Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51517

⸱

16 sierpnia 2014

 , 
1Biomedical Engineering, Wayne State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA). Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Streszczenie

Ta procedura opisuje metodę wytwarzania wielopłaszczyznowego substratu do kierowania wzrostem komórek nerwowych. System ten łączy w sobie sygnały mechaniczne, topograficzne, adhezyjne i chemiczne. Właściwości mechaniczne są kontrolowane przez rodzaj materiału użytego do wytworzenia włókien elektroprzędzonych. W tym protokole używamy 30% metakrylowanego kwasu hialuronowego (HA), który ma moduł wytrzymałości na rozciąganie ~500 Pa, aby wytworzyć miękkie włókniste rusztowanie. Elektroprzędzenie na obracającym się trzpieniu wytwarza wyrównane włókna, aby stworzyć wskazówkę topograficzną. Adhezja uzyskuje się poprzez pokrycie rusztowania fibronektyną. Podstawowym wyzwaniem, o którym mowa w niniejszym dokumencie, jest zapewnienie sygnału chemicznego na całej głębokości rusztowania przez dłuższy czas. Ta procedura opisuje wytwarzanie mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA), które zawierają czynnik wzrostu nerwów (NGF) i bezpośrednie impregnowanie rusztowania tymi mikrosferami podczas procesu elektroprzędzenia. Ze względu na trudne warunki produkcyjne, w tym duże siły nachylenia i ładunki elektryczne, żywotność białek jest mierzona po produkcji. System zapewnia uwalnianie białka przez ponad 60 dni i wykazano, że wspomaga pierwotny wzrost komórek nerwowych.

Wprowadzenie

Jednym z bieżących wyzwań w inżynierii tkanek nerwowych jest stworzenie kanału nerwowego (NC), który naśladuje matrycę pozakomórkową, w której nerwy rosną naturalnie. Badania wykazały, że komórki reagują na kilka czynników w swoim środowisku, w tym sygnały mechaniczne, topograficzne, adhezyjne i chemiczne1-3. Jednym z głównych wyzwań w tej dziedzinie jest określenie odpowiedniej kombinacji sygnałów i wyprodukowanie systemu, który może utrzymywać sygnały przez dłuższy czas, aby wspierać wzrost komórek4. Wiadomo, że neurony obwodowe preferują miękkie podłoże, są kierowane przez wyrównane włókna i reagują na czynnik wzrostu nerwów (NGF)5-7. Wykazano, że NC, które mogą dostarczać sygnałów chemicznych przez tygodnie, zapewniają lepszą regenerację funkcjonalną bliższą temu, jak w przypadku przeszczepów allogenicznych, obecnego złotego standardu naprawy nerwów8,9.

Różne materiały i metody produkcji mogą być używane do wytwarzania mechanicznych i topograficznych wskazówek10-13. Wskazówki mechaniczne są nieodłącznie związane z wybranym materiałem, co sprawia, że wybór odpowiedniego materiału do zastosowania ma kluczoweznaczenie 1,13. Metody produkcji do kontrolowania wskazówek topograficznych obejmują separację faz, samoorganizację i elektroprzędzenie1,13. Do zastosowań w mikroskali można również stosować mikrofluidykę, fotowzory, trawienie, ługowanie soli lub pianki gazowe14-17. Elektroprzędzenie stało się najpopularniejszym sposobem inżynierii włóknistych substratów do hodowli tkankowych ze względu na jego elastyczność i łatwość produkcji13,18-23. Elektroprzędzone nanowłókna są wytwarzane przez przyłożenie wysokiego napięcia do roztworu polimeru, powodując jego odpychanie się i rozciąganie w poprzek krótkiej szczeliny, aby się rozładować24. Wyrównane rusztowanie można utworzyć, zbierając włókna na uziemionym trzpieniu obrotowym, a niewyrównane rusztowania są zbierane na nieruchomej płycie25. Sygnalizację adhezyjną można osiągnąć poprzez pokrycie włóknistego rusztowania fibronektyną lub sprzężenie peptydu adhezyjnego, takiego jak RGD, z HA przed elektroprzędzeniem26.

Sygnały chemiczne, takie jak czynniki wzrostu, są najtrudniejsze do utrzymania przez dłuższy czas, ponieważ potrzebują źródła do kontrolowanego uwalniania. Wiele systemów próbowano dodać kontrolowane uwalnianie do elektroprzędzonych sieci włóknistych z różnym powodzeniem. Metody te obejmują elektroprzędzenie mieszanki, elektroprzędzenie emulsyjne, elektroprzędzenie powłoki rdzenia i koniugację białek27. Ponadto elektroprzędzenie odbywa się tradycyjnie w lotnym rozpuszczalniku, co może wpływać na żywotność białka28, dlatego należy wziąć pod uwagę utrzymanie bioaktywności białka.

To podejście dotyczy w szczególności łączenia sygnałów mechanicznych, topograficznych, chemicznych i adhezyjnych w celu stworzenia przestrajalnego rusztowania dla wzrostu nerwów obwodowych. Mechanika rusztowania jest precyzyjnie kontrolowana przez syntezę metakrylowanego kwasu hialuronowego (HA). Miejsca metakrylacji służą do dołączania fotoreaktywnych środków sieciujących. Usieciowany materiał nie jest już rozpuszczalny w wodzie i jest rozkładany wyłącznie przez enzymy29. Ilość usieciowania zmienia szybkość degradacji, mechanikę i inne właściwości fizyczne materiału. Użycie HA z 30% metakrylacją, która ma moduł wytrzymałości na rozciąganie ~500 Pa, tworzy miękkie podłoże, które jest zbliżone do natywnej mechaniki tkanki nerwowej i jest zwykle preferowane przez neurony26,29. Elektroprzędzenie na obracającym się trzpieniu służy do tworzenia wyrównanych włókien dla wskazówki topograficznej. Korzystanie z elektroprzędzenia wraz z mikrosferami dostarcza sygnały chemiczne w rusztowaniu przez dłuższy czas. Aby wspomóc wzrost neurytów, mikrosfery zawierające NGF są używane do tworzenia sygnału chemicznego. W przeciwieństwie do większości materiałów elektroprzędzonych, kwas hialuronowy jest rozpuszczalny w wodzie, dzięki czemu NGF nie napotyka ostrych rozpuszczalników podczas produkcji. Aby dodać sygnał adhezyjny, rusztowanie jest pokryte fibronektyną. Gotowy system zawiera wszystkie cztery typy sygnałów opisane powyżej: miękkie (mechaniczne) wyrównane (topograficzne) włókna z NGF uwalniające mikrosfery (chemiczne) pokryte fibronektyną (klej). Produkcja i testowanie tego systemu jest opisane w niniejszym protokole.

Proces rozpoczyna się od produkcji mikrosfer za pomocą podwójnej emulsji typu woda w oleju w wodzie. Emulsja jest stabilizowana środkiem powierzchniowo czynnym, alkoholem poliwinylowym (PVA). Wewnętrzna faza wodna zawiera białko. Dodawany do fazy olejowej, zawierającej materiał otoczki PLGA rozpuszczony w dichlorometanie (DCM), surfaktant tworzy barierę między fazami chroniąc białko przed DCM. Emulsja ta jest następnie dyspersjonowana w innej fazie wodnej zawierającej PVA w celu wytworzenia zewnętrznej powierzchni mikrosfer. Stabilną emulsję miesza się, aby umożliwić odparowanie DCM. Po spłukaniu i liofilizacji pozostają suche mikrosfery zawierające białko.

Po zakończeniu mikrosfer są one gotowe do elektroprzędzenia w rusztowania. Najpierw przygotowujesz roztwór do elektroprzędzenia. Lepkość roztworu ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego tworzenia włókien. Roztwory czystego kwasu hialuronowego nie spełniają tego wymogu; PEO jest dodawany jako polimer nośny, aby umożliwić elektroprzędzenie. Mikrosfery są dodawane do roztworu i przędzone elektrolitycznie, w wyniku czego powstaje włókniste rusztowanie z mikrosferami rozmieszczonymi w całym roztworze.

Po zakończeniu produkcji, białko powinno zostać przetestowane w celu sprawdzenia jego żywotności. Aby to zrobić, można użyć komórki pierwotnej, która reaguje na NGF. W protokole tym wykorzystuje się zwoje korzenia grzbietowego (DRG) z 8-10-dniowych zarodków kurczaków. Wiązki komórek wysiewa się na rusztowaniach zawierających mikrosfery wypełnione NGF lub puste. Jeśli NGF jest nadal żywotny, powinieneś zauważyć zwiększony wzrost neurytów na rusztowaniach zawierających NGF. Jeśli NGF nie jest już żywotny, nie będzie sprzyjał rozszerzaniu się neurytów i powinien wyglądać podobnie do kontroli.

Dokładna procedura opisana tutaj skupia się na wsparciu neuronalnym, jednak dzięki prostym modyfikacjom materiału, metody elektroprzędzenia i białek system może być zoptymalizowany dla różnych typów komórek i tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja mikrosfer w postaci podwójnej emulsji woda/olej/woda

  1. Najpierw należy przygotować 2% i 0,5% w/v roztwory alkoholu poliwinylowego (PVA) w wodzie dejonizowanej. Mieszać roztwory w temperaturze 50 °C do czasu ich całkowitego przejrzystości, co może zająć kilka godzin. Przygotować roztwór 2% v/v alkoholu izopropylowego w wodzie dejonizowanej.
  2. Przygotować wodny roztwór wybranego białka hydrofilowego. W poniższej tabeli przedstawiono przykładowe formulacje.

Tabela stężeń białek; BSA, NGF w rozcieńczalniku PBS; uwagi do analizy, niewystarczające uwalnianie.
Tabela 1: Przykładowe roztwory białek. Poniższe roztwory białek zostały z sukcesem enkapsulowane i poddane elektroprzędzeniu zgodnie z tym protokołem. W razie potrzeby można zastosować inne hydrofilowe roztwory białek.

  1. Przenieś 40 ml 0,5% roztworu PVA do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odstaw.
  2. W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml rozpuść 300 mg kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) o proporcjach 65:35 w 3 ml dichlorometanu. Aby przyspieszyć rozpuszczanie PLGA, można użyć miksera vortex.
  3. Połącz 200 µl roztworu białka i 4 µl 2% roztworu PVA. Wlej mieszaninę białka do roztworu PLGA (krok 1.4). Roztwory pozostaną w większości rozdzielone.
  4. Umieść probówkę w zlewce z lodową wodą. Używając sonikatora ręcznego przy mocy ~10 W (RMS), mieszaj roztwór przez kilka sekund (5-10), aż powstanie jednorodna, kremowo-biała emulsja.
  5. Wlej emulsję do probówki 50 ml zawierającej 0,5% PVA (krok 1.3). Mieszaj roztwór z dużą prędkością za pomocą miksera vortex przez ~20 s. Roztwór stanie się mętny.
  6. Przenieś emulsję do zlewki o pojemności 200 ml i umieść na mieszalniku magnetycznym przy 350 rpm przez 2 min. Dodaj do zlewki na mieszalniku 50 ml 2% alkoholu izopropylowego. Pozostaw mieszaninę w mieszaniu przez minimum 1 h, aby umożliwić odparowanie DCM i utwardzenie PLGA.
  7. Przenieś roztwór mikrosfer do probówek wirówkowych.
  8. Wiruj przy 425 x g przez 3 min. Mikrosfery osadzą się na dnie probówki i będą miały biały kolor. Ostrożnie usuń nadmiar cieczy znad mikrosfer i przechowuj w butelce o pojemności 500 ml.
  9. Wypłucz mikrosfery wodą dejonizowaną, napełniając probówkę w trzech czwartych jej objętości i wstrząsając nią, aby ponownie zawiesić mikrosfery w cieczy.
  10. Powtórz kroki 1.10 i 1.11 cztery razy.
  11. Po ostatnim płukaniu ponownie usuń nadmiar cieczy i przelej do butelki 500 ml z pozostałymi próbkami. Zamroź mikrosfery zebrane w probówce wirówkowej, a następnie liofilizuj przez co najmniej 24 h.
  12. Obejrzyj mikrosfery pod mikroskopem świetlnym lub skaningowym mikroskopem elektronowym. Mikrosfery o rozmiarze nieprzekraczającym 60 µm nadają się do efektywnego elektroprzędzenia. Jeśli mikrosfery są zbyt duże, w kroku 1.6 lub 1.7 może być wymagany dłuższy czas sonikacji lub mieszania w vortexie.
  13. Przechowuj wysuszone mikrosfery w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  14. Opcjonalnie: Zastosuj test ilościowy białka, zgodnie z instrukcją producenta, aby zbadać ilość białka w butelce 500 ml z kroku 1.1030. Służy to do obliczenia procentowej zawartości białka zamkniętego w mikrosferach poprzez odjęcie ilości białka w roztworze od ilości użytej w procesie produkcji.

Uwaga: Aby zwizualizować lokalizację białka w mikrosferze, należy dodać Rodaminę 2 µg/ml do roztworu PLGA31 i enkapsulować białko sprzężone z FITC. Rycina 1 przedstawia przykład.

2. Elektroprzędzenie z mikrosferami

  1. Przed przygotowaniem roztworu do elektroprzędzenia należy przygotować 0,5% w/v roztwór fotoinicjatora w wodzie dejonizowanej poprzez rozpuszczanie w temperaturze 37 °C. Proces ten może trwać kilka godzin.
  2. Przygotować roztwór w wodzie dejonizowanej zawierający 2% w/v metakrylowanego kwasu hialuronowego (MeHA) (metoda syntezy opisana w Burdick et al. )29, 3% w/v poli(tlenku etylenu) (PEO) o masie 900 kD oraz 0,05% w/v fotoinicjatora. 
    1. Obliczyć odpowiednią ilość MeHA i PEO dla pożądanego objętości. Na przykład 10 ml roztworu do elektroprzędzenia wymaga 200 mg MeHA i 300 mg PEO.
    2. Rozpuścić PEO w wodzie dejonizowanej, stanowiącej 90% końcowej pożądanej objętości (9 ml w tym przykładzie). Może to zająć kilka godzin; w celu przyspieszenia procesu można zastosować podgrzewany mieszadło magnetyczne lub kąpiel wodną w temperaturze 37 °C.
    3. Następnie dodać MeHA i mieszać roztwór za pomocą miksera wortex do uzyskania klarowności. Zajmie to tylko kilka minut.
    4. Na koniec dodać 0,5% roztwór fotoinicjatora, aby uzupełnić pozostałe 10% objętości (1 ml w tym przykładzie). 
  3. Dodać mikrosfery w pożądanym stężeniu do 400 mg/ml. Mieszać roztwór na mikserze wortex, aż mikrosfery zostaną równomiernie rozłożone w roztworze.
  4. Przenieść roztwór do strzykawki i założyć tępo zakończoną igłę o rozmiarze 18 gauge i długości 6 cali.
  5. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić prędkość podawania na 1,2 ml/hr. 
  6. Przymoczyć za pomocą taśmy warstwę folii aluminiowej do płyty kolektora lub trzpienia. Umożliwia to łatwe czyszczenie i przechowywanie gotowego rusztowania. Obracający się trzpień jest stosowany do tworzenia włókien uporządkowanych. Płaska płyta lub stacjonarny trzpień spowodują powstanie włókien rozmieszczonych losowo.
  7. Podłączyć przewód uziemiający z wysokonapięciowego źródła zasilania do aparatury kolektora. Pozytywny przewód podłączyć do igły.
  8. Ustawić pompę strzykawkową i powierzchnię kolektora tak, aby odległość między końcówką igły a powierzchnią kolektora wynosiła 15 cm.
  9. Uruchomić pompowanie polimeru; gdy roztwór pojawi się na końcu igły, włączyć źródło napięcia i ustawić je na 24 kV. UWAGA: Po włączeniu napięcia nie wolno dotykać żadnej metalowej części układu. Ładunek może przeskoczyć na krótkich dystansach z naelektryzowanych części na skórę.
  10. Podawać roztwór do momentu uzyskania pożądanej grubości rusztowania. Po zakończeniu wyłączyć źródło napięcia i pompę strzykawkową. 
  11. Zdjąć folię z przymocowanym rusztowaniem. Gotowe rusztowania zawierające białko przechowuje się w zamrażarce w temperaturze -20 °C.

3. Testy bioaktywności białka

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej. Do pożywki Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium dodać 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% v/v L-glutaminy oraz 1% v/v penicyliny-streptomycyny.
  2. Wybrać szklane laminki pasujące w całości do dołków płytki wielodołkowej.
  3. Użyć 3-(trimetoksysilylo)propyl metakrylanu do modyfikacji laminek zgodnie z instrukcją producenta. Metakrylowanie poprawia przyleganie rusztowania do laminek.
  4. Przed elektroprzędzeniem przymocować zmetylowane laminki do obszaru zbierania elektroprzędarki za pomocą usuwalnej taśmy dwustronnej. Przędzenie bezpośrednio na laminki ułatwia manipulację i obserwację.
  5. Przeprowadzić elektroprzędzenie do uzyskania pożądanej grubości, zgodnie z powyższym opisem.
  6. Po elektroprzędzeniu ostrożnie zdjąć laminki z trzpienia. Umieścić laminki pokryte rusztowaniem w przezroczystej komorze z azotem i upewnić się, że cały tlen został usunięty.
  7. Naświetlać komorę i rusztowanie światłem o długości fali 365 nm i mocy 10 mW/cm2 przez 15 min. Po sieciowaniu umieścić próbki w odpowiednio dobranej płytce wielodołkowej. Należy upewnić się, że strona z rusztowaniem jest skierowana do góry.
  8. Umieścić rusztowania pod lampą bakteriobójczą na 30 min w celu sterylizacji. W razie potrzeby można zastosować fibronektynę lub inne białko jako powłokę zwiększającą adhezję komórek. Powłokowanie rusztowań przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta.
  9. Wyizolować zwoje korzeni grzbietowych (DRG) zgodnie z metodą opisaną wcześniej przez Hollenbecka32. Do każdej testowanej laminki pokrytej rusztowaniem będzie potrzebny jeden zwoj DRG.
  10. Nanieść 100-200 µl pożywki na każde rusztowanie w płytce wielodołkowej. Ostrożnie umieścić jeden zwoj DRG na każdym rusztowaniu w kropli pożywki. W przypadku grubych rusztowań może być potrzebne więcej pożywki; zwoje DRG muszą być całkowicie zanurzone i nie mogą pływać na powierzchni.
  11. Inkubować rusztowanie i DRG w temperaturze 37 °C przez 4 hr, aby umożliwić przyleganie komórek do rusztowania.
  12. Dopełnić pożywkę do odpowiedniego poziomu w dołku i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Kontynuować inkubację przez 4-6 dni.
  13. Po okresie inkubacji ostrożnie usunąć pożywkę z każdego dołka i delikatnie wypłukać raz roztworem PBS. Utwierdzić komórki przez 30 min w 4% w/v paraformaldehydzie.
  14. Przebarwić komórki przy użyciu przeciwciał przeciwko neurofilamentom. Pozwoli to na wizualizację i ilościowe określenie wzrostu neurytów. Do obrazowania jąder komórkowych można użyć DAPI. Przykładowy protokół barwienia został opisany przez Sundararaghavana i współpracowników14.
  15. Wizualizować komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
    1. Umieścić płytkę wielodołkową na stole mikroskopu.
    2. Zlokalizować skupisko komórek, korzystając z filtrów i ustawień wzbudzenia dla DAPI.
    3. Po zlokalizowaniu komórek przełączyć filtr na FITC, aby zwizualizować wydłużone neuryty. Korzystając z funkcji łączenia obrazów (stitch) w mikroskopie, zebrać i połączyć tyle zdjęć, ile jest konieczne do obejrzenia całej struktury. Powtórzyć procedurę dla DAPI, FITC oraz w świetle przechodzącym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mikrosfery o średnicy 50±14 µm z wydajnością enkapsulacji białka powyżej 85% były systematycznie wytwarzane i elektroprzędzone w rusztowania. Wielkość określono poprzez obrazowanie próbek mikrosfer z trzech oddzielnych partii produkcyjnych. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu optycznego, a długości zmierzono przy użyciu komercyjnego oprogramowania laboratoryjnego. Rysunek 1 przedstawia histogram rozkładu wielkości. Stopień enkapsulacji przetestowano również w trzech oddzielnych partiach mikrosfer, ilośc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiele badań wykazało, że komórki nerwowe mogą być kierowane przez wskazówki topograficzne (wyrównanie włókien) i sygnały chemiczne (czynniki wzrostu)1,2,10,11,35. Elektroprzędzenie to łatwa metoda tworzenia wyrównanych włókien. Czynniki wzrostu stymulują wzrost nerwów, ale aby włączyć je do przewodów nerwowych (NC), wymagana jest metoda przedłużonego uwalniania. Aby stworzyć bardziej niezawodny system z obiema wskazówkami, te dwa sygnały powinny być połączone. Wcześniej badano kilka metod mających na celu zape...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Fundację Richarda Barbera i Thomas Rumble Fellowship (TJW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DAPIInvitrogenD1306
Irgacure 2959BASF24650-42-8Chronić przed światłem
PEO 900 kDaSigma-Aldrich189456
Metakryloksetylotiokarbamoilo rodamina BPolysciences, Inc.23591-100Przygotuj roztwór podstawowy w
pompie strzykawkowejKD ScientificKDS100
Źródło zasilaniaGamma Wysokie napięcieES30P-5W
Silnikielektryczne Triem, Inc0132022-15Musi być przymocowany do niestandardowo zbudowanego trzpienia
ObrotomierzMagazyn narzędzi sieciowychESI-330Służy do monitorowania prędkości
trzpieniaOmnicure UV Spot Cure System z adapterem kolimacyjnymEXFOS1000
IgłyFisher Scientific14-825-16H
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-545-81
Alkohol poliwinylowySigma-AldrichP8136-250G
Alkohol izoporopylowySigma-AldrichI9030-500mL
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP9703-100
BSA-FITCSigma-Aldrich080M7400
β-Czynnik wzrostu nerwów (NGF)R& D Systems1156-NG
65:35 Kwas polimlekowo-glikolowy (PLGA)Sigma-Aldrich1001554270
DichlorometanSigma-Aldrich34856-2L
Coomassie (Bradford) Test białkaThermo Scientific1856209
3-(trimetoksysililo)propylu metakrylanSigma-Aldrich1001558456
FibronektynaSigma-AldrichF2006
DMEMLonza12-604F
FBSAtlanta BiologicalsS11150
PBSHyklonSH30256.01
GlutaminaFisher ScientificG7513
Pen-StrepSigma-AldrichP4333
ParaformaldehydAlfa AesarA11313 
DMSO

Bibliografia

  1. Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
  2. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
  3. Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
  4. Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
  5. Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
  6. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
  7. Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
  8. Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
  9. Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
  10. Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
  11. Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
  12. Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
  13. Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
  14. Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
  15. Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
  16. Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
  17. Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
  18. Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. Electrospinning technology in tissue regeneration. Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).
  19. Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
  20. Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
  21. Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
  22. Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
  23. Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
  24. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  25. Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
  26. Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
  27. Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
  28. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  29. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
  30. Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
  31. Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
  32. Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
  33. Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
  34. Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
  35. Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
  36. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
  37. Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
  38. Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
  39. Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
  40. Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
  41. Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wytwarzanie mikrosferuwalnianie czynnik w wzrosturusztowanie w knisteczynnik wzrostu nerw wmikrosfery PLGAmikroskopia immunofluorescencyjnazwoje korzeni grzbietowychenkapsulacja bia ekw kna uporz dkowane
Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.