Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zdolność hPSC do różnicowania się w kierunku wieloliniowych tkanek dorosłych otworzyła nowe możliwości leczenia pacjentów, którzy cierpią na ciężkie choroby układu sercowo-naczyniowego, wątrobowego, trzustkowego i neurologicznego^1-4. Różne typy komórek pochodzących z hPSC zapewniłyby również solidne platformy komórkowe do modelowania chorób, inżynierii genetycznej, badań przesiewowych leków i badań toksykologicznych^1,4. Kluczową kwestią, która zapewnia ich przyszłe zastosowania kliniczne i farmakologiczne, jest wytwarzanie dużej liczby hPSC klasy klinicznej poprzez hodowlę komórkową in vitro. Obecne systemy hodowli są jednak albo niewystarczające, albo z natury zmienne, obejmujące różne hodowle hPSC w postaci żywienia i bez karmienia jako kolonii^5,6.

Przyrost typu kolonijnego hPSC ma wiele cech strukturalnych wewnętrznej masy komórkowej (ICM) wczesnych zarodków ssaków. ICM ma skłonność do różnicowania się w trzy listki zarodkowe w środowisku wielokomórkowym ze względu na istnienie heterogenicznych gradientów sygnałowych. W związku z tym nabycie heterogeniczności we wczesnym rozwoju embrionalnym jest uważane za proces wymagany do różnicowania, ale za niepożądaną cechę hodowli hPSC. Heterogeniczność hodowli hPSC jest często indukowana przez nadmierne sygnały apoptotyczne i spontaniczne różnicowanie spowodowane nieoptymalnymi warunkami wzrostu. Tak więc w hodowli typu kolonijnego niejednorodne komórki są często obserwowane na obrzeżach kolonii^7,8. Wykazano również, że komórki w koloniach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) wykazują zróżnicowane odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe, takie jak BMP-4 ⁹. Co więcej, metody hodowli kolonii dają niską wydajność komórek, a także bardzo niskie wskaźniki odzyskiwania komórek z kriokonserwacji ze względu na niekontrolowane tempo wzrostu i apoptotyczne szlaki sygnałowe^6,9. W ostatnich latach opracowano różne kultury zawiesinowe do hodowli hPSC, w szczególności do namnażania dużych ilości hPSC w warunkach wolnych od feederów i matryc^6,10-13. Oczywiście różne systemy hodowli mają swoje zalety i wady. Ogólnie rzecz biorąc, niejednorodny charakter hPSC stanowi jedną z głównych wad metod hodowli typu kolonijnego i zagregowanego, które są nieoptymalne w dostarczaniu materiałów DNA i RNA do hPSC na potrzeby inżynierii genetycznej⁶.

Najwyraźniej istnieje pilna potrzeba opracowania nowych systemów, które obejdą niektóre niedociągnięcia obecnych metod hodowli. Odkrycia inhibitorów małocząsteczkowych (takich jak inhibitor ROCK Y-27632 i inhibitor JAK 1), które poprawiają przeżywalność pojedynczych komórek, torują drogę do zdysocjowanej hodowli hPSC^14,15. Wykorzystując te małe cząsteczki, opracowaliśmy niedawno metodę hodowli opartą na wzroście zdysocjowanych hPSC⁹ bez typu kolonijnego (NCM). Ta nowatorska metoda hodowli łączy w sobie zarówno metody pasażowania pojedynczych komórek, jak i posiewu o dużej gęstości, co pozwala nam wytwarzać duże ilości jednorodnych hPSC w stałych cyklach wzrostu bez poważnych nieprawidłowości chromosomalnych⁹. Alternatywnie, hodowla NCM może być zaimplementowana z różnymi małymi cząsteczkami i zdefiniowanymi matrycami (takimi jak lamininy) w celu optymalizacji metody hodowli pod kątem szerokich zastosowań. W tym miejscu przedstawiamy kilka szczegółowych protokołów opartych na hodowli NCM i nakreślamy szczegółowe procedury inżynierii genetycznej. Aby zademonstrować wszechstronność protokołów NCM, przetestowaliśmy również hodowlę NCM z różnymi inhibitorami ROCK oraz z pojedynczą izoformą lamininy 521 (tj. LN-521).

Jednokomórkowa hodowla jednowarstwowa (NCM) komórek niekolonijnych hPSC.

1. Przygotowania

1. Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli mysich fibroblastów embrionalnych (MEF): pożywka DMEM uzupełniona 10% FBS, 2 mM L-glutaminy i 0,1 mM aminokwasów endogennych (NEAA).
2. Wyizolować mysie fibroblasty embrionalne (MEF) pochodzące ze szczepu CF1 zgodnie z rutynowym protokołem¹⁶ i wyhodować MEF na 0,1% pokrytej żelatyną 6-dołkowej płytce do hodowli komórek w pożywce DMEM. Alternatywnie, należy zakupić akcje MEF w przejściu 3 z zasobów komercyjnych.
3. Przygotuj płytki Matrigel.
   1. Rozcieńczyć 5 ml wywaru Matrigel z kwalifikacją hESC w 5 ml pożywki DMEM/F12 (schłodzonej w temperaturze ~4 °C) i przechowywać w postaci 50% porcji w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Rozmrozić zamrożony wywar Matrigel w lodówce (~4 °C) O/N i dalej rozcieńczyć Matrigel w zimnym podłożu DMEM/F12 (aby uzyskać stężenie robocze 2,5%).
   2. Pokryj 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych 1,5 ml 2,5% Matrigel na dołek, przechowuj powlekane płytki w lodówce O/N (Uwaga: użyj płytki pokrytej Matrigelem w ciągu 2 tygodni).
   3. Wyjąć płytkę Matrigel z lodówki, pozostawić płytkę do ogrzania w temperaturze pokojowej w osłonie do hodowli komórkowych przez 10 do 30 minut (Uwaga: nie podgrzewać płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych) i odessać pożywkę DMEM przed posiewem hPSC.
4. Przygotuj 500 ml pożywki hESC: 80% pożywki DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM L-glutaminy, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 0,1 mM β-merkaptoetanolu i 4 ng/ml FGF-2.
5. Przygotuj 10 ml pożywki do zamrażania 2X hPSC: 60% FBS, 20% DMSO i 20 μM Y-27632 w pożywce mTeSR1, wysterylizuj przez filtrację i zużyj pożywkę w ciągu 1 tygodnia.

2. Protokół 1 (Podstawowy): Rozwijaj kolonie hPSC na karmnikach

1. Użyj numerów pasaży MEF na 5 lub 6 (oznaczonych jako p5 i p6) do hodowli hPSC, aby uzyskać spójne wyniki. Mitotycznie dezaktywować MEF, traktując komórki 10 μg / ml mitomycyny C przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, przemyć komórki 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (D-PBS), a następnie dysocjować MEF za pomocą 0,05% trypsyny w 0,53 mM EDTA. Alternatywnie, naświetlanie MEF dawką 8 000 radów za pomocą promiennika rentgenowskiego.
2. Policz liczbę komórek za pomocą metody wykluczania plam błękitu trypanowego pod mikroskopem. Alternatywnie użyj automatycznego licznika komórek.
3. Napromieniane płytki MEF na 6-dołkowych płytkach polistyrenowych pokrytych 0,1% żelatyną o gęstości 1,88 x 10⁵ komórek na dołek (tj. 1,96 x 10⁴ komórki/cm²). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 godziny.
4. Usunąć pożywkę hodowlaną MEF przez aspirację pipetą Pasteura (Uwaga: w tym momencie nie są wymagane żadne etapy mycia).
5. Rozbić kolonie hPSC z poprzedniej hodowli na małe grudki, zbadać grudki pod mikroskopem, aby upewnić się, że mają rozmiary od 50 do 100 μm średnicy, a następnie płytki hPSC na wierzchu warstw zasilających MEF w jednym dołku zawierającym 2 ml pożywki hPSC.
6. Zmieniaj pożywkę hESC codziennie przez 3 do 5 dni, rejestruj wzrost kolonii na fotografii, oznaczaj wszelkie morfologicznie zmienione lub zróżnicowane kolonie (~5%) i ręcznie usuwaj zaznaczone kolonie przez delikatne aspiracje pipetą Pasteura.
7. Przepłukać pozostałe kolonie na MEF dwukrotnie (po 2 minuty z D-PBS) i inkubować kolonie z 2 ml kolagenazy 1 mg/ml IV w pożywce hPSC przez 10 do 30 minut) i zbadać oderwanie kolonii hPSC od powierzchni pokrytej MEF (Uwaga: użyć skrobaka, aby wspomóc proces odrywania tylko wtedy, gdy kolonie są ściśle przymocowane do płytki).
8. Dodać 5 ml pożywki hPSC do każdej studzienki, aby zminimalizować reakcje enzymatyczne, przenieść kolonie do probówki o pojemności 15 ml, pozwolić koloniom hPSC na osadzanie się przez 3 do 5 minut w temperaturze pokojowej i zapewnić sedymentację kolonii poprzez bezpośrednią wizualizację komórek na dnie probówki (Uwaga: nie należy odwirowywać probówki na tym etapie).
9. Usunąć supernatanty zawierające resztki MEF i zdysocjowane pojedyncze komórki, ponownie zawiesić kolonie za pomocą 5 ml pożywki hESC i powtórzyć etap sedymentacji dwukrotnie.
10. Usunąć pożywkę, rozbić kolonie hPSC na małe grudki, przechowywać w pożywce do zamrażania 1X hPSC (lub pożywce do zamrażania CryoStore CS10) w celu kriokonserwacji (1 studzienka konfluentna na zamrożoną fiolkę) lub na płytce 6-dołkowej do pasażowania komórek.

3. Protokół 2: Konwersja kolonii hPSC z karmników na NCM

1. Przepłukać granulki hPSC w D-PBS raz, inkubować granulki z 1 ml 1X Accutase przez 10 minut i zbadać reakcję enzymatyczną pod mikroskopem, aby zapewnić dysocjację pojedynczych komórek.
2. Zakończyć reakcje enzymatyczne poprzez delikatne ponowne zawieszenie komórek w 5 ml pożywki mTeSR1 zawierającej 10 μM Y-27632, a następnie odwirowanie przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut (Uwaga, nie należy stosować nadmiernych sił wirowania, które powodują uszkodzenie komórek).
3. Dodać 5 ml pożywki mTeSR1 do osadu, zawiesić ponownie osad jako pojedyncze komórki i przefiltrować zdysocjowane komórki przez sitko do komórek o wielkości 40 μm (w celu usunięcia wszelkich pozostałości agregatów komórkowych).
4. Wysiewać 1,3-2 x 10⁶ hPSC do jednego dołka (1,4-2,1 x 10⁵ komórek/cm²) 6-dołkowej płytki pokrytej 2,5% Matrigelem kwalifikowanym do hESC, dodać pożywkę mTeSR1 do 2,5 ml i dodać 10 μM Y-27632 do pożywki (w celu ułatwienia początkowego 24-godzinnego posiewu jednokomórkowego). Alternatywnie wykorzystaj następujące małe cząsteczki do zastąpienia 10 μM Y-27632 w celu poprawy posiewu pojedynczych komórek: 1 μM Y-39983 (inhibitor ROCK I), 1 μM fenylobenzodioksan (inhibitor ROCK II), 1 μM tiazowiwina (nowy inhibitor ROCK) i 2 μM inhibitor JAK 1.
5. Zastąp pożywkę pożywką wolną od leków pożywką mTeSR1 następnego dnia (w ciągu 24 godzin), oddziel komórki od jednego dodatkowego dołka i policz liczbę komórek, aby określić wydajność posiewu pojedynczego ogniwa (Uwaga: w przybliżeniu 50 do 90% wydajności posiewu pojedynczej komórki, którą można osiągnąć na tym etapie).
6. Pozwól komórkom rosnąć jako monowarstwa utworzona z pojedynczej komórki przez kilka dni z 3 ml pożywki mTeSR1. Zmieniaj medium codziennie.
7. Empirycznie określ harmonogram pasażowania dostosowany NCM w zależności od gęstości komórek. Pasaż, gdy wzrost komórek osiąga konfluencję w 3 lub 4 dniu lub w 4 dniu po 4 godzinach po zaniku granic między komórkami. Oddzielić komórki w 1 ml Accutasae, użyć stosunku podziału 1 do 3 (tj. 1 studzienka konfluencyjna komórek posianych w 3 dołkach na płytce 6-dołkowej) do pasażowania komórek i ustabilizować przystosowany NCM przez 5 pasaży.
8. Zamrażanie komórek
   1. Wykorzystaj jedną studzienkę zlewającą się (~ 5-6 x10⁶ komórek) na jedną zamrożoną fiolkę: dysocjuj komórki z jednej studzienki zlewającej się za pomocą 1 ml Accutase przez 10 minut.
   2. Rozcieńczyć 5 ml pożywki mTeSR1 i odwirować komórki, jak opisano powyżej.
   3. Zawiesić osad w 500 μl pożywki mTeSR1, a następnie powoli dodać 500 μl pożywki do zamrażania 2X hPSC (zawierającej 20 μM Y-27632) w fiolce do kriokonserwacji. Alternatywnie, ponownie zawiesić komórki w pożywce do zamrażania 1X hPSC zawierającej 2 μM inhibitor JAK 1 lub pożywkę 1X CryoStor CS10 w obecności 10 μM Y-27632 lub 2 μM inhibitora JAK 1.
   4. Umieścić zamrożone fiolki w kriopojemniku chłodzonym lodem (od dna wypełnionym izopranolem) i natychmiast przenieść kriopojemnik do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
   5. Przenieś komórki z zamrażarki o temperaturze -80 °C do zbiornika z ciekłym azotem (następnego dnia) w celu długotrwałej kriokonserwacji.
9. Rozmrażanie komórek
   1. Użyj jednej fiolki do krioprezerwacji do posiewu 1 dołka z płytki 6-dołkowej.
   2. Wstępnie podgrzać pożywkę mTeSR1 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut, rozmrażać komórki w tej samej łaźni wodnej przez 2 minuty, kroplami dodawać komórki do 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 zawierającej 10 μM Y-27632 i odwirować, jak opisano powyżej.
   3. Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą 2 ml pożywki mTeSR1 zawierającej 10 μM Y-27632 i powoli przenieść komórki do studzienki wstępnie pokrytej Matrigelem (Uwaga: unikać wytwarzania pęcherzyków powietrza).
   4. Zmieniaj podłoże codziennie i spodziewaj się, że wzrost hPSC osiągnie konfluencję w 3 lub 4 dniu.

4. Protokół 3: Konwersja kolonii hPSC na Matrigel na kulturę NCM

1. Wyjąć płytkę pokrytą Matrigelem z lodówki, umieścić płytkę w kapturze do hodowli tkankowych na 10 do 30 minut, usunąć pożywkę z każdej studzienki płytki i dodać 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 do każdej studzienki.
2. Przenieść roztarte grudki hPSC z kultury karmicielskiej (krok 2.10 protokołu podstawowego) na powyższą płytkę Matrigel. Dodać pożywkę mTeSR1 do 2,5 ml końcowej objętości do każdego dołka.
3. Zmieniaj podłoże codziennie przez 3 do 4 dni, aż kolonie osiągną 80 do 90% zbieżności.
4. W przypadku pasażowania komórek: dwukrotnie przepłukać kolonie D-PBS, potraktować komórki 1 ml 2 mg/ml dypazy w temperaturze 37 °C przez 15 do 20 minut, a następnie osadzać i pasować komórki w postaci grudek.
5. W przypadku hodowli NCM: powtórzyć kroki od 3.1 do 3.9 opisane w Protokole 2.

5. Protokół 4: NCM Hodowla hPSC na LN-521

1. Rozmrozić rekombinowany roztwór LN-521 w temperaturze 4 °C przed dniem użycia i przygotować roztwór powlekający lamininę (LCS) przez rozcieńczenie rozmrożonej lamininy 1X D-PBS (zawierającej Ca²⁺/Mg²⁺) do końcowego stężenia 10 μg/ml.
2. Dodać 1 ml LCS do jednego dołka w płytce 6-dołkowej (uwaga: unikać wysuszenia podczas procesu powlekania).
3. Uszczelnij powlekaną płytkę Parafilmem, aby zapobiec parowaniu i przechowuj płytkę w lodówce (4 °C) O/N (uwaga: zużyć płytkę w ciągu 1 tygodnia).
4. Delikatnie usunąć LCS za pomocą pipety Pasteura, nie dotykając powlekanej powierzchni i dodać 2 ml pożywki mTeSR1 do jednego dołka.
5. Ogrzewać wszystkie roztwory hodowlane (w tym D-PBS) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 25 minut.
6. Konwertuj kolonie hPSC na NCM
   1. Dysocjuj agregaty komórkowe na pojedyncze komórki za pomocą Accutazy, jak opisano w Protokole 2.
   2. Wysiewać 1,3-2 x 10⁶ hPSC do jednego dołka pokrytego LN-521 (1,4-2,1 x 10⁵ komórek/cm²) bez obecności inhibitorów ROCK.
   3. Zmieniaj podłoże codziennie przez 3 do 4 dni.
   4. Dysocjuj komórki w 1 ml Accutase w 3 lub 4 dniu do następnego pasażowania komórek, stosując stosunek podziału 1 do 3.

6. Protokół 5: Hodowla NCM do transfekcji plazmidowego DNA

1. Dostosuj kolonie hPSC do hodowli NCM zgodnie z opisem w protokołach od 2 do 4.
2. Zdysocjowane hPSC na płytce 12-dołkowej o gęstości komórek 7,5 x 10⁵ komórek/basenik w pożywce mTeSR1 w obecności 10 μM Y-27632.
3. Zastąp pożywkę mTeSR1 pożywką wolną od leków pożywką mTeSR1 między 4-8 godzinami po posianiu komórek.
4. Dla każdej transfekcji rozcieńczyć 2,5 μg plazmidów ekspresyjnych (np. pmaxGFP) i 5 μl Lipofectamine 2000 w oddzielnych probówkach Eppendorfa w 125 μl każdej pożywki Opti-MEM o zmniejszonej surowicy.
5. Po 5 minutach wymieszać rozcieńczone odczynniki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (do utworzenia kompleksów transfekcyjnych).
6. Dodać 250 μl kompleksów transfekcyjnych do każdej studzienki zawierającej hPSC w 1 ml pożywki mTeSR1 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ przez 24 godziny.
7. Zbadaj wydajność transfekcji pod mikroskopem fluorescencyjnym i sfotografuj losowo w celu obliczenia rzeczywistej wydajności transfekcji.

7. Protokół 6: Hodowla NCM do transfekcji mikroRNA

1. Dysocjację półkonfluentnych hPSC w dniu 2 w warunkach NCM należy dodać 1 ml Accutazy na studzienkę na płytce 6-dołkowej.
2. Dodać 10 ml pożywki mTeSR1 do rozcieńczenia reakcji enzymatycznych i odwirować przy 200 x g przez 5 min.
3. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki mTeSR1, zasiać komórki w gęstości 7,5 x 10⁵ komórek na dołek na 12-dołkowej płytce w pożywce mTeSR1 zawierającej 10 μM Y-27632 i pozwolić komórkom przyczepić się na 4 godziny.
4. Wymień pożywkę na pożywkę mTeSR1 wolną od Y27632.
5. Użyj dostępnych na rynku mikroRNA (np. nieukierunkowanej kontroli transfekcji miRNA miRIDIAN znakowanej Dy547). Miareczkować stężenia w zakresie 0-160 nM za pomocą dostarczonych odczynników i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Zoptymalizuj wydajność transfekcji dla każdego stężenia w liniach hPSC, obrazując fluorescencję Dy547 żywych komórek pod mikroskopem po 24 godzinach od transfekcji.
7. Oblicz wydajność transfekcji na podstawie procentu komórek dodatnich Dy547 we wszystkich obrazowanych komórkach.

8. Protokół 7: Hodowla NCM do transdukcji wektora lentiwirusowego

1. Powtórz kroki od 7.1 do 7.4 protokołu 6.
2. Oblicz ilości cząstek wirusa, które mają być użyte do transdukcji: Użyj następującego wzoru: TU = (MOI x CN) / VT, podczas gdy TU oznacza całkowitą liczbę jednostek transformujących, MOI równa się pożądanej wielokrotności infekcji w studzience (MOI lub TU / komórka), CN określa liczbę komórek w każdym dołku, a VT wskazuje podstawowe miana wirusa (TU / ml). Na przykład, biorąc pod uwagę, że podstawowe miana wirusa dla wektora SMART-shRNA wynoszą 1 x 10⁹ TU/ml (jednostek transformujących na ml), 7,5 x 10⁵ komórek na studzienkę w czasie transdukcji i oczekiwany MOI wynoszący 20: użyj 15 μl podstawowych cząstek wirusa dla każdej studzienki (uwaga: ten warunek jest zalecany dla przejściowej indukcji lentiwirusa).
3. Podgrzej 300 μl pożywki mTeSR1 z 10 mg/ml polibrenu przez 30 minut.
4. Dodać 15 μl podstawowych cząstek wirusa do wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 zawierającej polibren i delikatnie wymieszać roztwór.
5. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki zawierającej cząsteczki wirusa.
6. Po 4 godzinach inkubacji zbadaj fluorescencję turboGFP (twórcę ekspresji shRNA), aby określić wydajność transdukcji.
7. Dodać 300 μl dodatkowej pożywki mTeSR1 do dołka transdukcyjnego, gdy komórki zaczną wyrażać turboGFP.
8. Po 12-16 godzinach inkubacji ponownie zbadaj ekspresję turbo-GFP.
9. Wykonaj pożądane eksperymenty kontrolne z tymi transdukowanymi komórkami w ciągu 72 godzin.

Ogólny schemat kultury NCM

Rysunek 1 przedstawia typowy schemat hodowli NCM pokazujący dynamiczne zmiany hPSC po posiewie pojedynczych komórek o dużej gęstości w obecności inhibitora ROCK Y-27632. Te zmiany morfologiczne obejmują połączenia międzykomórkowe po posiewaniu, tworzenie klastrów komórkowych i wykładniczy wzrost komórek, po którym następuje kondensacja komórek (ryc. 1A). Reprezentatywne doświadczenie wskazuje na hESC WA01 (H1), posiane jako pojedyncze komórki o gęstości 1,9 x 105 komórek/cm2 w obecności 10 μM Y-27632 w dniu 1 (Figura 1B, lewy panel), dalej rozmnażane bez tworzenia kolonii (Figura 1B, panel środkowy) w dniu 2 i skondensowane jako jednorodna monowarstwa, która jest odpowiednia do pożądanych eksperymentów lub do pasażowania komórek w dniu 3 (Figura 1B, prawy panel).

Różne inhibitory ROCK wspierają hodowlę NCM

Test na płytce 96-dołkowej został użyty do sprawdzenia słuszności koncepcji wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Został również zaprojektowany w celu optymalizacji wykorzystania różnych inhibitorów ROCK do wspomagania hodowli NCM. Około 31 000 zdysocjowanych komórek SCU-i10, ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych (hiPSC)17, posiano na jednym dołku pokrytym Matrigelem w obecności różnych stężeń inhibitorów ROCK. Po 24 godzinach komórki poddano testowi przeżycia opartemu na CCK-8 w celu określenia przeżycia komórek w tych warunkach. Wcześniej wykazaliśmy, że metoda NCM wymaga użycia inhibitora ROCK, Y-27632, przy 10 μM w celu poprawy posiewu pojedynczych komórek. W tym raporcie potwierdziliśmy, że 10 μM Y-27632 znacznie zwiększa 24-godzinną wydajność powlekania pojedynczych komórek hiPSC (P < 0,05) (Figura 2). Odkryliśmy również, że Y-39983 (inhibitor ROCK I), fenylobenzodioksan (inhibitor ROCK II) i tiazowiwina (nowy inhibitor ROCK) znacznie modulują wydajność posiewu pojedynczych komórek i promują wzrost NCM przy 1 μM w porównaniu z ich kontrolami (P < 0,05) (Figura 2). Co więcej, wpływ trzech inhibitorów ROCK (przy 1 μM) na wydajność posiewu pojedynczych komórek był porównywalny z Y-27632 przy 10 μM (P > 0,05) (Figura 2). Warto zauważyć, że inhibitor ROCK I (w stężeniu 5 μM) wydaje się wykazywać wyraźną cytotoksyczność w porównaniu z lekiem w stężeniu 1 μM (P < 0,05), co sugeruje bardziej specyficzną interakcję niż inne cząsteczki. W związku z tym różne inhibitory ROCK mogą być w przyszłości stosowane do wspierania hodowli NCM. Jednak do przyszłego zastosowania wymagana byłaby pełna charakterystyka zarówno hESC, jak i hiPSC w NCM z tymi nowymi inhibitorami.

LN-521 obsługuje hodowlę NCM bez użycia inhibitorów ROCK

Aby określić rolę konkretnej izoformy lamininy we wspieraniu wzrostu hESC, przeprowadziliśmy hodowlę hiPSC SCU-i30 na płytkach pokrytych LN-521 w wolnym od kseno-ksenoterapii podłożu TeSR2. Co ciekawe, sam LN-521, bez obecności inhibitorów ROCK, wspiera posiewanie pojedynczych komórek i późniejszy wzrost NCM przez 15 pasaży w tym stanie (Figura 3). Barwienie immunologiczne komórek SCU-i30 przeciwciałem poliklonalnym anty-NANOG wykazało, że komórki w tym stanie miały wysoką ekspresję NANOG w jądrach (Figura 3A). Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że profil ekspresji markera hESC był podobny do komórek wyhodowanych jako NCM przy użyciu inhibitora ROCK Y-27632 (Figura 3B).

Wysoka skuteczność dostarczania mikroRNA bez użycia cząsteczek lentiwirusowych

Transfekcja z mikroRNA oligonukleotydów znakowanych Dy547 została przeprowadzona w komórkach WA01 (H1) w warunkach NCM. ESC WA01 hodowano jako NCM na 2,5% Matrigel w mTeSR1 odpowiednio dla 2 (Figura 4A) i 18 (Figura 4B) pasaży. Komórki te wykazały wysoką skuteczność transfekcji 24 godziny po transfekcji (ryc. 4A i 4B). Ogólnie rzecz biorąc, możemy uzyskać skuteczność transfekcji do 91% w hESC po 24 godzinach od transfekcji.

Rysunek 1. (A) Schemat kultury NCM. Wykres liniowy przedstawia dynamiczne zmiany asocjacji wielokomórkowej w typowej 3-dniowej hodowli w warunkach NCM. (B) Reprezentatywne obrazy fazowe hESC WA01 (H1) propagowanych w warunkach NCM na 2,5% Matrigel w pożywce mTeSR1 przez 16 pasaży (oznaczone jako WA01, mcp16). Dolny panel to powiększony widok górnego panelu. Podziałka skali wskazuje 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Testy przeżycia pojedynczej komórki przy użyciu formatu 96-dołkowego. Około 31 000 SCU-i10hiPSCs 17 posiano na 2,5% Matrigel w obecności różnych małocząsteczkowych inhibitorów związanych ze szlakami kinazy związanej z Rho (ROCK) we wskazanych stężeniach. Po 24 godzinach komórki poddano testowi przeżycia CCK-8 poprzez pomiar absorbancji przy 450 nm (A450). Test t studenta został wykorzystany do określenia, czy różnice w skuteczności posiewu pojedynczych komórek między różnymi inhibitorami ROCK mają znaczenie statystyczne. Znak gwiazdki w liczbie pojedynczej (*) oznacza brak istotnych różnic między inhibitorami (P > 0,05), natomiast znak podwójnej gwiazdki (**) oznacza, że obserwowana różnica ma znaczenie statystyczne (P < 0,05). Kolumny na histogramach oznaczają średnie wartości wyznaczników poczwórnych, a słupki reprezentują odchylenia standardowe.

Rysunek 3. Posiew NCM hiPSC na lamininie-521 (LN-521) bez obecności inhibitorów ROCK. Linia SCU-i30 hiPSC została utworzona w NIH Stem Cell Unit. Komórki SCU-i30 hodowano na 6-dołkowych płytkach pokrytych LN-521 w pożywce TeSR2 wolnej od kseno-kseny przez 15 pasaży bez użycia inhibitorów drobnocząsteczkowych, takich jak inhibitory ROCK. (A) Barwienie immunologiczne komórek SCU-i30 przeciwciałem poliklonalnym anty-NANOG i barwienie przeciwstawne Hoechst 33342 (Hoechst). Warto zauważyć, że niektóre komórki, które mają ujemne zabarwienie NANOG, to komórki w mitozie. (B) Analiza cytometryczna przepływowa ekspresji markera hPSC w komórkach SCU-i30 wyhodowanych jako NCM na 2,5% Matrigel z użyciem 10 μM Y-27632 (górny panel) lub NCM na LN-521 bez Y-27632 (dolny panel). Procedury zarówno barwienia immunologicznego, jak i analizy cytometrii przepływowej zostały opisane wcześniej5. Podziałka skali przedstawia 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Hodowla NCM hPSC do transfekcji mikroRNA. ESC WA01 hodowano jako NCM na 2,5% Matrigel w mTeSR1 odpowiednio dla 2 (A) i 18 (B) pasaży. Reprezentatywne obrazy fazowe i fluorescencyjne komórek WA01 transfekowanych kontrolnymi mikroRNA znakowanymi Dy547 w celu monitorowania wydajności transfekcji po 24 godzinach od transfekcji. Podziałka skali reprezentuje 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.