Artykuł metodologiczny

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51518

⸱

18 sierpnia 2014

 , 
1NYU Neuroscience Institute, New York University School of Medicine, 2Brain and Mind Research Institute, Weill Cornell Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Streszczenie

Badanie dojrzewania ośrodkowego układu nerwowego (OUN) opiera się na genetycznym ukierunkowaniu populacji neuronów. Jednak zadanie ograniczenia ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania do określonych podtypów neuronów okazało się niezwykle trudne ze względu na względny niedobór określonych elementów promotorowych. Interneurony GABA-ergiczne stanowią populację neuronów o dużej różnorodności genetycznej i morfologicznej. Rzeczywiście, w korze myszy 1 scharakteryzowano ponad 11 różnych podtypów interneuronów GABA-ergicznych1. W tym miejscu przedstawiamy dostosowany protokół selektywnego kierowania na populacje GABA-ergiczne. Osiągnęliśmy selektywne celowanie w podtyp interneuronów GABA-ergicznych, wykorzystując element wzmacniający czynników transkrypcyjnych homeoboksu Dlx5 i Dlx6, homologów genu Drosophila disstal-less (Dll)2,3, w celu napędzania ekspresji określonych genów poprzez elektroporację in utero.

Wprowadzenie

Większość korowych interneuronów GABA-ergicznych pochodzi z dwóch przejściowych struktur embrionalnych zwanych wypukłościami przyśrodkowymi i ogonowymi (odpowiednio MGE i CGE)4. Interneurony eksprymujące parwalbuminę i somatostatynę pochodzą z MGE, podczas gdy interneurony eksprymujące kalretyninę (Cr), peptyd naczyniowo-jelitowy (VIP) i reelinę (Re) pochodzą z CGE. Te podtypy interneuronów można rozróżnić na podstawie ich dat urodzenia. Podtypy pochodzące od MGE są urodzone między 9,5 dniem embrionalnym (e9,5) a e16,55,6. W przeciwieństwie do tego, interneurony pochodzące z CGE rodzą się od e12.5 do e18.5, a ich produkcja osiąga szczyt przy e15.56. Genetyczne ukierunkowanie tej późno urodzonej populacji pozostaje jednak nieuchwytne.

Mysie geny bez dystalu (Dlx) ulegają ekspresji wyłącznie w rozwijającej się brzusznej części przodomózgowia3. Interneurony GABA-ergiczne i neurony projekcyjne prążkowia, ale nie korowe komórki piramidalne, wyrażają geny Dlx1,2,5 i 6 we wczesnych stadiach rozwojowych3. Rzeczywiście, geny Dlx ulegają ekspresji w strefie podkomorowej MGE i CGE (SVZ) we wszystkich progenitorach GABA-ergicznych. Ekspresja tych genów zostaje ograniczona do wybranych podtypów w stadiach postmitotycznych7-9. Wcześniejsze dowody eksperymentalne wykazały, że element wzmacniający Dlx5 / 6 pozwala na selektywne celowanie w linie GABA-ergiczne w transgenicznych modelach myszy2. Przetestowaliśmy użycie jednego z tych elementów wzmacniających w kontekście ekspresji episomalnej w rozwijającym się mózgu myszy. Sklonowaliśmy element wzmacniający Dlx5 / 6 wraz z minimalnym promotorem i wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (eGFP) w plazmidzie szkieletowym bluescript (BS) (Figura 1). Wprowadziliśmy plazmid za pomocą elektroporacji in utero w e15.5, aby selektywnie celować w podtypy Cr, VIP i Re-3,8,10. Nasza technika pozwala na uzyskanie rzadkiej elektroporacji, co ułatwia odbudowę cech morfologicznych pojedynczych komórek. Ponadto wyjątkowo wysoki poziom ekspresji genów w korowych neuronach GABA-ergicznych pozwala na badania funkcjonalne. Przeprowadziliśmy badania nad utratą i zyskiem funkcji przy użyciu kilku genów typu dzikiego i dominującegoujemnego 11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z przepisami i wytycznymi Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szkoły Medycznej NYU.

Szczepy myszy
Do eksperymentów wykorzystano samice myszy Swiss Webster dostarczone przez TACONIC. W celu specyficznego celowania w interneurony warstwy powierzchownej wykorzystano zarodki e15.5.

Uwaga: Plazmid użyty w tej pracy (plazmid Dlx5/6.eGFP 3 μg/μl) został wygenerowany przy użyciu standardowych technik klonowania. CDNA eGFP sklonowano do plazmidu Dlx5/6-Pmin-polyA. Ten plazmid jest dostępny na życzenie (demarn02@nyumc.org).

1. Przygotowanie pipet do mikroiniekcji

  1. Ustaw ściągacz Heat #2 na 860.
  2. Umieść i zabezpiecz szklaną kapilarnę w pobliżu żarnika. Sprawdź, czy średnica zewnętrzna (OD) pipety wynosi około 30 μm.
  3. Naciśnij przycisk "pull".
  4. Ostrożnie usuń kapilarę. Dolna część to igła. Wyrzuć górną część.

2. Procedura anestezjologiczna

  1. Przygotować komorę zawierającą izofluran. Uwaga: Izofluran jest preferowanym środkiem znieczulającym ze względu na szybkie działanie i niską częstość występowania działań niepożądanych. Pentobarbital to inna opcja; Jednak tolerancja tego leku jest zmienna i może prowadzić do większej śmiertelności niż izofluranu.
  2. Ustawić przepływ izofluranu na 4-5% w 0,5-1 l/min O2.
  3. Upewnij się, że zawór komory jest otwarty, podczas gdy zawór adaptera głowicy jest zamknięty.
  4. Umieść ciężarną mysz w komorze.
  5. Pozwól myszy przejść pod wpływem znieczulenia. Zajmie to około 2-3 minut. Sprawdź częstość oddechów. Jeśli mysz zacznie hiperwentylować, zmniejsz dawkę izofluranu.
  6. Po znieczuleniu myszy należy ją niezwłocznie wyjąć z komory. Umieść go brzuszną stroną do góry na poduszce grzewczej i włóż głowę do maski, która będzie nadal dostarczać izofluran przez cały czas trwania operacji. Upewnij się, że przepływ izofluranu został przełączony z komory do rurki łączącej adapter głowicy. Wlej kroplę lubrykantu do oczu do każdego oka i zamknij oczy.
  7. Ustaw poduszkę grzewczą na 36 °C stopni, aby zminimalizować hipotermię.
  8. Sprawdź, czy nie ma odruchów łapy i ogona, ściskając tylne łapy i ogon.

3. Chirurgia

  1. Oczyść skórę pokrywającą brzuch 70% etanolem.
  2. Użyj kleszczy, aby pociągnąć skórę do góry. Po każdym zabiegu umyj wszystkie narzędzia detergentem i wodą i wysterylizuj w temperaturze 72 °C O/N.
  3. Wykonaj małe pionowe nacięcie (około 2 cm) wzdłuż linii środkowej, zaczynając w połowie drogi między trzecią a czwartą parą gruczołów sutkowych. Używaj cienkich nożyczek chirurgicznych. Uważaj, aby nie uszkodzić ściany brzucha.
  4. Delikatnie oddziel skórę od otrzewnej.
  5. Wizualizuj tętnice i żyły na ścianie brzucha. Wykonaj kolejne 2 cm pionowe nacięcie przez otrzewną (omijając naczynia), aby odsłonić jamę brzuszną.
  6. Zaciśnij skórę i ścianę brzucha z każdej strony, unikając zaciskania tętnic. Uwaga: W przypadku przypadkowego przebicia tętnic należy natychmiast złożyć zwierzę w ofierze, wykonując zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie izofluranu.
  7. Wstępnie podgrzej sterylny PBS do 37 °C. Przykryj zaciski wilgotnymi chusteczkami PBS Kim.
  8. Nawilż odsłoniętą jamę brzuszną za pomocą PBS. Powtórz ten krok kilka razy podczas wykonywania zabiegu.
  9. Za pomocą okrągłych kleszczy delikatnie odciągnij łańcuch embrionalny (e15.5) od jamy ustnej. Pozwól łańcuchowi spocząć na mokrych chusteczkach. Zacznij od odsłonięcia najpierw jednej połowy macicy. Gdy zarodki w nim zostaną poddane elektroporacji, przynieś je z powrotem do środka, a następnie pracuj nad drugą połową.

4. Elektroporacja

  1. Kontynuuj używanie okrągłych kleszczy do manipulowania zarodkami.
  2. Wizualizuj komory boczne. Komory boczne biegną wzdłuż linii środkowej (ryc. 1b).
  3. Dodaj Fast Green (Stock: 10% w/v) do roztworu DNA, aby uzyskać mieszaninę w stosunku 1:20, aby uwidocznić ją podczas wstrzyknięcia. Przygotuj roztwór DNA, rozpuszczając osad otrzymany ze standardowego protokołu oczyszczania maxi-prep w wodzie destylowanej.
  4. Za pomocą wstępnie wyciągniętych mikropipet z tłokiem wstrzyknąć 1 ml roztworu DNA (Dlx5/6-eGFP, 3 μg/μl) z Fast Green. Przed załadowaniem pipety należy odciąć końcówkę mikropipety cienkim kleszkiem #5 (Dumont), aby pozostawić 6 mm długości od początku ramienia do końca końcówki igły. Przytrzymaj główkę zarodka okrągłą pęsetą. Wprowadź pipetę do mózgu pod kątem 45°, celując w komorę boczną znajdującą się w pobliżu linii środkowej. Jeśli igła przebije się przez komorę, powoli wsuwaj pipetę, używając tłoka do wstrzykiwania DNA. Komora powinna zmienić kolor na zielony, gdy roztwór zacznie ją wypełniać. W tym momencie przestań poruszać pipetą i wstrzyknij 1 ml DNA. Delikatnie wyjmij pipetę.
  5. Ustaw elektroporator CUY21 na pięć impulsów 45 V po 50 ms w odstępach 950 ms.
  6. Do zarodków e15.5 należy stosować elektrody łopatkowe o średnicy 5 mm. Zanurz elektrody w PBS, aby zapewnić wydajną transmisję prądu.
  7. Umieść łopatki elektrod wokół głowy zarodka, a łopatki dodatnie na komorze zawierającej roztwór DNA. Nieco obniż dodatnią łopatkę w stosunku do ujemnej, aby wytworzyć prąd brzuszny przez wypukłości zwojowe. Ta manipulacja zminimalizuje ekspresję ektopową w komórkach piramidowych.
  8. Po umieszczeniu elektrod dostarcz impuls, naciskając raz pedał nożny.
  9. Wyjmij elektrody i wytrzyj je do czysta. Powtórz kroki 4.6-4.9 dla każdego zarodka.
  10. Po elektroporowaniu wszystkich zarodków wlej 3 ml PBS do jamy brzusznej i wróć do jamy brzusznej.
  11. Najpierw zszyj ścianę brzucha zakrzywioną igłą i jedwabnym szwem 5-0, a następnie skórę. Nałóż lidokainę (4%) na ranę. Podawać 120 mg/kg aspiryny dotrzewnie w celu znieczulenia.
    Uwaga: Cała procedura powinna być wykonana w ciągu 20 minut lub mniej. Zaleca się, aby początkujący elektropostacyjni tylko kilka zarodków, aby czas operacji był krótki. Długotrwałe operacje zmniejszą przeżywalność zarodków.
  12. Wyjmij zwierzę z rurki anestezjologicznej i pozwól dojść do siebie na poduszce grzewczej na papierowej chusteczce.
  13. Umieść zwierzę z powrotem w klatce, trzymaj je na poduszce grzewczej w temperaturze 37 °C i monitoruj stan zdrowia. Zwierzęta na ogół dobrze znoszą operację i zaczynają poruszać się powoli wkrótce po wyjęciu z rurki anestezjologicznej. W przypadku zaobserwowania nadmiernego krwawienia lub letargu, należy natychmiast złożyć zwierzę w ofierze, wykonując zatwierdzone przez IACUC procedury eutanazji, takie jak zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie znieczulenia.
  14. Wróć klatkę do wiwarium. Samice rodzą naturalnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaadaptowaliśmy technikę elektroporacji in utero, aby uzyskać specyficzne dla typu komórek celowanie w dojrzewające neurony. W celu indukowania ekspresji eGFP w interneuronach pochodzących z CGE wykorzystaliśmy element wzmacniacza Dlx5/6 i ograniczyliśmy iniekcje do etapu e15.5, kiedy generowana jest większość interneuronów pochodzących z CGE. Analizy przeprowadziliśmy w dniach P8 i P15 11(Rysunki 1 i 2). Potwierdziliśmy brzuszne pochodzenie elektroporowanych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ograniczenia techniki

Chociaż technika ta pozwala na autonomiczną analizę procesów komórkowych, nie nadaje się do analizy populacyjnej. Elektroporacje są bardzo rzadkie, a na mózg przypada mniej niż tysiąc komórek wyładowanych elektropoturą. W związku z tym technika ta nie może być stosowana do oceny konsekwencji behawioralnych wynikających z manipulacji genetycznej interneuronów pochodzących z CGE.

Podczas gdy elektroporacje przeprowadzane w e13.5-e14.5 są ukierunk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Lihong Yin za pomoc techniczną. NVD jest laureatem nagrody NARSAD Young Investigator Award, a także jest wspierany przez granty z NIH (5 K99 MH095825-02). Badania w laboratorium Fishell są wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia, Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972-01A1) oraz Fundację Simonsa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Elektroportator  z pedałemProtech InternationalCUY21
Elektrody łopatkowe 5 mm Protech InternationalCUY650P5
Poduszka grzewcza Ściągacz Kent ScientificDCT-15
Sutter Instruments P30 Instrumenty Sutter3282322
Systemy anestezjologiczne FluovacAparat Harvard726425
Delikatne nożyczki operacyjne 4,75" Proste Ostre/OstreRobozRS-6702
5-0 Jedwabny warkocz 18" C-1 Pudełko 36 RobozSUT-1073-21
Micro Clip Kleszcze do nakładania 5,5 "RobozRS-5410
2 Nożyczki zaciskoweRobozRC-4894
Kleszcze trzymające Fine Science Tools11031-15
Szklana rurka kapilarna FHC27-30-0Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID
Fast GreenSigma-AldrichF7258 
Sterylne PBSLife Technologies20012-027

Bibliografia

  1. Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
  2. Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
  3. Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
  4. Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
  5. Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
  6. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
  7. Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
  8. Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
  9. Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
  10. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
  11. De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
  12. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Elektroporacja in uterointerneurony GABAergiczneenhancer Dlx5 Dlx6celowanie selektywne dla podtyp wwstrzykiwanie DNAprotok elektroporacjiusuwanie a cucha zarodkowegowizualizacja ekspresji GFPanaliza autonomiczna kom rkowo

Powiązane artykuły