Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Tradycyjnie, ekspresja wirusa jest badana za pomocą technik biologii molekularnej (np. northern blotting, western blotting, hybrydyzacja mikromacierzy, itp.) ¹. Chociaż metody te są w stanie dostarczyć szczegółowych informacji w odniesieniu do kategoryzacji zmian ekspresji poszczególnych mRNA lub białek, zazwyczaj nie są one podatne na procesy w czasie rzeczywistym i wysokoprzepustowe. Alternatywne podejścia wykorzystujące reportery oparte na fluorescencji były stosowane wcześniej podczas pracy z pokswirusami; Jednak ich rozwój i wykorzystanie było motywowane różnymi celami. Opracowano kilka takich metod selekcji rekombinowanych wirusów ^2,3. Techniki te wyrażają EGFP po prawidłowym włączeniu i ekspresji egzogennego DNA z rekombinowanych klonów krowianki. Podobnie, kilka szczepów krowianki wykazujących stabilną ekspresję rozpuszczalnych białek znakowanych EGFP lub GFP ulega ekspresji pod natywnym promotorem krowianki. Są one zwykle używane do ilościowego określania wnikania i replikacji wirusa podczas testów neutralizacji opartych na przeciwciałach, hamowania chemicznego lub porównywania skuteczności przeciwwirusowej ^4-6. Chociaż wirusy te okazały się przydatne, ich zdolność do dostarczania szczegółowych informacji o punkcie zahamowania jest ograniczona ze względu na użycie jednego niejednoznacznego wczesnego/późnego promotora wirusa. Poprzednie metody wykorzystywały również białko EGFP o nieoptymalnej charakterystyce sygnału do szumu.

Ze względu na złożoność replikacji poxwirusa i brak istniejących narzędzi do testowania zmian w ekspresji genów wirusa w czasie rzeczywistym, opracowaliśmy zestaw jedno- i wieloetapowych wirusów reporterowych ^7,8. Jak opisano w poprzednich publikacjach, wirusy te wyrażają jedno, dwa lub trzy spektralnie odrębne białka fluorescencyjne z natywnych promotorów krowianki we wczesnych, pośrednich lub późnych stadiach infekcji. Wirusy te mogą być wykorzystywane jako wskaźniki postępu replikacji wirusa za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i równie dobrze nadają się do wysokoprzepustowych testów opartych na płytkach i czytnikach. Wirusy te są łatwe w użyciu zamiast wirusa typu dzikiego, rosną z podobną kinetyką, aby osiągnąć równoważne miana ⁷. Podczas planowania i tworzenia tych wirusów zwrócono dużą uwagę na wybór fluoroforów, które mają wysoką charakterystykę sygnału do tła z doskonałą wydajnością fałdowania, aby ułatwić wiarygodną kwantyfikację z szybkim sprzężeniem zwrotnym na zmiany w ekspresji (Venus, mCherry i TagBFP). Ponadto wybrano kombinacje promotorów wirusa, które dają wysoką wierność, jednoznaczną ekspresję specyficzną dla etapu, dostarczając informacji o pełnym zakresie ekspresji genów wczesnych (promotor C11R), pośrednich (promotor G8R) i późnych (promotor F17R), w przeciwieństwie do niejednoznacznych promotorów wczesnych/późnych.

Te wirusy mogą być używane jako narzędzie do badania cyklu życia prototypowego wirusa ospy, wirusa krowianki. Nadal wiele nie wiadomo na temat interakcji gospodarz-wirus, pomimo długiej historii badań. Krowianka jest złożona, wytwarza ponad 200 unikalnych białek, z których wiele jest immunomodulujących i antagonistycznych wobec gospodarza. Po zakażeniu wirus krowianki natychmiast rozpoczyna wczesną transkrypcję mRNA. Jest to ułatwione przez polimerazę RNA i czynniki transkrypcyjne, które zostały załadowane do genomu wirusa podczas pakowania wirionu i utrzymywane w stanie wstrzymania do czasu kolejnej infekcji. Ta wczesna ekspresja wytwarza głównie białka wymagane do supresji układu odpornościowego gospodarza (deapping mRNA, sekwestracja dsRNA i białka receptora wabika, a także inhibitory apoptozy, odpowiedzi na stres oraz sygnalizacji Toll, IL i NF-κB) oraz replikacji genomu. Wczesna ekspresja wytwarza również czynniki transkrypcyjne niezbędne do ekspresji pośredniej. Ekspresja pośrednia obejmuje ekspresję czynników transkrypcyjnych w późnym stadium. Ta kaskada ekspresji prowadzi do produkcji strukturalnych i enzymatycznych białek wirusa w późnych stadiach infekcji, które są niezbędne do pełnego złożenia dojrzałego wirionu krowianki.

Nasz zestaw fluorescencyjnych wirusów reporterowych pozwala na szybki postęp w zrozumieniu biologii pokswirusa. Jedną z najczęstszych i najbardziej czasochłonnych metod w dziedzinie wirusologii jest próba wzrostu. Zazwyczaj obejmuje to infekowanie komórek, przeprowadzanie serii zabiegów, zbieranie wirusa poprzez lizę zakażonych komórek i ilościowe określanie wynikowego miana wirusa za pomocą testu płytki nazębnej. Wykorzystanie opisanych tutaj wirusów reporterowych pozwala na pomiar wzrostu wirusa w czasie rzeczywistym, który można łatwo ocenić i porównać między wieloma zabiegami wykonywanymi równolegle. Przewidujemy, że ten zestaw odczynników będzie używany w różnych protokołach do identyfikacji zmian w ekspresji genów wirusa w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, knockdown RNAi lub ograniczenie zakresu gospodarza.

Ta metoda umożliwia również analizę o wysokiej zawartości na większą skalę niż poprzednio dostępne, co pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków przeciwwirusowych dla konkretnie zdefiniowanych etapów docelowych będących przedmiotem zainteresowania. Chociaż zidentyfikowano wiele potencjalnych metod leczenia zakażenia pokswirusem, jedynymi zatwierdzonymi przez FDA terapiami skutecznymi w leczeniu zakażenia pokswirusem są alizatyczny nukleozyd fosfonianu, cydofowir i leczenie immunoglobuliną krowianki ^9,10. Pomimo zwalczenia ospy prawdziwej w 1977 r. ¹¹ wirusy ospy nadal stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego ¹² . Zaprzestanie powszechnych szczepień przeciwko wirusowi ospy wietrznej doprowadziło do zwiększenia podatności na inne pokswirusy ¹³. Na przykład regiony Afryki Środkowej, które wcześniej były chronione przez szczepienia, doświadczają gwałtownego wzrostu zakażeń wirusem małpiej ospy ¹⁴. Poważne obawy wzbudziła również utajona podatność na celowe uwolnienie wirusa ospy wietrznej. Ze względu na ograniczoną liczbę dostępnych obecnie terapii istnieje pilna potrzeba opracowania nowatorskich metod leczenia. Te wirusy reporterowe umożliwiają szybkie i wysokoprzepustowe badania przesiewowe inhibitorów małych cząsteczek w celu zahamowania określonego etapu replikacji wirusa. Identyfikacja inhibitorów, które są ukierunkowane na etapy ekspresji wirusa, które obecnie nie są celem hamowania, ułatwi opracowanie terapii skojarzonych o zwiększonej sile.

Wiele można dowiedzieć się o biologii komórek krowianki, obserwując zmiany w ekspresji genów na każdym etapie. Osłabienie zakażonej komórki gospodarza przez manipulację chemiczną lub genetyczną jest zwykle wyrażane w postaci obniżonych mian wirusa. Jednak porównując zmiany na każdym etapie kaskady ekspresji wirusa, można uzyskać pełniejsze zrozumienie, w jaki sposób określone leczenie wpływa na zdolność wirusa. Wykazano, że dane te dobrze korelują z tradycyjnym wynikiem miana wirusa, ale dostarczają bardziej szczegółowych informacji mechanistycznych, a także zapewniają wysoką przepustowość ⁷.

1. Komórki płytkowe

1. Oddzielić komórki HeLa od płytki i rozcieńczyć w pożywce wzrostowej (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) do około 2,0 x 10⁵ komórek/ml. Dozować 100 μl / studzienkę na czarnościenną, przezroczystą 96-dołkową płytkę z płaskim dnem (20 000 komórek / dołek).
2. Inkubować komórki przez 24 godziny aż do zlewania się w inkubatorze o temperaturze 37 °C + 5% CO_{2 .}

2. Zainfekuj komórki

1. Rozcieńczyć wirusa i zainfekować komórki.
   1. Rozmrażanie TrpV (potrójny wirus; Wczesny wirus fluorescencyjny Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) i PLV (Wenus bez promotora) i dezagregować za pomocą sonikacji przez 5 minut. Alternatywnie, surowe zapasy wirusów można zmieszać w stosunku 1:1 z 0,25 mg/ml trypsyny w pożywce infekcyjnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   2. Rozcieńczyć surowe zapasy wirusa w pożywce infekcyjnej o temperaturze 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). W przypadku zakażeń o wysokim MOI (10 PFU/komórkę) rozcieńczyć zapas wirusa do 1,0 x 10⁷ PFU/ml, zakładając 5 x 10⁴ komórek/basenik i objętość inokulum 50 μl. Zaplanuj zakażenie 3 dołków replikowanych dla każdego leczenia TrpV i kolejnych 3 studzienek replikowanych dla tego samego leczenia PLV, aby uwzględnić fluorescencję tła specyficzną dla każdego zabiegu.
   3. Infekować studzienki, dodając 50 μl/dobrze rozcieńczonego wirusa do pożywki infekcyjnej. Definiuje się to jako czas = 0 godzin po zakażeniu (0 hpi).
2. Rozcieńczyć pożądane związki lecznicze w pożywce infekcyjnej. W przypadku wszystkich zabiegów należy wykonać pojedyncze 2-krotne rozcieńczenie mieszanki głównej i zastosować je w celu powtórzenia studzienek (np. 350 μl całkowitej objętości dla sześciu 96-dołków po 50 μl każdy).
   1. Rozcieńczyć eksperymentalne związki w pożywce infekcyjnej.
   2. Rozcieńczyć rozpuszczalnik kontrolujący nośnik (np. PBS, DMSO) w pożywce infekcyjnej. Uwaga: Należy stosować podobne stężenia końcowe rozpuszczalników do kontroli nośnika, jak w przypadku związków doświadczalnych (np. jeśli zapas IBT jest wykonany z DMSO i stosowany w końcowych stężeniach 1 μl/ml, wówczas należy użyć samego DMSO w stężeniu 1 μl/ml jako kontroli nośnika).
   3. Rozcieńczyć związki kontrolne w pożywce infekcyjnej. Zalecane związki kontrolne to: 3,6 μM (1 μg/ml) 1-β-D-Arabinofuranozylocytozyna (AraC), 50 μM (11,7 μg/ml) β izosemikarbazon (IBT), 60 μM (50 μg/ml) ryfampicyna lub 5 μM (1,9 μg/ml) ST-246 ^8,15,16. Zobacz Reprezentatywne wyniki, aby uzyskać oczekiwane efekty. Uwaga: należy przeprowadzić to rozcieńczenie przy dwukrotnym (2x) pożądanym stężeniu końcowym, ponieważ dodaje się je w stosunku 1:1 do objętości już znajdującej się w studzience.
3. Natychmiast po dodaniu wirusa dodać 50 μl pożywki infekcyjnej zawierającej pożądane zabiegi i kontrole, zgodnie z rozcieńczeniem w kroku 2.2. Uwaga: W celu oznaczenia zahamowania przed wczesnym etapem ekspresji, związek(-i) może być dodany bezpośrednio do inokulum rozcieńczonego wirusa (etap 2.1.2) lub do komórek gospodarza przed zakażeniem (przed etapem 2.1.3).
4. Inkubować 6-24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C + 5% CO_{2 .}

3. Napraw komórki

1. Napraw komórki, dodając 100 μl 8% paraformaldehydu do pożywki infekcyjnej już w każdym dołku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, chroniąc przed światłem. Uwaga: Zaleca się dodawanie 2x PFA (8%) bezpośrednio do pożywki infekcyjnej, aby zapobiec aerozolizacji zakaźnej krowianki, która może wystąpić, jeśli pożywka o wysokim mianie zostanie odwrócona bezpośrednio do naczynia na odpady przed utrwaleniem.
2. Usunąć utrwalacz, obracając płytkę do naczynia na odpady.
3. Dodać 100 μl PBS o temperaturze pokojowej.
4. Płyta uszczelniająca z optycznie przezroczystą folią samoprzylepną. Uwaga: Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast odczytane. Pamiętaj, aby przed odczytem przywrócić uszczelnione płytki do temperatury pokojowej, aby zapobiec zniekształceniu pomiarów spektrofotometru przez kondensację.

4. Określ ilościowo wzrost wirusa

1. Zmierz fluorescencję punktu końcowego na 515:530 dla Wenus, 587:610 dla mCherry i 415:457 dla TagBFP (wzbudzenie: długość fali emisji w nm). Cztery pomiary powinny być uśrednione na dołek przy użyciu zoptymalizowanych ustawień wzmocnienia dla każdego kanału. Uwaga: Odpowiednia długość fali emisji może się różnić w zależności od konkretnego modelu i charakterystyki filtra czytnika płytek. Można to określić empirycznie, wykonując skanowanie długości fali emisji w celu określenia punktu, w którym występuje największa różnica między TrpV i PLV dla każdego kanału.
2. Znormalizuj nieprzetworzone dane, aby ułatwić porównywanie eksperymentów.
   1. Dla każdego kanału należy określić średnią z duplikatów studzienek TrpV i PLV.
   2. Odejmij średnie pomiary tła zakażonego PLV od średnich pomiarów eksperymentalnych zakażonych TrpV dla każdego leczenia.
   3. Znormalizuj dane, dzieląc każdą odjętą wartość tła przez wartość tylko dla pojazdu.
   4. Po wielokrotnym powtórzeniu eksperymentu można przeprowadzić jednoczynnikową analizę wariancji (jednoczynnikowy test ANOVA) i wielokrotne porównanie po teście w celu określenia, czy którykolwiek z zabiegów odzwierciedla statystycznie istotną różnicę w stosunku do leczenia samym nośnikiem dla każdego kanału.

5. Alternatywny protokół: Kinetyczne testy płytkowe

1. Wykonaj wszystkie kroki, dodając zabiegi (krok 2.3).
2. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i umieścić w komorze czytnika płytek w temperaturze zrównoważonej do 37 °C. Uwaga: Należy zachować szczególną ostrożność, aby utrzymać płytki w stałej temperaturze 37 °C, aby zapobiec nadmiernemu naprężeniu komórek i kondensacji. W przypadku testów kinetycznych szczególnie ważne jest stosowanie pożywki buforowej (wodorowęglan sodu i HEPES) w celu utrzymania odpowiedniego pH bez dodatku 5% CO₂ .
3. Ustaw wzmocnienie czytnika płyt ręcznie, aby zapobiec nasyceniu późniejszych punktów czasowych. Uwaga: Dokładna optymalizacja wzmocnienia może być uzyskana, wykonując testy punktu końcowego w podobnych warunkach.
4. Uzyskaj odczyty godzinowe dla 8-24 hpi i znormalizuj przy użyciu podobnej procedury, jak w teście punktu końcowego (krok 4.2).
5. Poszczególne punkty czasowe mogą być analizowane pod kątem istotności statystycznej przy użyciu podobnych metod, jak poprzednio opisany test końcowy
.

Jako przykład typowego użycia tych wirusów, potrójny wirus reporterowy fluorescencji został użyty do porównania punktu zahamowania kilku dobrze zdefiniowanych inhibitorów poxwirusa.

Komórki HeLa zostały posiane w kulturze tkankowej, poddane działaniu czarnych ścianek, przezroczystych, płaskodennych 96-dołkowych płytek i inkubowane przez noc. Zlewające się monowarstwy zostały zakażone przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 przy użyciu potrójnego wirusa reporterowego (TrpV; Tabela 1) lub Wenus bez promotora (PLV), jak uszczegółowiono na mapie płyty (ryc. 1). Pożywki infekcyjne zawierające zabiegi dodano w celu uzyskania końcowego stężenia 0,1% DMSO, 3,6 μM (1 μg/ml) AraC, 50 μM (11,7 μg/ml) IBT, 5 μM (1,9 μg/ml) ST-246 lub 60 μM (50 μg/ml) ryfampicyny w trzech powtórzeniach. Jako kontrolę nośnika zastosowano 0,1% DMSO, ponieważ wszystkie zapasy inhibitorów stosowano w stężeniu 1 μl/ml w DMSO. Płytkę ponownie umieszczono w inkubatorze o temperaturze 37 °C do temperatury 18 hpi. Komórki utrwalano przez 15 minut przez dodanie 100 μl 8% PFA do wszystkich studzienek i przechowywano w PBS chronionym przed światłem do czasu odczytania na płytce. Odczyty fluorescencji przeprowadzono przy użyciu czytnika płytek Tecan Infinite M1000 i oprogramowania i-control (v1.5.14.0) poprzez odczyt od dołu 4 punktów na studnię przy długościach fal wzbudzenia: emisji 515:530, 587:610, 415:457nm odpowiednio dla fluoroforów Venus, mCherry i TagBFP. Przed końcowymi pomiarami wzmocnienie zostało zoptymalizowane, aby umożliwić maksymalny sygnał bez nasycenia czujników (wzmocnienie wynosiło zwykle 235, 255, 235 odpowiednio dla pomiarów zielonych, czerwonych i niebieskich).

Rycina 1. Reprezentatywny układ zakażeń i leczenia farmakologicznego na płytce 96-dołkowej. Schemat infekcji płytki 96-dołkowej i schematu dodawania małych cząsteczek wykorzystany do uzyskania reprezentatywnych wyników. Wirus potrójnej fluorescencji (TrpV; jaśniejszy szary) wyrażający wczesną Wenus, pośrednią mCherry i późną TagBFP lub Wenus bez promotora (PLV; ciemniejszy szary) są używane w potrójnych kolumnach. Po prawej stronie wskazano 1-β-D-Arabinofuranozylocytozynę (AraC), isatynę β-tiosemikarbazon (IBT), ryfampicynę, ST-246 i kontrolę nośnika DMSO o badanym stężeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

Względne jednostki fluorescencji (RFU) dla każdej repliki zostały znormalizowane dla każdego kanału. Po pierwsze, średnia intensywność fluorescencji dla studzienek PLV została odjęta od średniej intensywności studzienek TrpV dla każdego zabiegu, aby uwzględnić intensywność tła wnoszoną przez każdy lek. Następnie wartość ta została podzielona przez odjętą przez tło odjętą średnią intensywność odwiertów TrpV traktowanych DMSO (wzrost typu dzikiego). Wyniki uzyskane po leczeniu znanymi inhibitorami pokswirusa były zgodne z wcześniej opublikowanymi odkryciami i ich zrozumiałym mechanizmem działania. Wykazano, że zaprzestanie wczesnej transkrypcji genów i przejście do pośredniej ekspresji genów wymaga replikacji DNA 17. Zgodnie z tym, AraC, inhibitor replikacji DNA, wykazał dramatyczny wzrost wczesnej ekspresji genów (210% wczesnej ekspresji leczonej DMSO; Rysunek 2) oraz całkowity brak ekspresji pośredniej i późnej (odpowiednio 0,4% i 0,3% ekspresji pośredniej i późnej leczonej DMSO; Rysunek 2). Chociaż dokładny mechanizm działania nie jest zdefiniowany dla IBT, uważa się, że sprzyja on transkrypcji odczytu, co skutkuje zwiększonymi ilościami dsRNA, aktywacją szlaku RNazy L i apoptozą 18-20. W odpowiedzi na leczenie IBT zaobserwowano postępujący ciężki fenotyp, w którym ekspresja pośrednia i późna była znacznie mniejsza niż w przypadku samego DMSO (24,7% i 2,9% DMSO leczonych odpowiednio z powodu ekspresji pośredniej i późnej; Rysunek 2). Zaobserwowano również konsekwentny, ale nie istotny statystycznie spadek wczesnej fluorescencji; jednak jest to prawdopodobnie spowodowane apoptozą wywołaną przez IBT w tym późniejszym punkcie czasowym (74,0% DMSO przy 18 hpi). W przeciwieństwie do AraC i IBT, leki na ospę ST-246 i ryfampicyna hamują po późnej ekspresji genów podczas składania i dojrzewania wirionu 15,16. Nie zaobserwowano żadnych zmian w ekspresji genów na wszystkich etapach, gdy komórki były traktowane ST-246 (100,9%, 98,5% i 94,5% odpowiednio wczesnej, pośredniej i późnej ekspresji DMSO; Rysunek 2) lub ryfampicyna (107,6%, 104,2% i 106,5% odpowiednio wczesnej, pośredniej i późnej ekspresji leczonej DMSO).

Rycina 2. Etap zahamowania wynikający z leków przeciwwirusowych przeciwko ospie. Komórki HeLa zostały zakażone i potraktowane zgodnie z opisem w sekcji z reprezentatywnymi wynikami. A) Wykres przedstawiający względne jednostki fluorescencji (RFU; tło odjęte dla każdego kanału na podstawie wzrostu PLV dla każdego leczenia i znormalizowane do TrpV+DMSO) dla wczesnej (zielonej), pośredniej (czerwonej) i późnej (niebieskiej) ekspresji wirusa. Komórki hodowano w obecności wskazanych związków dla 0-18 hpi. Średnia z odchyleniem standardowym jest pokazana dla czterech kontrprób biologicznych, z których każda jest wykonywana w trzech powtórzeniach. Testy t dla jednej próby przeprowadzono dla każdej pary kanałów leczenia i DMSO, a statystycznie istotne różnice oznaczono gwiazdkami (*p < 0,05, ***p < 0,0005). B) Obrazy każdego zabiegu studni w temperaturze 18 hpi. Wszystkie obrazy zostały wykonane obiektywem 10X w mikroskopie epifluorescencyjnym Zeiss 200M, a ekspozycje skalowały się podobnie. Podziałka liniowa = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Historycznie, kombinacja testów wzrostu o niskim MOI (0,01-0,1 PFU/komórkę) i wysokiej MOI (5-10 PFU/komórkę) jest stosowana podczas badania hamującego działania nowej małej cząsteczki lub mutanta wirusa. Przy niskim MOI ogólne efekty hamujące są często wyolbrzymiane nawet przez niewielkie hamowanie, ponieważ początkowo infekowana jest tylko podgrupa komórek. Próbując określić punkt w cyklu infekcji, w którym wirus jest hamowany, infekcja o wysokim MOI jest prawdopodobnie bardziej odpowiednia, ponieważ wszystkie komórki są zainfekowane przez twoje pierwotne inokulum. Eksperyment pokazany na rysunku 3 przeprowadzono jak na rysunku 2 z dodaniem zestawu studzienek, które zostały zainfekowane przy niższym MOI = 1. Jako inhibitor, który działa po transkrypcji, ST-246 nie powinien wpływać na żaden etap ekspresji genów; jednak jasne jest, że gdy zakażony jest tylko podzbiór komórek (ryc. 3, MOI = 1), występuje wyraźne zahamowanie wszystkich etapów ekspresji (38,4%, 48,9% i 52,9% DMSO w porównaniu do 100,9%, 98,5% i 94,5% dla MOI = 1 vs. MOI = 10 poziom infekcji odpowiednio wczesnej, pośredniej i późnej; Rysunek 3). Zakładając 100% zahamowanie tworzenia dojrzałego wirionu przez ST-246, oznacza to, że 100% komórek zostało zainfekowanych przez MOI = 10 infekcji, a gdzieś od 50 do 70% komórek było produktywnie zakażonych podczas infekcji MOI = 1.

Rycina 3. Wpływ poziomu infekcji na pozorne zahamowanie ST-246. Komórki HeLa zakażone jak na rysunku 2 zarówno wysokim (MOI=10), jak i niskim (MOI=1) TrpV traktowanym ST-246. Względne jednostki fluorescencji (RFU; tło odjęte od każdego kanału na podstawie wzrostu PLV dla każdego leczenia i znormalizowane do TrpV+DMSO) dla wczesnej (zielonej), pośredniej (czerwonej) i późnej (niebieskiej) ekspresji wirusa w komórkach zakażonych przy MOI=1 lub MOI=10 i potraktowanych 20 μM ST-246. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Tabela 1. Lista szczepów reporterskich wirusa krowianki. Tabela opisująca fluorescencyjne wirusy reporterowe.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie ma żadnych patentów na wirusy ani metody badań przesiewowych.