Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

24 lipca 2014

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są bardzo obiecujące dla medycyny regeneracyjnej i zastosowań biofarmaceutycznych. Obecnie optymalna hodowla i skuteczna ekspansja dużych ilości hPSC klasy klinicznej są kluczowymi kwestiami w terapiach opartych na hPSC. Tradycyjnie hPSC rozmnaża się jako kolonie zarówno w systemach hodowli karmowych, jak i bezkarmowych. Metody te mają jednak kilka poważnych ograniczeń, w tym niską wydajność komórek i generowanie komórek różnicujących się niejednorodnie. Aby udoskonalić obecne metody hodowli hPSC, opracowaliśmy niedawno nową metodę, która opiera się na hodowli jednowarstwowej (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły NCM oparte na inhibitorze kinazy związanej z Rho (ROCK) Y-27632. Dostarczamy również nowych informacji na temat hodowli NCM z różnymi małymi cząsteczkami, takimi jak Y-39983 (inhibitor ROCK I), fenylobenzodioksan (inhibitor ROCK II) i tiazowiwina (nowy inhibitor ROCK). Rozszerzamy nasz podstawowy protokół hodowli hPSC na określonych białkach zewnątrzkomórkowych, takich jak izoforma lamininy 521 (LN-521) bez użycia inhibitorów ROCK. Ponadto, w oparciu o NCM, wykazaliśmy skuteczną transfekcję lub transdukcję plazmidowych DNA, cząstek lentiwirusowych i mikroRNA na bazie oligonukleotydów do hPSC w celu genetycznej modyfikacji tych komórek do analiz molekularnych i odkrywania leków. Metody oparte na NCM przezwyciężają główne niedociągnięcia hodowli typu kolonijnego, a zatem mogą być odpowiednie do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC dla przyszłych terapii klinicznych, badań nad komórkami macierzystymi i odkrywania leków.

Wprowadzenie

Zdolność hPSC do różnicowania się w kierunku wieloliniowych tkanek dorosłych otworzyła nowe możliwości leczenia pacjentów, którzy cierpią na ciężkie choroby układu sercowo-naczyniowego, wątrobowego, trzustkowego i neurologicznego1-4. Różne typy komórek pochodzących z hPSC zapewniłyby również solidne platformy komórkowe do modelowania chorób, inżynierii genetycznej, badań przesiewowych leków i badań toksykologicznych1,4. Kluczową kwestią, która zapewnia ich przyszłe zastosowania kliniczne i farmakologiczne, jest wytwarzanie dużej liczby hPSC klasy klinicznej poprzez hodowlę komórkową in vitro. Obecne systemy hodowli są jednak albo niewystarczające, albo z natury zmienne, obejmujące różne hodowle hPSC w postaci żywienia i bez karmienia jako kolonii5,6.

Przyrost typu kolonijnego hPSC ma wiele cech strukturalnych wewnętrznej masy komórkowej (ICM) wczesnych zarodków ssaków. ICM ma skłonność do różnicowania się w trzy listki zarodkowe w środowisku wielokomórkowym ze względu na istnienie heterogenicznych gradientów sygnałowych. W związku z tym nabycie heterogeniczności we wczesnym rozwoju embrionalnym jest uważane za proces wymagany do różnicowania, ale za niepożądaną cechę hodowli hPSC. Heterogeniczność hodowli hPSC jest często indukowana przez nadmierne sygnały apoptotyczne i spontaniczne różnicowanie spowodowane nieoptymalnymi warunkami wzrostu. Tak więc w hodowli typu kolonijnego niejednorodne komórki są często obserwowane na obrzeżach kolonii7,8. Wykazano również, że komórki w koloniach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) wykazują zróżnicowane odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe, takie jak BMP-4 9. Co więcej, metody hodowli kolonii dają niską wydajność komórek, a także bardzo niskie wskaźniki odzyskiwania komórek z kriokonserwacji ze względu na niekontrolowane tempo wzrostu i apoptotyczne szlaki sygnałowe6,9. W ostatnich latach opracowano różne kultury zawiesinowe do hodowli hPSC, w szczególności do namnażania dużych ilości hPSC w warunkach wolnych od feederów i matryc6,10-13. Oczywiście różne systemy hodowli mają swoje zalety i wady. Ogólnie rzecz biorąc, niejednorodny charakter hPSC stanowi jedną z głównych wad metod hodowli typu kolonijnego i zagregowanego, które są nieoptymalne w dostarczaniu materiałów DNA i RNA do hPSC na potrzeby inżynierii genetycznej6.

Najwyraźniej istnieje pilna potrzeba opracowania nowych systemów, które obejdą niektóre niedociągnięcia obecnych metod hodowli. Odkrycia inhibitorów małocząsteczkowych (takich jak inhibitor ROCK Y-27632 i inhibitor JAK 1), które poprawiają przeżywalność pojedynczych komórek, torują drogę do zdysocjowanej hodowli hPSC14,15. Wykorzystując te małe cząsteczki, opracowaliśmy niedawno metodę hodowli opartą na wzroście zdysocjowanych hPSC9 bez typu kolonijnego (NCM). Ta nowatorska metoda hodowli łączy w sobie zarówno metody pasażowania pojedynczych komórek, jak i posiewu o dużej gęstości, co pozwala nam wytwarzać duże ilości jednorodnych hPSC w stałych cyklach wzrostu bez poważnych nieprawidłowości chromosomalnych9. Alternatywnie, hodowla NCM może być zaimplementowana z różnymi małymi cząsteczkami i zdefiniowanymi matrycami (takimi jak lamininy) w celu optymalizacji metody hodowli pod kątem szerokich zastosowań. W tym miejscu przedstawiamy kilka szczegółowych protokołów opartych na hodowli NCM i nakreślamy szczegółowe procedury inżynierii genetycznej. Aby zademonstrować wszechstronność protokołów NCM, przetestowaliśmy również hodowlę NCM z różnymi inhibitorami ROCK oraz z pojedynczą izoformą lamininy 521 (tj. LN-521).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Jednokomórkowa hodowla jednowarstwowa (NCM) komórek niekolonijnych hPSC.

1. Przygotowania

  1. Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli mysich fibroblastów embrionalnych (MEF): pożywka DMEM uzupełniona 10% FBS, 2 mM L-glutaminy i 0,1 mM aminokwasów endogennych (NEAA).
  2. Wyizolować mysie fibroblasty embrionalne (MEF) pochodzące ze szczepu CF1 zgodnie z rutynowym protokołem16 i wyhodować MEF na 0,1% pokrytej żelatyną 6-dołkowej płytce do hodowli komórek w pożywce DMEM. Alternatywnie, należy zakupić akcje MEF w przejściu 3 z zasobów komercyjnych.
  3. Przygotuj płytki Matrigel.
    1. Rozcieńczyć 5 ml wywaru Matrigel z kwalifikacją hESC w 5 ml pożywki DMEM/F12 (schłodzonej w temperaturze ~4 °C) i przechowywać w postaci 50% porcji w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Rozmrozić zamrożony wywar Matrigel w lodówce (~4 °C) O/N i dalej rozcieńczyć Matrigel w zimnym podłożu DMEM/F12 (aby uzyskać stężenie robocze 2,5%).
    2. Pokryj 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych 1,5 ml 2,5% Matrigel na dołek, przechowuj powlekane płytki w lodówce O/N (Uwaga: użyj płytki pokrytej Matrigelem w ciągu 2 tygodni).
    3. Wyjąć płytkę Matrigel z lodówki, pozostawić płytkę do ogrzania w temperaturze pokojowej w osłonie do hodowli komórkowych przez 10 do 30 minut (Uwaga: nie podgrzewać płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych) i odessać pożywkę DMEM przed posiewem hPSC.
  4. Przygotuj 500 ml pożywki hESC: 80% pożywki DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM L-glutaminy, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 0,1 mM β-merkaptoetanolu i 4 ng/ml FGF-2.
  5. Przygotuj 10 ml pożywki do zamrażania 2X hPSC: 60% FBS, 20% DMSO i 20 μM Y-27632 w pożywce mTeSR1, wysterylizuj przez filtrację i zużyj pożywkę w ciągu 1 tygodnia.

2. Protokół 1 (Podstawowy): Rozwijaj kolonie hPSC na karmnikach

  1. Użyj numerów pasaży MEF na 5 lub 6 (oznaczonych jako p5 i p6) do hodowli hPSC, aby uzyskać spójne wyniki. Mitotycznie dezaktywować MEF, traktując komórki 10 μg / ml mitomycyny C przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, przemyć komórki 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (D-PBS), a następnie dysocjować MEF za pomocą 0,05% trypsyny w 0,53 mM EDTA. Alternatywnie, naświetlanie MEF dawką 8 000 radów za pomocą promiennika rentgenowskiego.
  2. Policz liczbę komórek za pomocą metody wykluczania plam błękitu trypanowego pod mikroskopem. Alternatywnie użyj automatycznego licznika komórek.
  3. Napromieniane płytki MEF na 6-dołkowych płytkach polistyrenowych pokrytych 0,1% żelatyną o gęstości 1,88 x 105 komórek na dołek (tj. 1,96 x 104 komórki/cm2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
  4. Usunąć pożywkę hodowlaną MEF przez aspirację pipetą Pasteura (Uwaga: w tym momencie nie są wymagane żadne etapy mycia).
  5. Rozbić kolonie hPSC z poprzedniej hodowli na małe grudki, zbadać grudki pod mikroskopem, aby upewnić się, że mają rozmiary od 50 do 100 μm średnicy, a następnie płytki hPSC na wierzchu warstw zasilających MEF w jednym dołku zawierającym 2 ml pożywki hPSC.
  6. Zmieniaj pożywkę hESC codziennie przez 3 do 5 dni, rejestruj wzrost kolonii na fotografii, oznaczaj wszelkie morfologicznie zmienione lub zróżnicowane kolonie (~5%) i ręcznie usuwaj zaznaczone kolonie przez delikatne aspiracje pipetą Pasteura.
  7. Przepłukać pozostałe kolonie na MEF dwukrotnie (po 2 minuty z D-PBS) i inkubować kolonie z 2 ml kolagenazy 1 mg/ml IV w pożywce hPSC przez 10 do 30 minut) i zbadać oderwanie kolonii hPSC od powierzchni pokrytej MEF (Uwaga: użyć skrobaka, aby wspomóc proces odrywania tylko wtedy, gdy kolonie są ściśle przymocowane do płytki).
  8. Dodać 5 ml pożywki hPSC do każdej studzienki, aby zminimalizować reakcje enzymatyczne, przenieść kolonie do probówki o pojemności 15 ml, pozwolić koloniom hPSC na osadzanie się przez 3 do 5 minut w temperaturze pokojowej i zapewnić sedymentację kolonii poprzez bezpośrednią wizualizację komórek na dnie probówki (Uwaga: nie należy odwirowywać probówki na tym etapie).
  9. Usunąć supernatanty zawierające resztki MEF i zdysocjowane pojedyncze komórki, ponownie zawiesić kolonie za pomocą 5 ml pożywki hESC i powtórzyć etap sedymentacji dwukrotnie.
  10. Usunąć pożywkę, rozbić kolonie hPSC na małe grudki, przechowywać w pożywce do zamrażania 1X hPSC (lub pożywce do zamrażania CryoStore CS10) w celu kriokonserwacji (1 studzienka konfluentna na zamrożoną fiolkę) lub na płytce 6-dołkowej do pasażowania komórek.

3. Protokół 2: Konwersja kolonii hPSC z karmników na NCM

  1. Przepłukać granulki hPSC w D-PBS raz, inkubować granulki z 1 ml 1X Accutase przez 10 minut i zbadać reakcję enzymatyczną pod mikroskopem, aby zapewnić dysocjację pojedynczych komórek.
  2. Zakończyć reakcje enzymatyczne poprzez delikatne ponowne zawieszenie komórek w 5 ml pożywki mTeSR1 zawierającej 10 μM Y-27632, a następnie odwirowanie przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut (Uwaga, nie należy stosować nadmiernych sił wirowania, które powodują uszkodzenie komórek).
  3. Dodać 5 ml pożywki mTeSR1 do osadu, zawiesić ponownie osad jako pojedyncze komórki i przefiltrować zdysocjowane komórki przez sitko do komórek o wielkości 40 μm (w celu usunięcia wszelkich pozostałości agregatów komórkowych).
  4. Wysiewać 1,3-2 x 106 hPSC do jednego dołka (1,4-2,1 x 105 komórek/cm2) 6-dołkowej płytki pokrytej 2,5% Matrigelem kwalifikowanym do hESC, dodać pożywkę mTeSR1 do 2,5 ml i dodać 10 μM Y-27632 do pożywki (w celu ułatwienia początkowego 24-godzinnego posiewu jednokomórkowego). Alternatywnie wykorzystaj następujące małe cząsteczki do zastąpienia 10 μM Y-27632 w celu poprawy posiewu pojedynczych komórek: 1 μM Y-39983 (inhibitor ROCK I), 1 μM fenylobenzodioksan (inhibitor ROCK II), 1 μM tiazowiwina (nowy inhibitor ROCK) i 2 μM inhibitor JAK 1.
  5. Zastąp pożywkę pożywką wolną od leków pożywką mTeSR1 następnego dnia (w ciągu 24 godzin), oddziel komórki od jednego dodatkowego dołka i policz liczbę komórek, aby określić wydajność posiewu pojedynczego ogniwa (Uwaga: w przybliżeniu 50 do 90% wydajności posiewu pojedynczej komórki, którą można osiągnąć na tym etapie).
  6. Pozwól komórkom rosnąć jako monowarstwa utworzona z pojedynczej komórki przez kilka dni z 3 ml pożywki mTeSR1. Zmieniaj medium codziennie.
  7. Empirycznie określ harmonogram pasażowania dostosowany NCM w zależności od gęstości komórek. Pasaż, gdy wzrost komórek osiąga konfluencję w 3 lub 4 dniu lub w 4 dniu po 4 godzinach po zaniku granic między komórkami. Oddzielić komórki w 1 ml Accutasae, użyć stosunku podziału 1 do 3 (tj. 1 studzienka konfluencyjna komórek posianych w 3 dołkach na płytce 6-dołkowej) do pasażowania komórek i ustabilizować przystosowany NCM przez 5 pasaży.
  8. Zamrażanie komórek
    1. Wykorzystaj jedną studzienkę zlewającą się (~ 5-6 x106 komórek) na jedną zamrożoną fiolkę: dysocjuj komórki z jednej studzienki zlewającej się za pomocą 1 ml Accutase przez 10 minut.
    2. Rozcieńczyć 5 ml pożywki mTeSR1 i odwirować komórki, jak opisano powyżej.
    3. Zawiesić osad w 500 μl pożywki mTeSR1, a następnie powoli dodać 500 μl pożywki do zamrażania 2X hPSC (zawierającej 20 μM Y-27632) w fiolce do kriokonserwacji. Alternatywnie, ponownie zawiesić komórki w pożywce do zamrażania 1X hPSC zawierającej 2 μM inhibitor JAK 1 lub pożywkę 1X CryoStor CS10 w obecności 10 μM Y-27632 lub 2 μM inhibitora JAK 1.
    4. Umieścić zamrożone fiolki w kriopojemniku chłodzonym lodem (od dna wypełnionym izopranolem) i natychmiast przenieść kriopojemnik do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
    5. Przenieś komórki z zamrażarki o temperaturze -80 °C do zbiornika z ciekłym azotem (następnego dnia) w celu długotrwałej kriokonserwacji.
  9. Rozmrażanie komórek
    1. Użyj jednej fiolki do krioprezerwacji do posiewu 1 dołka z płytki 6-dołkowej.
    2. Wstępnie podgrzać pożywkę mTeSR1 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut, rozmrażać komórki w tej samej łaźni wodnej przez 2 minuty, kroplami dodawać komórki do 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 zawierającej 10 μM Y-27632 i odwirować, jak opisano powyżej.
    3. Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą 2 ml pożywki mTeSR1 zawierającej 10 μM Y-27632 i powoli przenieść komórki do studzienki wstępnie pokrytej Matrigelem (Uwaga: unikać wytwarzania pęcherzyków powietrza).
    4. Zmieniaj podłoże codziennie i spodziewaj się, że wzrost hPSC osiągnie konfluencję w 3 lub 4 dniu.

4. Protokół 3: Konwersja kolonii hPSC na Matrigel na kulturę NCM

  1. Wyjąć płytkę pokrytą Matrigelem z lodówki, umieścić płytkę w kapturze do hodowli tkankowych na 10 do 30 minut, usunąć pożywkę z każdej studzienki płytki i dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 do każdej studzienki.
  2. Przenieść roztarte grudki hPSC z kultury karmicielskiej (krok 2.10 protokołu podstawowego) na powyższą płytkę Matrigel. Dodać pożywkę mTeSR1 do 2,5 ml końcowej objętości do każdego dołka.
  3. Zmieniaj podłoże codziennie przez 3 do 4 dni, aż kolonie osiągną 80 do 90% zbieżności.
  4. W przypadku pasażowania komórek: dwukrotnie przepłukać kolonie D-PBS, potraktować komórki 1 ml 2 mg/ml dypazy w temperaturze 37 °C przez 15 do 20 minut, a następnie osadzać i pasować komórki w postaci grudek.
  5. W przypadku hodowli NCM: powtórzyć kroki od 3.1 do 3.9 opisane w Protokole 2.

5. Protokół 4: NCM Hodowla hPSC na LN-521

  1. Rozmrozić rekombinowany roztwór LN-521 w temperaturze 4 °C przed dniem użycia i przygotować roztwór powlekający lamininę (LCS) przez rozcieńczenie rozmrożonej lamininy 1X D-PBS (zawierającej Ca2+/Mg2+) do końcowego stężenia 10 μg/ml.
  2. Dodać 1 ml LCS do jednego dołka w płytce 6-dołkowej (uwaga: unikać wysuszenia podczas procesu powlekania).
  3. Uszczelnij powlekaną płytkę Parafilmem, aby zapobiec parowaniu i przechowuj płytkę w lodówce (4 °C) O/N (uwaga: zużyć płytkę w ciągu 1 tygodnia).
  4. Delikatnie usunąć LCS za pomocą pipety Pasteura, nie dotykając powlekanej powierzchni i dodać 2 ml pożywki mTeSR1 do jednego dołka.
  5. Ogrzewać wszystkie roztwory hodowlane (w tym D-PBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 25 minut.
  6. Konwertuj kolonie hPSC na NCM
    1. Dysocjuj agregaty komórkowe na pojedyncze komórki za pomocą Accutazy, jak opisano w Protokole 2.
    2. Wysiewać 1,3-2 x 106 hPSC do jednego dołka pokrytego LN-521 (1,4-2,1 x 105 komórek/cm2) bez obecności inhibitorów ROCK.
    3. Zmieniaj podłoże codziennie przez 3 do 4 dni.
    4. Dysocjuj komórki w 1 ml Accutase w 3 lub 4 dniu do następnego pasażowania komórek, stosując stosunek podziału 1 do 3.

6. Protokół 5: Hodowla NCM do transfekcji plazmidowego DNA

  1. Dostosuj kolonie hPSC do hodowli NCM zgodnie z opisem w protokołach od 2 do 4.
  2. Zdysocjowane hPSC na płytce 12-dołkowej o gęstości komórek 7,5 x 105 komórek/basenik w pożywce mTeSR1 w obecności 10 μM Y-27632.
  3. Zastąp pożywkę mTeSR1 pożywką wolną od leków pożywką mTeSR1 między 4-8 godzinami po posianiu komórek.
  4. Dla każdej transfekcji rozcieńczyć 2,5 μg plazmidów ekspresyjnych (np. pmaxGFP) i 5 μl Lipofectamine 2000 w oddzielnych probówkach Eppendorfa w 125 μl każdej pożywki Opti-MEM o zmniejszonej surowicy.
  5. Po 5 minutach wymieszać rozcieńczone odczynniki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (do utworzenia kompleksów transfekcyjnych).
  6. Dodać 250 μl kompleksów transfekcyjnych do każdej studzienki zawierającej hPSC w 1 ml pożywki mTeSR1 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 24 godziny.
  7. Zbadaj wydajność transfekcji pod mikroskopem fluorescencyjnym i sfotografuj losowo w celu obliczenia rzeczywistej wydajności transfekcji.

7. Protokół 6: Hodowla NCM do transfekcji mikroRNA

  1. Dysocjację półkonfluentnych hPSC w dniu 2 w warunkach NCM należy dodać 1 ml Accutazy na studzienkę na płytce 6-dołkowej.
  2. Dodać 10 ml pożywki mTeSR1 do rozcieńczenia reakcji enzymatycznych i odwirować przy 200 x g przez 5 min.
  3. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki mTeSR1, zasiać komórki w gęstości 7,5 x 105 komórek na dołek na 12-dołkowej płytce w pożywce mTeSR1 zawierającej 10 μM Y-27632 i pozwolić komórkom przyczepić się na 4 godziny.
  4. Wymień pożywkę na pożywkę mTeSR1 wolną od Y27632.
  5. Użyj dostępnych na rynku mikroRNA (np. nieukierunkowanej kontroli transfekcji miRNA miRIDIAN znakowanej Dy547). Miareczkować stężenia w zakresie 0-160 nM za pomocą dostarczonych odczynników i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Zoptymalizuj wydajność transfekcji dla każdego stężenia w liniach hPSC, obrazując fluorescencję Dy547 żywych komórek pod mikroskopem po 24 godzinach od transfekcji.
  7. Oblicz wydajność transfekcji na podstawie procentu komórek dodatnich Dy547 we wszystkich obrazowanych komórkach.

8. Protokół 7: Hodowla NCM do transdukcji wektora lentiwirusowego

  1. Powtórz kroki od 7.1 do 7.4 protokołu 6.
  2. Oblicz ilości cząstek wirusa, które mają być użyte do transdukcji: Użyj następującego wzoru: TU = (MOI x CN) / VT, podczas gdy TU oznacza całkowitą liczbę jednostek transformujących, MOI równa się pożądanej wielokrotności infekcji w studzience (MOI lub TU / komórka), CN określa liczbę komórek w każdym dołku, a VT wskazuje podstawowe miana wirusa (TU / ml). Na przykład, biorąc pod uwagę, że podstawowe miana wirusa dla wektora SMART-shRNA wynoszą 1 x 109 TU/ml (jednostek transformujących na ml), 7,5 x 105 komórek na studzienkę w czasie transdukcji i oczekiwany MOI wynoszący 20: użyj 15 μl podstawowych cząstek wirusa dla każdej studzienki (uwaga: ten warunek jest zalecany dla przejściowej indukcji lentiwirusa).
  3. Podgrzej 300 μl pożywki mTeSR1 z 10 mg/ml polibrenu przez 30 minut.
  4. Dodać 15 μl podstawowych cząstek wirusa do wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 zawierającej polibren i delikatnie wymieszać roztwór.
  5. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej cząsteczki wirusa.
  6. Po 4 godzinach inkubacji zbadaj fluorescencję turboGFP (twórcę ekspresji shRNA), aby określić wydajność transdukcji.
  7. Dodać 300 μl dodatkowej pożywki mTeSR1 do dołka transdukcyjnego, gdy komórki zaczną wyrażać turboGFP.
  8. Po 12-16 godzinach inkubacji ponownie zbadaj ekspresję turbo-GFP.
  9. Wykonaj pożądane eksperymenty kontrolne z tymi transdukowanymi komórkami w ciągu 72 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat hodowli NCM

Rycina 1 przedstawia typowy schemat hodowli NCM, pokazujący dynamiczne zmiany hPSC po wysianiu pojedynczych komórek o wysokiej gęstości w obecności inhibitora ROCK Y-27632. Zmiany morfologiczne te obejmują tworzenie połączeń międzykomórkowych po wysianiu, formowanie się klastrów komórkowych oraz wykładniczy wzrost komórek, po którym następuje ich kondensacja (Rycina 1A). Reprezentatywny eksperyment wskazuje, że hESC ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieją dwa główne sposoby hodowli hPSC in vitro: konwencjonalna hodowla typu kolonijnego (komórek na karmnikach lub matrycach zewnątrzkomórkowych) oraz hodowla zawiesinowa hPSC w postaci agregatów bez składników odżywczych6. Ograniczenia zarówno metod hodowli typu kolonii, jak i zawiesiny, obejmują skumulowaną heterogeniczność i dziedziczne zmiany epigenetyczne. Hodowla NCM, oparta zarówno na pasażowaniu pojedynczych komórek, jak i posiewaniu komórek o dużej gęstości, stanowi nową metodę hodowli dla...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) w National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Chcielibyśmy podziękować dr Ronaldowi D. McKayowi za dyskusję i komentarze na temat tego projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hrabina automatyczny licznik komórekInvitrogen Inc.C10227Automatyczne liczenie komórek
System rentgenowski w szafie faksytronowejFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Model RX-650Naświetlanie promieniami rentgenowskimi MEF MULTIWELL
6-dołkowe płytkiBecton Dickinson Labware353046Płytki polistyrenowe
DMEMInvitrogen Inc.11965– 092Dla podłoża MEF
Mitomycyna CRoche107409Inhibitor mitotyczny
TrypsinInvitrogen Inc.25300-054Do dysocjacji MEF
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330– 032Dla pożywki hPSC
Opti-MEM I Zredukowana pożywka surowicy Invitrogen Inc.31985-062Do transfekcji hPSC
Inaktywowany termicznie FBSInvitrogen Inc.16000– 044Składnik MEF medium
Knockout Serum ReplacementInvitrogen Inc.10828– 028KSR, Składnik pożywki hPSC
Dulbecco" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, wolny od Ca2+/Mg2+
Aminokwasy endogenneInvitrogen11140– 050NEAA, składnik pożywki hPSC
L-GlutaminaInvitrogen 25030– 081Składnik pożywki hPSC
mTeSR1 & SuplementyStemCell Technologies5850białka zwierzęcego
i SuplementyStemCell Technologies5860Xeno-free medium
β-merkaptoetanolSigma M7522Składnik hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040Do hodowli feederowej hPSC
BD Bioscience354277kwalifikacją hESCDo hodowli hPSC bez karmienia
Laminin-521BioLaminaLN521-02Ludzkie rekombinowane białko
FGF-2 (rekombinowane FGF, zasadowe)R& D Systems, MN223-FBCzynnik wzrostu w pożywce hPSC
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X mieszany roztwór enzymatyczny
Inhibitor JAK IEMD4 Biosciences420099Inhibitor kinazy janusowej
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK
Y-27632Stemgent04-0012Inhibitor ROCK
Y-39983Stemgent04-0029Inhibitor ROCK I
FenylobenzodioksanStemgent04-0030Inhibitor ROCK II
TiazovivinStemgent04-0017Nowy inhibitor ROCK
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µ m sitko do komórek
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 ° CThermo Naukowy C6516F-1"Pan Mroźny" Pojemnik do zamrażania
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Odczynniki do transfekcji
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Odczynnik do transfekcji
Nieukierunkowany miRIDIAN miRNA Transfekcja Kontrola ThermoScientificIP-004500-01-05Znakowany Dy547, do monitorowania dostarczania mikroRNA 
SMART-shRNAThermo Naukowy Do ustaleniaWektor lentiwirusowy
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Zawarte w każdym zestawie do transfekcjiPlazmid ekspresyjny do kontroli transfekcji
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279Mysz IgG2b, marker pluripotencjalny
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702Mysz IgM, marker różnicowania
SSEA-4Santa Cruz Biotechnologiasc-21704Mysia IgG3, marker pluripotencjalny
Tra-1-60Santa Cruz Biotechnologysc-21705 Mysi IgM, marker pluripotencjalny
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706Mysia IgM, pluripotencjalny marker
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020Mysia IgG1, przeciwko cytokeratynie 8
&alfa;-fetoproteinieSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, mysz IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, kozie przeciwciało poliklonalne
Troponina T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Mysz IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Królik IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JaponiaRCAB0004P-FPrzeciwciało poliklonalne 
Szczurzy anty-GFAPZymed13-0300Albumina kwasowego białka fibrylarnego glejowego
(klon HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AMysz IgG1
Aktyna mięśni gładkich (klon 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611Mysz IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Przeciwciało poliklonalne królika
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, mysz IgG2a
HNF4α (C11F12)Technologie sygnalizacji komórkowej3113Królicze przeciwciało monoklonalne
Paraformaldehyd (roztwór)Nauki o mikroskopii elektronowej15710PFA, utrwalacz, rozcieńczony w D-PBS
TeSR2 bez American Matrigel z inhibitor

Bibliografia

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167(2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ludzkie pluripotencjalne kom rki macierzystehodowla monowarstwowainhibitor ROCK Y 27632hodowla na lamininie 521modyfikacja genetycznatransfekcja kom rekekspansja kom rek macierzystychhodowla na zdefiniowanych bia kachinhibitory ma ocz steczkowehodowla bezkolonijna
Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.