikropłytek 96-dołkowych.

Oprogramowanie SoftMax Pro (oprogramowanie) służy do obsługi urządzenia stacji oraz do analizy danych. Program natychmiast wyświetla wyniki w formie grafów w formacie 96-dołkowym. Można jednocześnie wybrać wiele dołków, aby porównać ich wyniki na jednym wykresie. Wartości względnych jednostek fluorescencji (RFU) w każdym dołku każdej kolumny są mierzone jednocześnie przez dwie minuty, zaczynając przed dodaniem związków do dołków i kontynuując po pomiarze sygnału fluorescencyjnego następującego po aktywacji receptora. Zazwyczaj trend krzywej agonisty pokrywa się z linią bazową aż do momentu dodania związku aktywującego do komórek, co skutkuje gwałtownym wzrostem sygnału fluorescencyjnego. Wysokość piku koreluje z końcową stężeniem agonisty w dołku. Po piku sygnał fluorescencyjny powoli opada w stronę poziomu linii bazowej. Pomiary RFU można przekształcić w krzywe zależności odpowiedzi od stężenia, aby wyznaczyć wartość EC₅₀ (półmaksymalne stężenie efektywne) liganda. Generalnie, aby sporządzić wiarygodną krzywą zależności odpowiedzi od stężenia, należy przeprowadzić co najmniej trzy niezależne badania przesiewowe, z których każde obejmuje trzy powtórzenia serii stężeń.

Zaleca się uwzględnienie w projekcie eksperymentalnym kilku kontroli pozytywnych i negatywnych. Przede wszystkim należy przeprowadzić kontrolę transfekcji, t.j. wdrożenie receptora z znanym ligandem. Pozwala to zweryfikować, czy czynnik transfekcyjny był aktywny. Zaleca się również włączenie eksperymentu kontrolnego z agonistą endogennego receptora danej linii komórkowej oraz kontroli negatywnej (np. bufor do płukania), aby monitorować stan i żywotność komórek oraz wykluczyć możliwość zanieczyszczenia buforu do płukania czynnikiem, który mógłby wywołać odpowiedź autofluorescencyjną. Często stosowanymi agonistami są peptyd pochodzący od receptora aktywowanego przez proteazę-1 (PAR₁), który działa jako selektywny agonista PAR₁, lub karbachol, który aktywuje receptor acetylocholiny. Należy również przetestować komórki transfekowane pustym wektorem ekspresyjnym, aby wykluczyć oddziaływanie aktywnych związków z endogennymi receptorami komórki. W przypadku różnych układów sygnałowych może być wymagana optymalizacja kilku parametrów opisanych w poniższym protokole. Schematyczna figura pełnego testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji przedstawiona jest na Rysunku 1.

Rysunek 1. Ogólny schemat testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji. Zautomatyzowana obsługa cieczy i jednoczesne pomiary fluorescencji są wykonywane za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych stacji roboczej, sterowanej przez oprogramowanie. Stacja robocza zawiera trzy wysuwy: jedną dla płytki z komórkami, jedną dla płytki z związkami oraz jedną dla statywu z końcówkami. Wbudowana pipeta przenosi związki z jednej kolumny płytki z związkami do odpowiadającej jej kolumny płytki z komórkami (krok 1). Każda studzienka płytki z komórkami zawiera monowarstwę komórek HEK293T, które zostały współtransfekowane badanym GPCR oraz niespecyficzną podjednostką Gα₁₆. Gdy związek aktywuje receptor, GDP związany z Gα₁₆ zostaje zastąpiony przez GTP. Podjednostka Gα₁₆ następnie dysocjuje z kompleksu Gβγ i aktywuje fosfolipazę Cβ (PLCβ), która z kolei hydrolizuje fosfatydyloinozytobisfosforan (PIP₂), prowadząc do powstania diacyloglicerylu (DAG) i inozytolotrifosforanu (IP₃). IP₃ aktywuje zależne od IP₃ kanały wapniowe obecne w błonie retikulum endoplazmatycznego, indukując uwalnianie wapnia do cytoplazmy. Oddziaływanie wapnia z Fluo-4 (którym komórki są obciążone przed dodaniem związku) skutkuje sygnałem fluorescencyjnym (krok 2). Oprogramowanie prezentuje wyniki jako wartości relatywnych jednostek fluorescencji (RFU) w funkcji czasu, a wysokości szczytów korelują ze stężeniem ligandu w sposób zależny od stężenia. Dane te mogą być następnie przekształcone w krzywą zależność odpowiedź-stężenie w celu wyznaczenia wartości EC₅₀ dla pary ligand-receptor (krok 3).

Protokół

Uwaga: Wszystkie działania, w które zaangażowane są komórki, powinny być wykonywane w sterylnym środowisku poprzez pracę w przepływie laminarnym.

1. Utrzymanie linii komórkowej HEK293T

1. Hodować HEK293T komórek w kolbie T-75 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 .}
2. Przejdź przez komórki, gdy zostanie osiągnięta konfluencja 80%. Uwaga: Zwykle trwa to od 3 do 4 dni. Komórki w hodowli ciągłej pozwalają na 20-25 użytecznych pasaży do przesiewania.
   1. Sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) firmy Dulbecco bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, PBS-trypsyna-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (500 ml PBS uzupełniona 10 ml roztworu trypsyny-EDTA i 4,5 ml 4% EDTA) i pożywki wzrostowej (500 ml zmodyfikowanego roztworu Dulbecco o wysokim poziomie glukozy [DMEM] uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS] i 1 mM penicyliną-streptomycyną [PS]) w temperaturze pokojowej z półgodzinnym wyprzedzeniem.
   2. Usuń starą pożywkę wzrostową z komórek. Spłukać martwe komórki za pomocą 3 ml PBS i ponownie usunąć PBS.
   3. Dodać 3 ml PBS-trypsyny-EDTA, inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i usunąć roztwór Uwaga: Morfologia komórek zmieni się z gwiaździstej na kulistą
   .
   4. Poluzować komórki z dna kolby przez delikatne stukanie i zebrać komórki, kilkakrotnie spłukując dno 10 ml świeżej pożywki wzrostowej.
   5. Przenieść 1 ml kultury komórkowej do nowej kolby T-75 zawierającej 14 ml świeżej pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 .}

2. Transfekcja przejściowa komórek HEK293T

1. Hoduj HEK293T komórek w kolbie T-75 na 3 dni przed właściwym testem mobilizacji wapnia. Upewnij się, że używasz trzech kolb T-75, jednej do transfekcji z konstruktem receptorowym, jednej do transfekcji z pustym wektorem ekspresji, jako kontroli negatywnej i jednej do kontroli transfekcji. Uwaga: Pasażowanie komórek odbywa się zgodnie z opisem w kroku 1.2. Gdy konieczne jest przesiewanie wielu płytek 96-dołkowych, można użyć kolb T-150 w celu uzyskania wyższej wydajności komórek (w tym celu należy podwoić wszystkie podane ilości w krokach 1.2.5, 2.3, 3.1.3 i 3.1.4).
2. Kolby inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 przez} 20-24 godziny, aż kultury komórkowe zbliżą się do 50-70% zbieżności.
3. Współtransfekować jedną populację komórek za pomocą wektora ekspresyjnego kodującego interesujący nas GPCR i konstrukt Gα₁₆, drugiej kolby z pustym wektorem i konstruktem Gα₁₆, a trzecią z kontrolą transfekcji i konstruktem Gα₁₆. Uwaga: W tym protokole receptor Drosophila sNPF został sklonowany w wektorze ekspresji ssaków pcDNA3.1¹³. Do przeprowadzenia transfekcji użyto JetPRIME, ale można również użyć innych odczynników do transfekcji.
   1. Dodać łącznie 7,8 μg DNA (3,9 μg konstruktu receptora lub pustego wektora i 3,9 μg konstruktu ekspresji_Gα16) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 500 μl buforu JetPRIME. Dobrze wymieszaj, obracając rurkę i krótko odwiruj.
   2. Dodać 37,5 μl odczynnika JetPRIME, wirować i wirować przez 1 minutę w temperaturze 14 000 x g. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami do pożywki do hodowli komórkowych i upewnić się, że pipetujesz bezpośrednio do pożywki, unikając kontaktu ze ściankami kolby hodowlanej. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 przez} 20-24 godziny.

3. Test mobilizacji wapnia

1. Zbierz transfekowane komórki i umieść je w 96-dołkowych płytkach o czarnych ściankach i przezroczystym dnie.
   1. Umieść PBS, PBS-Trypsin-EDTA i pożywkę transferową DMEM (500 ml DMEM uzupełnione 10% dializowanym FBS i 1% P-S) w temperaturze pokojowej pół godziny wcześniej.
   2. Pokryj 96-dołkowe, czarnościenne, przezroczyste płytki dolne 60 μl PBS z fibronektyną (0,0025%) na studzienkę (5,85 ml PBS i 150 μl fibronektyny [0,1%] na płytkę). Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę pod przykryciem. Wyjmij roztwór z dołków i ponownie inkubuj płytki przez 1 godzinę bez pokrywki w temperaturze pokojowej. Alternatywnie możliwe jest użycie wstępnie powlekanych płytek w celu lepszego mocowania komórek.
   3. Zdjąć starą pożywkę wzrostową z komórek i spłukać martwe komórki za pomocą 3 ml PBS i usunąć PBS.
   4. Dodać 3 ml PBS-Trypsyny-EDTA, inkubować przez 1 minutę, a następnie usunąć roztwór. Uwaga: Morfologia komórek zmienia się z gwiaździstego na kuliste.
   5. Poluzować komórki z dna kolby przez delikatne stukanie i zebrać je, kilkakrotnie spłukując 10 ml pożywki transferowej DMEM. Przenieść komórki do probówki Falcon o pojemności 50 ml.
   6. Policz liczbę komórek na ml (wykonywane za pomocą NucleoCounter tutaj, ale dopuszczalna jest komora Burkera). Dodać 100 μl kultury komórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 100 μl buforu do lizy i wymieszaj, stukając w probówkę. Dodać 100 μl buforu stabilizującego i wymieszać, stukając.
   7. Napełnij kasetę nukleokasetową zawiesiną komórek i policz komórki za pomocą licznika. Pomnóż liczbę komórek przez trzy, ponieważ komórki zostały rozcieńczone trzykrotnie podczas dodawania buforu do lizy i stabilizacji w kroku 3.1.6.
   8. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 600 000 komórek/ml i zasiać 150 μl komórek na basenie w powlekanych płytkach, aby uzyskać gęstość komórek około 90 000 komórek na basenik. Unikaj pęcherzyków powietrza i postukaj w płytkę, aby równomiernie rozłożyć komórki, aby uzyskać ciągłą warstwę komórek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO_{2 przez} 16-24 godziny.
2. Załaduj komórki barwnikiem fluorescencyjnym i przygotuj płytkę złożoną.
   1. Przygotować zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)/HEPES/Ca²⁺/bufor albuminy surowicy bydlęcej (BSA): dodać 165 μl roztworu podstawowego CaCl₂ (1 M CaCl₂ w wodzie destylowanej [dH₂O] – przechowywać w temperaturze pokojowej), 500 μl roztworu podstawowego HEPES (1 M HEPES w dH₂O, pH 7,4 – przechowywać w temperaturze pokojowej), i 0,05 g BSA do 50 ml HBSS. Należy pamiętać, że BSA bez kwasów tłuszczowych jest używany do oznaczania wapnia, ponieważ kwasy tłuszczowe mogą aktywować określone receptory, osłabiając sygnał wapniowy receptora będącego przedmiotem zainteresowania.
   2. Przygotować roztwór probenecydu (100x, 250 mM): rozpuścić 0,71 g probenecydu w 5 ml NaOH (1 M) i dodać 50 μl roztworu podstawowego HEPES oraz 5 ml buforu HBSS/HEPES/Ca²⁺/BSA – zawsze należy przygotować świeży roztwór. Uwaga: Probenecyd hamuje nieorganiczne transportery anionów, które mogą usuwać Fluo-4 z cytoplazmy, zmniejszając w ten sposób sygnał fluorescencyjny. Zaleca się ładowanie barwnika w obecności i bez probenecydu w celu określenia, czy nieorganiczne transportery anionów stanowią potencjalny problem w poszczególnych badanych liniach komórkowych, ponieważ probenecyd może nawet zmniejszać sygnał, w którym pośredniczy agonista.
   3. Przygotować bufor do przemywania (Wash): dodać 500 μl roztworu probenecydu do 50 ml buforu HBSS/HEPES/Ca²⁺/BSA, dostosować pH do 7,4 i przefiltrować roztwór buforowy. Zawsze przygotowuj świeży bufor i wymagane jest 50 ml buforu na płytkę.
   4. Przygotować 10% roztwór kwasu pluronowego: zmieszać 50 μl kwasu pluronowego (20% w/v w dimetylosulfotlenku [DMSO]) z 50 μl DMSO – jeśli dojdzie do krystalizacji, podgrzać do 37 °C i zawsze przygotowywać świeży roztwór.
   5. Przygotować roztwór Fluo-4 AM (1mM): dodać 44 μl 10% roztworu kwasu pluronowego do fiolki zawierającej 50 μg Fluo-4 AM i wirować aż do całkowitego rozpuszczenia. Unikaj ekspozycji na światło, aby zapobiec wybielaniu fluoroforu.
   6. Przygotować bufor ładujący: dodać 8,8 ml DMEM uzupełnionego 10 mM HEPES i 2,5 mM probenecydu (pH 7,4) do roztworu Fluo-4 AM (44 μl) i wirować. Zawsze używaj świeżego bufora.
   7. Wyrzuć pożywkę z komórek, przemyj komórki 200 μl PBS na studzienkę i usuń PBS.
   8. Dodać 55 μl buforu ładującego do studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Owiń płytkę folią aluminiową, aby zapobiec wystawieniu płytki na działanie światła.
   9. Upewnij się, że wysuszyłeś związki przed badaniem przesiewowym, jeśli są rozpuszczone w rozpuszczalnikach, które są szkodliwe (np. acetonitryl) dla komórkowego układu ekspresji.
   10. Rozpuścić peptydy w buforze do przemywania w silikonowanych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przygotować serię rozcieńczeń w celu przeprowadzenia analizy stężenie-odpowiedź i oznaczenia wartości EC₅₀ liganda. Dodać 70 μl liganda do odpowiedniego dołka płytki złożonej (płytki 96-dołkowe w kształcie litery V) i włączyć kontrole dodatnie (endogennego agonisty) i ujemne (bufor do przemywania się) na każdej płytce. Uwaga: Jeśli związek nie jest rozpuszczalny w buforze do płukania, można wypróbować inne rozpuszczalniki, które nie są szkodliwe dla badanych komórek, takie jak woda lub roztwory emulgujące i rozpuszczające oleje i inne substancje nierozpuszczalne w wodzie (np. Kolliphor EL).
   11. Zmierzyć wszystkie próbki w trzech egzemplarzach. Należy pamiętać, że 50 μl liganda z płytki złożonej zostanie przeniesione do studzienki ze 100 μl buforem do płukania płytki komórkowej podczas testu, więc przygotuj związki o 3-krotnym pożądanym stężeniu końcowym.
   12. Wyrzucić bufor ładujący z płytki komory i dodać 100 μl buforu płuczącego do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej i zapobiegać ekspozycji na światło.
   13. Wyrzucić bufor do przemywania z płytki komory i dodać 100 μl nowego buforu do przemywania do każdej studzienki.
   14. Inkubować płytkę komórkową, płytkę złożoną i stojak na końcówki (96-dołkowe, końcówki pipet do urządzenia stacyjnego) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.

4. Test na urządzeniu stacji

1. Utwórz i załaduj żądany plik protokołu za pomocą oprogramowania i aktywuj jednostkę sterującą temperaturą dla komory odczytu. Tutaj mierz reakcje wapnia w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, po jednym rzędzie na raz, w odstępie 1,52 sekundy między kolejnymi odczytami (pomiar pełnej płytki 96-dołkowej zajmuje około 25 minut) przy 525 nm. Ustaw wzbudzenie Fluo-4 na 488 nm i przenieś całkowitą objętość 50 μl związku na płytkę kuwe, 18 sekund po rozpoczęciu odczytu, z prędkością dozowania ustawioną na 26 μl/s i wysokością pipety 135 μl.
2. Umieść płytkę złożoną i komórkową oraz stojak na końcówki w odpowiednich szufladach urządzenia stacji.
3. Wykonaj pojedynczy odczyt płytki ogniwa przy tej samej długości fali wzbudzenia i emisji w trybie ENDPOINT, przed uruchomieniem właściwego ekranu w trybie FLEX. Uwaga: Ten pomiar daje wartości względnych jednostek fluorescencji (RFU) i umożliwia wykrycie zmienności między dołkami płytki. Wartości z zakresu od 20 000 do 40 000 są uważane za dopuszczalne.
4. Rozpocznij test i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania.

Wyniki

Dla wszystkich czterech peptydów sNPF Drosophila (Drome-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide) przetestowano serie stężeń w zakresie od 50 µM do 0,001 nM na komórkach HEK293T przejściowo wykazujących ekspresję receptora sNPF Drosophila oraz niespecyficznej podjednostki Gα₁₆. GPCR był aktywowany przez wszystkie cztery peptydy w stężeniach końcowych do 0,1 nM, a aktywacja receptora była zależna od stężenia. Rycina 2 przedstawia wykresy odpowiadające jednej z trzech powtórzeń serii stężeń Drome-sNPF-1. Kontrola negatywna (bufor płuczący) nie wywołała sygnału fluorescencyjnego, natomiast kontrola pozytywna (PAR₁ – 1 µM) wywołała silną aktywację endogennego receptora aktywowanego proteazą-1, co doprowadziło do uzyskania wysokiego sygnału fluorescencyjnego (± 30 000 RFU). Należy zauważyć, że odchylenie od typowej krzywej może wskazywać na nieprawidłowości. Na przykład ciągły wzrost krzywej bez powrotu do poziomu bazowego może być związany z sygnałami niezależnymi od receptora, takimi jak obecność ionoforów wapnia lub uszkodzona dwuwarstwa lipidowa powodująca wycieki jonów wapnia.

Oprogramowanie umożliwia wprowadzanie formuł służących m.in. do wyznaczania procentu aktywacji lub błędów standardowych dla różnych stężeń. Uzyskane dane są wykorzystywane do sporządzenia wstępnych krzywych koncentracyjno-odpowiedzi w celu oszacowania wartości EC₅₀, co przedstawiono dla czterech peptydów Drome-sNPF na Rysunku 3. Krzywe na Rysunku 3 zawierają również dane dla kontroli negatywnej, w której serie stężeń peptydów Drome-sNPF testowano na komórkach HEK293T przetransfekowanych pustym wektorem pcDNA3.1. Wyniki wskazują, że dodanie peptydów do tych komórek nie wpływa na receptory endogenne, lecz rzeczywiście aktywuje badany receptor. Test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji powtórzono następnie trzykrotnie w niezależnych próbach. Na podstawie wstępnych krzywych koncentracyjno-odpowiedzi z pierwotnego przesiewu dostosowano testowane stężenia tak, aby objęły zakres dynamiczny krzywej (Rysunek 4). Wartości EC50 dla Drome-sNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [95% przedział ufności]), Drome-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drome-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) oraz Drome-sNPF-4 (0,50 ± 1,01 nM) są zbliżone, co wskazuje na ich równą skuteczność w aktywacji receptora.

Rycina 2. Wynik graficzny z oprogramowania dla odpowiedzi fluorescencyjnej zależnej od receptora dla serii stężeń. Przetestowano dwanaście końcowych stężeń (w zakresie od 50 µM do 0,001 nM) peptydu Drome-sNPF-1 na receptorze Drome-sNPF. Aktywację wyrażono w wartościach względnych jednostek fluorescencji (RFU). Górny wykres przedstawia wyniki dla sześciu najwyższych stężeń, a dolny wykres dla sześciu najniższych stężeń. Kontrolą dodatnią (+) jest PAR₁ (1 µM), a kontrolą ujemną (-) bufor płuczący.

Rysunek 3. Wstępne krzywe zależność-stężenie dla peptydów sNPF Drosophila wyznaczone za pomocą pojedynczego fluorescencyjnego testu mobilizacji wapnia. Krzywe zależność-stężenie dla receptora sNPF Drosophila przejściowo wyrażonego w komórkach HEK293T dla czterech peptydów sNPF Drosophila przedstawiono w kolorze niebieskim. Dla kontroli negatywnych (przedstawione w kolorze czerwonym) peptydy testowano na komórkach HEK293T transfekowanych pustym wektorem pcDNA3.1. Odpowiedzi fluorescencyjne przedstawiono jako wartości względne (%) w stosunku do wartości najwyższej (100% aktywacji). Krzywe są wynikiem jednego eksperymentu, w którym każda seria stężeń była mierzona w trzech powtórzeniach. Pionowe słupki reprezentują błędy standardowe średniej (SEM), które czasami są mniejsze niż zastosowane symbole (w takim przypadku przedstawiono tylko symbole).

Rycina 4. Krzywe stężenie-odpowiedź i odpowiadające im wartości EC₅₀ peptydów sNPF z Drosophila wyznaczone w trzech niezależnych testach mobilizacji wapnia opartych na fluorescencji. Krzywe stężenie-odpowiedź receptora sNPF z Drosophila przejściowo wykazanego w komórkach HEK293T dla czterech peptydów sNPF z Drosophila stanowią wynik trzech niezależnych pomiarów, z których każdy wykonano w trzech powtórzeniach (n ≥ 9). Odpowiedzi fluorescencyjne przedstawiono jako wartości względne (%) względem wartości najwyższej (100% aktywacji). Gwiazdki oznaczają stężenia, dla których n ≤ 9. Słupki błędów wskazują SEM, które niekiedy są mniejsze niż użyte symbole (w takim przypadku przedstawiono tylko symbole). Wartości EC₅₀ przedstawiono wraz z 95-procentowymi przedziałami ufności.

Dyskusja

Test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji został z powodzeniem zastosowany w celu potwierdzenia funkcjonalnej charakterystyki peptydgicznego systemu sygnalizacyjnego Drosophila sNPF, co zostało już przeprowadzone przez Mertens i wsp. z testem bioluminescencyjnym i przez Feng i wsp. z oznaczeniem elektrofizjologicznym^13,15. Wartości EC₅₀ uzyskane za pomocą testu fluorescencji w HEK293T komórkach są około 10-krotnie mniejsze niż te uzyskane za pomocą testu bioluminescencyjnego przeprowadzonego w komórkach CHO (Drome-sNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drome-sNPF-2: fluo = 5,89 nM, lumi = 42 nM; Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM; Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Różnice te można wytłumaczyć kilkoma czynnikami, w tym faktem, że jeden z używanych systemów ekspresji może być lepiej przystosowany do funkcjonalnej ekspresji danego receptora lub fałdowanie niektórych receptorów może być mniej wydajne w niektórych typach komórek. Wartości EC₅₀ wszystkich czterech peptydów Drome-sNPF mieszczą się w zakresie nanomolowym podczas testowania na ich receptorze zarówno za pomocą testu fluorescencji, jak i bioluminescencji, co ogólnie potwierdza fizjologiczne znaczenie ich interakcji peptyd-receptor in vivo.

Należy zauważyć, że żadna kontrola transfekcji z receptorem, dla którego znany jest ligand aktywujący, nie została uwzględniona w przedstawionym tutaj ekranie, ponieważ system sygnalizacyjny Drosophila sNPF jest zwykle kontrolą transfekcji w konfiguracjach eksperymentalnych. Do badania przesiewowego włączono kontrolę pozytywną z endogennym ligandem komórek HEK293T (PAR₁) oraz kontrolę ujemną (bufor do płukania). Wyniki PAR₁ wykazały, że komórki były w dobrym stanie. Kontrola ujemna (bufor do płukania) nie wywołała sygnału fluorescencyjnego, co wskazuje, że pożywka, w której rozpuszczone są peptydy, była wolna od jakichkolwiek zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na wyniki.

Wcześniej scharakteryzowany system sygnalizacji Drosophila sNPF został tutaj wykorzystany do wyjaśnienia testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji. W tym celu natychmiast przetestowano szeregi stężeń ligandów aktywujących. Jednakże, gdy receptor sierocy jest doprowadzany do nadekspresji w teście przesiewowym w celu przetestowania biblioteki zawierającej setki związków, zaleca się najpierw badanie przesiewowe ze stosunkowo wysokimi końcowymi stężeniami ligandów (np. 10 lub 1 μM). Po wykryciu związku aktywującego, seria rozcieńczeń tego związku może być badana przesiewowo w celu skomponowania krzywej stężenie-odpowiedź i określenia wartości EC₅₀ .

Po określeniu liganda aktywującego receptor, wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy może być dalej badany poprzez dostosowanie protokołu. Test można przeprowadzić w sposób opisany powyżej, ale bez jednoczesnej transfekcji podjednostki Gα₁₆ . Kiedy mierzona jest odpowiedź wapniowa, oznacza to, że receptor łączy się z endogenną podjednostką Gα_q komórkowego systemu ekspresji. Gdy nie obserwuje się sygnału fluorescencyjnego, można zastosować protokoły pomiaru zmian stężeń innych przekaźników wtórnych (np. cAMP).

Można również przeprowadzić badania zależności struktura-aktywność (SAR) w celu zdefiniowania sekwencji rdzenia peptydu wymaganej do aktywacji receptora. Po pierwsze, okrojone sekwencje są oceniane w celu zdefiniowania minimalnej sekwencji aminokwasowej peptydu, która nadal jest w stanie aktywować receptor. Następnie można przebadać peptydy, w których systematycznie każdy aminokwas został podstawiony przez resztę alaniny. Badanie serii substytucji syntetycznej alaniny na receptorze pozwala określić znaczenie każdego z aminokwasów dla aktywacji receptora^24,25.

Pomimo częstego stosowania i udowodnionej skuteczności, należy podkreślić, że opisany tutaj test może wymagać pewnych adaptacji, aby uzyskać optymalne wyniki dla określonych receptorów będących przedmiotem zainteresowania. Podjednostka Gα₁₆ ma tę zaletę, że wiąże się z większością GPCR, ale może również mieć dominująco-negatywny wpływ na receptory, które endogennie sprzęgają się poprzez Gα_q²². W takim przypadku przydatne może być przetestowanie różnych kombinacji białek G podczas optymalizacji nowego testu wapnia i porównanie wyników dla receptorów sprzężonych z_{G α q} przy braku lub obecności Gα₁₆. Można również przeprowadzić alternatywne testy, które są niezależne od oddziałującego białka G w celu wykrycia aktywacji receptora, takie jak translokacja aresztyny znakowanej GFP lub wykrywanie zmian potencjału błonowego (np. za pomocą zestawu do oznaczania potencjału błonowego FLIPR). Oprócz zastosowanego tutaj Fluo-4 AM, dostępna jest szeroka gama innych wrażliwych na wapń fluoroforów, z których każdy ma swoje własne właściwości widmowe i chemiczne. Najbardziej odpowiedni fluorofor można wybrać na podstawie GPCR, typu ogniwa i dostępnego czytnika płytek, ale konieczna jest weryfikacja eksperymentalna. Ilości transfekowanego DNA i stosunek DNA/odczynnika do transfekcji muszą być określone dla każdej kombinacji receptor-odczynnik do transfekcji-linia komórkowa. Na koniec należy pamiętać, że komórki w hodowli ciągłej pozwalają na przeprowadzenie testów przesiewowych tylko 20-25 użytecznych pasaży.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HEK293T komórki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Roztwór trypsyny-EDTA (0,25%)	Sigma-Aldrich	T4049
Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA)	MP Biomedicals	195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoka poziom glukozy  (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Penicylina-Streptomycyna (P-S)	Sigma-Aldrich	P4333
jetPRIME	Transfekcja	Polyplus 114-01	Odczynnik do transfekcji FuGENE HD (Promega); Lipofectamina LTX & Plus Odczynnik (technologie życia)
Dializowana płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Fibronektyna z ludzkiego osocza	Sigma-Aldrich	F0895
Odczynnik A100, Bufor do lizy	Chemometec	910-0003
Odczynnik B, Bufor stabilizujący	Chemometec	910-0002
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Bufor HBSS: Zrównoważony roztwór soli	Hanka Sigma-Aldrich	H8264
Probenecyd	Sigma-Aldrich	P8761
NaOH (1 M)	Vel	2781
Kwas pluronowy	Invitrogen	P-3000MP
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Zieleń wapniowa-1, ... (Invitrogen)
Kolby do hodowli tkankowych TPP (T-75 i T-150)	Sigma-Aldrich	Z707503 i Z707554
urządzenie FlexStation	Urządzenia molekularne		NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Czarnościenne płytki polistyrenowe (96 dołków) z przezroczystym dnem	Greiner Bio-One	655090	Corning 96-dołkowe płaskie przezroczyste dno czarne mikropłytki pokryte polistyrenem poli-D-lizyną
NucleoCassette	Chemometec	941-0001
NucleoCounter NC-100	Chemometec
, silikonowane	BioCision	BCS-2470
Polistyrenowe płytki 96-dołkowe w kształcie litery V	Greiner Bio-One	651101
96-dołkowe, końcówki do pipet FlexStation	Urządzenia molekularne	9000-0912
Oprogramowanie Soft Max Pro	Urządzenia molekularne

Probówki do mikrowirówek