Artykuł metodologiczny

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

DOI:

10.3791/51526

⸱

12 stycznia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji. Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organogeneza to nauka o tym, jak narządy są określane, a następnie nabywają swój specyficzny kształt i funkcje podczas rozwoju. Zarodek Xenopuslaevis jest bardzo przydatny do badania organogenezy, ponieważ jego duży rozmiar sprawia, że doskonale nadaje się do identyfikacji narządów na najwcześniejszych etapach organogenezy. W tej chwili podstawową metodą stosowaną do identyfikacji określonego narządu lub zawiązka jest hybrydyzacja in situ z całymi sondami RNA antysensownymi specyficznymi dla genu, który ulega ekspresji w narządzie będącym przedmiotem zainteresowania. Ponadto stosunkowo łatwo jest manipulować genami lub szlakami sygnałowymi w Xenopus, a hybrydyzacja in situ pozwala następnie na zbadanie zmian w obecności lub morfologii narządu docelowego. Hybrydyzacja całego montażu in situ to wielodniowy protokół składający się z wielu etapów. Tutaj zapewniamy uproszczony protokół ze zmniejszoną liczbą kroków i użytych odczynników, który dobrze sprawdza się w rutynowych testach. Roboty hybrydyzacyjne in situ znacznie ułatwiły ten proces, a my szczegółowo opisujemy, jak i kiedy wykorzystujemy tę technologię w tym procesie. Po zakończeniu hybrydyzacji in situ uchwycenie najlepszego obrazu wyniku może być frustrujące. Doradzamy, jak zoptymalizować obrazowanie wyników hybrydyzacji in situ. Chociaż protokół opisuje ocenę organogenezy u Xenopus laevis, ten sam podstawowy protokół prawie na pewno można dostosować do Xenopus tropicalis i innych systemów modelowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzorzec ekspresji określonego genu jest ważną informacją w określaniu potencjalnej roli tego genu w rozwoju określonego narządu lub typu komórki. Mówiąc najprościej, jeśli nie zostanie wyrażona we właściwym czasie i miejscu, jest mało prawdopodobne, aby odegrała kluczową rolę. W Xenopus, podobnie jak w większości wczesnych zarodków, najczęściej stosowanym testem do wykrywania ekspresji genu jest hybrydyzacja in situ z całego wierzchowca przy użyciu znakowanych antysensownych sond RNA. Stosowanie barwienia przeciwciałami do oceny ekspresji genu w Xenopus staje się coraz bardziej powszechne, ponieważ naukowcy odkrywają przeciwciała, zwykle wywoływane przeciwko białkom ssaków, które reagują krzyżowo na homolog Xenopus lub generują własne 1-3. Jednak zdecydowana większość badań nad organogenezą Xenopus nadal wykorzystuje antysensowne sondy RNA. W przypadku stosowania przeciwciał każde pojedyncze przeciwciało często wymaga optymalizacji pod kątem pierwotnego stężenia przeciwciał lub protokołów wiązania. W przeciwieństwie do tego, protokół hybrydyzacji in situ jest zasadniczo niezmienny dla różnych sond. Podstawowa koncepcja jest stosunkowo prosta, a doskonały standardowy protokół został dobrze ugruntowany 4. Nasz protokół jest uproszczoną wersją oryginalnego protokołu 4, który nadal zapewnia doskonałe wykrywanie wzorców ekspresji genów we wczesnym zarodku. Zarodki są utrwalane, a następnie przygotowywane do hybrydyzacji poprzez zmianę roztworów i temperatur tak, aby pozwoliło to na wysokie rygorystyczne wiązanie znakowanej antysensownej sondy RNA z docelowym mRNA. Niezwiązana sonda jest wypłukiwana, a następnie zarodki są przygotowywane do wiązania przeciwciała przeciwko etykiecie na sondach RNA. Nadmiar przeciwciał jest następnie wypłukiwany, a enzymatyczna reakcja barwna jest stosowana do zlokalizowania miejsca, w którym sonda RNA jest związana w zarodku. Obecnie istnieje wiele linii transgenicznych Xenopus, które napędzają ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych tkankach i są one dostępne w centrach magazynowych Xenopus, takich jak National Xenopus Resource w Woods Hole. Chociaż jest to bardzo przydatne w wielu eksperymentach, które wymagają zbadania organogenezy w żywych embrionach, opcja ta wymaga oddzielnego pomieszczenia dla linii transgenicznych.

Hybrydyzacja in situ może wyraźnie określić, gdzie uformują się określone narządy lub typy komórek we wczesnym zarodku (Rysunek 1). Technika ta jest niezwykle czuła, biorąc pod uwagę, że można wykryć ekspresję genów w niewielkiej liczbie komórek w jednym zarodku 5. Jednak hybrydyzacja in situ z wykorzystaniem intensywności barwienia kolorymetrycznego nie jest uważana za kwantyfikalną, ponieważ reakcja koloru nie jest liniowa. Pomimo trudności w ilościowym określeniu intensywności barwienia, zmiany w ekspresji są często dość zauważalne; Zwłaszcza, gdy hybrydyzacja in situ wykazuje wymierne wzrosty lub spadki wielkości domen ekspresji 6,7.

Wyraźne zalety hybrydyzacji in situ z całym wierzchowcem sprawiają, że jest to kluczowy test w badaniach nad wczesnym rozwojem. Jest to jednak proces czasochłonny, który wymaga wielu kroków w ciągu kilku dni. Protokół ten jest uproszczoną wersją standardowego protokołu, która eliminuje kilka kroków bez obniżania jakości wyniku in situ. Uproszczenie eliminuje również źródła zmienności, ułatwiając rozwiązywanie problemów, jeśli hybrydyzacja in situ nie jest optymalna. W szczególności wyeliminowaliśmy stosowanie leczenia zarodka proteinazą K i RNAzy, dwoma etapami, które mogą zależeć od jakości odczynnika, a także mogą zmniejszać intensywność sygnału, jeśli są przesadzone. Protokół zapewnia również pewien stopień oszczędności kosztów dzięki wyeliminowaniu użycia kilku odczynników. Wreszcie, protokół ten zawiera również kilka prostych wskazówek dotyczących lepszego przechwytywania obrazów wyników hybrydyzacji in situ. Chociaż protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem pracy na zarodkach Xenopus, jest prawdopodobne, że przynajmniej niektóre z uproszczeń będą miały zastosowanie do prac nad hybrydyzacją in situ w innych systemach zarodkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie zarodków

  1. Jeśli nie jest to robione rutynowo w ramach hodowli zarodków, usuń galaretkę z zarodków przy użyciu 2,5% cysteiny, pH 8,0 przed utrwaleniem 8. Chociaż nie jest to absolutnie konieczne, warto ręcznie usunąć otoczkę nawozową przed utrwaleniem za pomocą cienkich kleszczy.
    1. Do transferu zarodków należy używać szklanych pipet Pasteura. Pipeta nie jest wystarczająco szeroka, aby przenieść zarodki, więc użyj diamentowego pisaka, aby przeciąć szklaną pipetę w miejscu wystarczająco szerokim, aby pobrać zarodek. Wyeliminuj ostre krawędzie pipet po przecięciu, szybko przepuszczając odciętą końcówkę przez płomień palnika Bunsena, aby stopić ostre krawędzie.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność, ponieważ szkło może być nadal wystarczająco gorące, aby spowodować oparzenia, nawet jeśli po oględzinach wydaje się, że ostygło.
  2. Utrwalanie zarodka należy wykonywać etapami. Najpierw należy przygotować szklane fiolki do użycia w utrwalaniu zarodków. Używaj tych fiolek na wszystkich etapach, w tym do końcowego przechowywania. Używaj fiolek, które są przezroczyste z dobrym teflonowym uszczelnieniem w pokrywie, co pozwala na monitorowanie zarodków na wszystkich etapach procesu. Oznacz fiolki odpowiednimi informacjami eksperymentalnymi za pomocą markera permanentnego, a następnie przykryj etykietę przezroczystą taśmą, ponieważ nawet marker permanentny zostanie utracony w trakcie zabiegu z powodu użycia alkoholi i innych rozpuszczalników.
    1. Do utrwalenia zarodków należy użyć leku Mempfa. Przygotuj zapas 8% paraformaldehydu w partiach po 50-100 ml na raz. Użyj około 75% wymaganegoH2Oi podgrzej do 50-60 °C, która jest potrzebna do wprowadzenia paraformaldehydu do roztworu.
      UWAGA: To rozwiązanie różni się nieco od Memfa używanego w starszych opublikowanych wersjach protokołu, ponieważ wykorzystuje paraformaldehyd, a nie formaldehyd.
    2. Dodaj 2-3 krople 10N NaOH lub do momentu, gdy pH osiągnie około 7,5 (użyj papieru pH, aby sprawdzić pH). Paraformaldehyd jest bardzo toksyczny, dlatego roztwór podstawowy należy wytwarzać w dygestorium. Gdy paraformaldehyd znajdzie się w roztworze, przefiltruj roztwór przez papier Whatmana do świeżego pojemnika i dodajH2Odo końcowej objętości. W razie potrzeby roztwór paraformaldehydu należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie.
    3. Zebrać pozostałe składniki roztworu utrwalającego Mempfa (Tabela 1). Upewnij się, że końcowe stężenie robocze paraformaldehydu wynosi 4%. Przechowywać wszystkie składniki roztworu utrwalającego w temperaturze 4 °C jako zapasy.
    4. Za pomocą pipety z ciętego szkła utrwalić zarodki, dodając je do oznakowanych szklanych fiolek, które zostały wypełnione około 3-4 ml roztworu Mempfa (Tabela 1). Unikaj umieszczania więcej niż 20-30 zarodków w jednej fiolce. Dodać zarodki z minimalnym transferem płynu z pożywki zarodkowej. Utrwalać zarodki w roztworze Mempfa przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. W przypadku późnych struktur endodermy należy wykonać in situs na ręcznie izolowanych pochodnych jelit i endodermy 9,10, co pozwala na dobrą penetrację sondy, a także pozwala uniknąć przebarwień ubytków.
    6. Przechowywać roztwór 100% metanolu w temperaturze -20 °C. Po utrwaleniu paraformaldehydu roztwór Mempfa należy zastąpić około 4 ml 100% metanolu o temperaturze -20 °C do przechowywania zarodków.
    7. Po dodaniu metanolu należy zakręcić fiolki, aby zapobiec przywieraniu zarodków do szkła lub innych zarodków. Upewnij się również, że fiolki są szczelnie zamknięte, ponieważ metanol może z czasem odparować w zamrażarce, jeśli jest luźny.
      UWAGA: Zarodki mogą być przechowywane w metanolu przez co najmniej rok, a prawdopodobnie dłużej, przed barwieniem bez utraty jakości hybrydyzacji in situ.

2. Przygotowanie sondy

  1. Użyj 1-2 μg matrycy DNA do wykonania sond znakowanych digoksygeniną. Wytnij plazmid zawierający odpowiednią sekwencję DNA na końcu 5' genu będącego przedmiotem zainteresowania enzymem restrykcyjnym odpowiednim dla tego wektora, aby wygenerować sondy antysensowne.
    UWAGA: Plazmid powinien mieć odpowiednie miejsce wiązania polimerazy RNA (np. T7, T3 lub SP6).
  2. Poczekaj, aż DNA, woda, mieszanina NTP i bufor polimerazy ogrzeją się do temperatury pokojowej przed złożeniem reakcji syntezy sondy. Dodać składniki reakcji syntezy RNA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w kolejności podanej w tabeli 2. Dostosuj objętość dodawanej wody, aby całkowita objętość reakcji syntezy sondy wynosiła 20 μl. Zorganizuj reakcję w temperaturze pokojowej, ponieważ składniki buforu polimerazy mogą wytrącać matrycę DNA w wysokich stężeniach i w niskiej temperaturze.
  3. Inkubować reakcję transkrypcji przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Inkubacje trwające nieco dłużej niż dwie godziny nie prowadzą do żadnych działań niepożądanych, ale również wykazują niewielki wzrost plonów. W przypadku inkubacji przez godzinę wydajność zostanie zmniejszona, ale nadal wystarczająca, aby uzyskać dobrą sondę.
    1. Czekając na zakończenie reakcji transkrypcji, przygotuj żel agarozowy, który posłuży do przetestowania jakości sondy. Stopić 1 μg agarozy w 100 ml 1x buforu TAE (patrz tabela 1) przez podgrzanie roztworu do temperatury wrzenia. Zdejmij roztwór z ognia, gdy proszek agarozy całkowicie się rozpuści.
    2. Dodać 2 μl roztworu podstawowego bromku etydyny (10 mg/ml) do około 100 ml żelu agarozowego, gdy agaroza ostygnie do około 60 °C, aby umożliwić wizualizację RNA w świetle ultrafioletowym (UV).
      UWAGA: Ten roztwór żelu agarozowego można przechowywać w inkubatorze o temperaturze 60 °C, dzięki czemu przyszłe żele można nalewać bez wielokrotnego topienia. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z bromkiem etydyny ze względu na potencjalną toksyczność.
  4. Dodać 1 μl DNAseI (RNAseI (gatunek wolny od RNAzy) do reakcji transkrypcji po 2 godzinach inkubacji i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C w celu wyeliminowania matrycowego DNA.
  5. Usunąć 1 μl mieszaniny reakcyjnej, aby sprawdzić, czy 1% żel agaroza-TAE, a do reszty (20 μl) dodać 80 μl 1% SDS do buforu TE (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 μl octanu 5M NH4 i 220 μl zimnego etanolu. Energicznie zmieszaj mieszankę i odstaw na lód, aż znane będą wyniki kontroli jakości RNA.
    1. Uruchomić 1 μl RNA usuniętego przed wytrąceniem na 1% żelu agaroza-TAE. Aby ułatwić ładowanie żelu, dodaj do RNA 4-5 μl wody i 1 μl standardowego barwnika ładującego. Zobacz RNA na żelu za pomocą transiluminatora światła UV w celu sprawdzenia jakości sondy (patrz dyskusja).
  6. Wytrącić pozostały RNA, który został odłożony na lód w kroku 2.5, wirując w mikrowirówce z pełną prędkością przez 10 do 15 minut. Odciągnąć supernatant za pomocą wyciągniętej szklanej pipety i pozostawić do krótkiego wyschnięcia.
    1. Zawiesić sondę z 1 ml buforu do hybrydyzacji RNA (Tabela 1) w probówce Eppendorfa. Odwirować i krótko podgrzać probówkę do 37 °C i ponownie wprowadzić wir. Przenieść roztwór sondy do 15 ml zakręcanej probówki z polistyrenu i napełnić do 7-10 ml buforem do hybrydyzacji RNA. Uwaga: Sonda może być dalej rozcieńczana (10-krotne dalsze rozcieńczenie może nadal działać), co często skutkuje niskim tłem, ale Reakcje barwienia również potrwają dłużej.

3. Hybrydyzacja in situ

  1. Pobrać zarodki, które były przechowywane w metanolu o temperaturze -20 °C i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej. Całą procedurę należy wykonać w szklanych fiolkach. Jeśli różne zarodki z jednej grupy mają być oglądane przez różne sondy, trzymaj je w jednej fiolce do momentu dodania sond, aby zmniejszyć zmienność i poród pierwszego dnia.
    1. Ponownie nawodnić zarodki za pomocą serii metanolu, jak opisano w Tabeli 3 (patrz Tabela 1 dla przepisów na płukanie) w ramach przygotowań do dodania sondy. Delikatnie obracaj zarodki po każdej zmianie, aby upewnić się, że nie przyklejają się do boków lub do siebie nawzajem, i kołysz zarodkami, montując fiolki na nutatorze. Podczas przenoszenia płynów należy sprawdzić wnętrze nakrętek, aby upewnić się, że zarodki nie zostały tam uwięzione.
    2. Po umieszczeniu w roztworze sondy należy zhybrydyzować zarodki przez noc, jak opisano w Tabeli 3.
  2. Wyjmij roztwór sondy. Zużytą sondę można przechowywać w probówce polistyrenowej o pojemności 15 ml z nakrętką, oznaczoną datą i liczbą użyć sondy, w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Ta sama sonda może być wielokrotnie używana do kolejnych hybrydyzacji in situ, aż reakcje kolorymetryczne zaczną trwać nienormalnie długo, aby osiągnąć pożądaną intensywność.
    1. Po wyjęciu sondy należy przygotować zarodki do barwienia przeciwciałami przeciwko sondie poprzez serię płukań opisanych w Tabeli 4. Zmienić temperaturę zgodnie z wymaganiami (Tabela 4), przesuwając nutator z dołączonymi fiolkami z zarodkami bezpośrednio do pieców do hybrydyzacji, które są ustawione na odpowiednią temperaturę.
    2. Uzupełnić odpowiednią objętość przeciwciała MAB+HTSS+BR+anti-Dig (Tabela 4) w czasie, gdy zarodki są inkubowane w roztworze blokującym MAB+HTSS+BR, tak aby przeciwciało zostało zablokowane przed dodaniem do zarodków. Roztwory blokujące powinny być świeże w dniu użycia.
  3. Wyjąć roztwór przeciwciała i rozpocząć płukanie zgodnie z tabelą 5 po całonocnej inkubacji z przeciwciałem. Wykonaj co najmniej dwanaście 30-minutowych prań, aby przygotować się do barwienia podłożem fosfatazy alkalicznej i maksymalnie zredukować tło. Do etapów płukania należy użyć buforu MAB lub roztworu TBT (Tabela 1).
    UWAGA: Roztwór TBT to TTw, do którego dodano 2 mg/ml BSA.
    1. Zastąp ostatni roztwór płuczący substratem fosfatazy alkalicznej BM Purple. Przeprowadzić reakcję barwienia w temperaturze pokojowej lub 37 °C.
      UWAGA: Barwienie jest szybsze w temperaturze 37 °C, ale pozostawienie na noc często może prowadzić do niedopuszczalnego zabarwienia tła. Reakcje barwienia często wymagają barwienia przez noc, a temperatura pokojowa jest do tego najbezpieczniejsza.
    2. Jeśli wymagane jest dalsze barwienie, a fioletowy roztwór BM nabiera niebieskiego koloru, zastąp roztwór barwiący świeżym roztworem BM Purple i umieść probówki w temperaturze 37 °C. Jeśli docelowe mRNA jest bardzo obfite, umieść zarodki w roztworze barwiącym w temperaturze 4 °C na noc, a następnie przenieś zarodki do temperatury pokojowej lub 37 °C, aby umożliwić lepsze monitorowanie reakcji barwienia.
    3. Uważnie monitoruj nowe reakcje, ponieważ czas do uzyskania końcowego wyniku różni się znacznie w zależności od różnych docelowych RNA. W celu zachowania spójności należy zatrzymać reakcję barwienia (patrz ppkt 3.4), gdy przy dłuższej inkubacji nie powstają nowe miejsca ekspresji. Co ważne, jeśli hybrydyzacja in situ jest stosowana jako test do eksperymentów dotyczących różnych grup poddanych leczeniu, należy użyć tego samego czasu dla reakcji kolorystycznych między zarodkami poddanymi działaniu substancji i kontrolnych.
  4. Przerwać reakcję barwienia i przygotować zarodki do przechowywania i zapisu obrazu, zmieniając płyny, jak opisano w Tabeli 6. Na tym etapie nie należy kołysać zarodków, ponieważ usunięcie plamy można uwidocznić jako fioletowe zabarwienie metanolu wokół zarodków.
    UWAGA: Często zarodki mają jasnoniebieskie zabarwienie od roztworu barwiącego, a zimny metanol może je przynajmniej częściowo usunąć, chociaż nie jest to wystarczające do usunięcia ciężkiego tła lub ubytków. Metanol na zimno odnosi się do metanolu, który jest przechowywany w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
    1. Ponownie nawodnić zarodki i utrwalić plamę za pomocą Mempfa (Tabela 6). Po utrwaleniu usuń Mempfa i umyj zarodki 25% metanolem.
    2. Usuń 25% metanolu i dodaj roztwór wybielający, jeśli wymagane jest usunięcie endogennego pigmentu. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z roztworem wybielającym, ponieważ może on spowodować oparzenia. Uważnie obserwuj bielenie, ponieważ zachodzi ono stosunkowo szybko, a stopień wybielania można zmieniać w celu uzyskania różnych efektów (ryc. 2).
    3. Odwodnić zarodki za pomocą serii metanolu do 100% metanolu w celu długotrwałego przechowywania po bieleniu lub przenieść do PBS w celu krótkotrwałego przechowywania i późniejszego obrazowania (patrz Tabela 6).

4. Obrazowanie zarodków

  1. Gdy zarodek zakończy proces barwienia, zobrazuj zarodek, aby informacje o tym, gdzie wyrażany jest gen będący przedmiotem zainteresowania, zostały uchwycone dla szerszego grona odbiorców. Użyj 1% agarozy jako tła do oglądania nieoczyszczonych zarodków.
    UWAGA: Agaroza daje niebiesko-szare tło, które dobrze kontrastuje z zarodkiem i niebieskim kolorem reakcji barwienia. Pomaga również rozproszyć rozpraszające cienie i odbicia, które odwracają uwagę od zarodka.
    1. Dodaj agarozę do wody, a następnie doprowadź do wrzenia, aż agaroza znajdzie się w roztworze, a następnie ostudź do 50 stopni przed wlaniem na szalkę Petriego. Podobnie jak w przypadku roztworu żelu TAE, roztwór agarozy należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 55 °C do wielokrotnego użytku. Wlej agarozę na głębokość około 2 mm do szalki Petriego. W razie potrzeby dostosuj głębokość agarozy, aby uzyskać nieco inny odcień tła.
    2. Po ponownym uwodnieniu z przechowywania w metanolu do roztworu wodnego (PBS lub TTw), przy użyciu serii metanolu, umieścić zarodki na szalce Petriego na zasadzie agarozy (patrz Tabela 6). Utrzymuj roztwór w czystości i, jeśli to konieczne, użyj prostego filtrowania, aby wyeliminować małe cząstki stałe, które mogą zakłócić czyste tło dobrych obrazów.
    3. Aby zobrazować zarodki z alternatywnych widoków, takich jak strona brzuszna, wytnij cienkie kanały w agarozie, aby dopasować je do zarodka za pomocą cienkich kleszczy i umieść zarodki w tych kanałach w celu orientacji (ryc. 3). Zachowaj ostrożność podczas manipulowania zarodkami, ponieważ łatwo ulegają uszkodzeniu.
      UWAGA: Większość etapów ma charakterystyczną pozycję, którą przyjmują po umieszczeniu w roztworze. Na przykład zarodki w stadium blastuli mają tendencję do siedzenia zwierzęcą stroną do góry. Gdy zarodki zaczną się wydłużać, leżą na boku.
  2. Użyj światłowodowego źródła światła, aby oświetlić zarodek pod płytkim kątem, tworząc cienie na zarodku, które nadają głębi obrazowi i pomagają dostrzec struktury powierzchniowe. Ponieważ wybielanie może wyeliminować pigment, który zapewnia przydatne punkty orientacyjne, użyj cieniowania w przypadku silnie wybielonych zarodków.
  3. Oczyść zarodki, aby zobrazować barwienie, które znajduje się głęboko w zarodku, na przykład w strunie grzbietowym, płucach lub obszarach mózgu (ryc. 4). Aby to osiągnąć, należy poddać zarodki serii metanolu, aż znajdą się w 100% metanolu.
    1. Po całkowitym zanurzeniu w metanolu przenieść zarodki do roztworu składającego się z jednej części alkoholu benzylowego i dwóch części benzoesanu benzylu (BABB). Zarodki początkowo będą unosić się na powierzchni, ale gdy metanol zmiesza się z BABB, zatoną w BABB. Wykonaj każdy krok związany z BABB w szklanych fiolkach lub naczyniach; BABB stopi każdy plastik lub farbę.
    2. Po oczyszczeniu obejrzyj zarodki ze światłem przechodzącym pochodzącym spod zarodka. Dostosuj intensywność światła, a także kąt od dołu, aby poprawić kontrast i zapewnić najlepszy kolor.
    3. Podczas oglądania oczyszczonych zarodków podnieś szklaną szalkę Petriego z podstawy. Zrób to, po prostu używając dwóch innych pokrywek szalki Petriego, aby podnieść ją tak, aby obszar szalki z zarodkami był podniesiony.
      UWAGA: Ma to tę zaletę, że powoduje rozmycie podstawy i wyeliminowanie rozpraszających efektów wynikających z niedoskonałości lub plam na podstawie mikroskopu, które mogą zakłócać obraz.

5. Podwójna hybrydyzacja in situ

  1. Aby jednocześnie zobaczyć wzorzec ekspresji dwóch różnych genów w jednym zarodku, zsyntetyzuj dwie sondy, po jednej dla każdego z różnych genów. Zsyntetyzuj jedną sondę, używając DIG-11-UTP jako etykiety, jak opisano powyżej. Rozcieńczyć produkt reakcji transkrypcji w buforze hybrydyzacyjnym RNA, aby uzyskać 3 razy bardziej skoncentrowaną sondę niż stosowana do pojedynczych hybrydyzacji in situ.
    1. Zsyntetyzuj drugą sondę będącą przedmiotem zainteresowania, używając tego samego protokołu, co dla sondy oznaczonej jako DIG, z wyjątkiem tego, że DIG-11-UTP musi zostać zastąpiony fluoresceiną-12-UTP. Rozcieńczyć produkt reakcji transkrypcji w buforze hybrydyzacyjnym RNA, aby uzyskać 3 razy bardziej skoncentrowaną sondę niż stosowana do pojedynczych hybrydyzacji in situ.
    2. Wymieszaj dwie skoncentrowane sondy w stosunku 1:1. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj sondy znakowanej fluoresceiną dla genu, który wykazuje najsilniejszą ekspresję w protokole pojedynczej hybrydyzacji in situ.
  2. Należy stosować ten sam protokół hybrydyzacji in situ, który opisano dla pojedynczych hybrydyzacji in situ, z wyjątkiem użycia podwójnej sondy (sondy zawierającej 1,5-krotnie stężoną mieszaninę sond znakowanych digoksygeniną i fluoresceiną) pod koniec pierwszego dnia zamiast pojedynczej sondy do hybrydyzacji in situ.
    1. Postępuj zgodnie z pojedynczym protokołem hybrydyzacji w drugim dniu protokołu podwójnej hybrydyzacji in situ, z wyjątkiem użycia fragmentów anty-fluoresceiny-AP Fab w rozcieńczeniu 1:4,000 zamiast fragmentów anty-DIG-AP Fab. Wypłukać nadmiar przeciwciała z zarodka jak w protokole pojedynczego in situ i przeprowadzić pierwszą reakcję barwną przy użyciu substratu BM-Purple AP.
  3. Po pierwszej reakcji barwnej dezaktywuj przeciwciało fluoresceiny w 0,1 M glicynie o pH 2,0 przez 40 minut, a następnie wykonaj pięć dziesięciominutowych płukań w MAB. Zablokuj zarodki w MAB+HTSS+BR na 90 min. Dodać przeciwciało anty-DIG w rozcieńczeniu 1:2 000 w MAB+HTSS+BR i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    1. Następnego dnia dokładnie umyj zarodki w MAB (12 płukań po 30 minut) w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.
    2. Myj zarodki przez 10 minut w buforze AP (Tabela 1), a następnie zabarwić BCIP (0,5 mg/ml w buforze AP).
      UWAGA: Kombinacja in situ powinna dać ciemnoniebiesko-fioletową plamę dla pierwszej reakcji barwnej i jasnoniebieską reakcję koloru dla drugiej (ryc. 5).
    3. Zatrzymaj ostateczną reakcję kolorystyczną, usuwając bufor AP i spłucz trzykrotnie MAB. Utrwalaj zarodki za pomocą leku Mempfa przez 10 minut. Umyj zarodki 5 szybkimi płukaniami w MAB lub TBT.
    4. Przy tej kombinacji kolorów stosowanie metanolu w zabiegach barwienia nie jest już możliwe, ponieważ wyeliminuje to sam kolor BCIP. Przechowuj zarodki po barwieniu i utrwaleniu w PBS z 0,02% azydkiem sodu. Intensywność barwienia może być słaba z podwójnym in situs. Jeśli jest to problem, zmniejsz liczbę prań do czterech, każde trwające 2 godziny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie sond specyficznych dla tkanek może dostarczyć niezwykle cennych informacji na temat stanu rozwoju konkretnych narządów. W poniższych przykładach stadium embrionu określono na podstawie tabeli stadiów Nieuwkoopa i Fabera 11. Stosując sondy dla genów ekspresowanych po różnicowaniu, na przykład dla troponiny I serca w stadiach 28-30 (Ryc. 1C), można ocenić obecność lub wielkość zróżnicowanego narządu na każdym etapie po różnicowaniu. Przed laty embriolodzy potrafili przepro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość wykorzystania hybrydyzacji in situ do wizualizacji wzorca ekspresji określonych genów pozostaje najczęściej stosowaną metodą identyfikacji określonych narządów lub typów komórek w zarodku Xenopus . Wynika to z kilku zalet oferowanych przez tę technikę. Ekspresja genu może zidentyfikować określone struktury na długo przed jakimikolwiek histologicznymi oznakami różnicowania, takimi jak w przypadku ekspresji nkx2,5 w komórkach progenitorowych serca, przed wyraźnym rozgraniczeniem tych ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować CIHR za wsparcie stypendialne Steve'a Deimlinga oraz Departamentowi Pediatrii Uniwersytetu Zachodniego Ontario za wsparcie Steve'a Deimlinga, Ramiego Halabiego i Stephanie Grover. Prace te były wspierane przez R2654A11 grantowy NSERC oraz suplement NSERC Discovery Accelerator Supplement

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wytrząsarki do probówek LabguakeVWR17-08-2011
FiolkiVWR VWR10-07-2012
L-cysteinaBioShopCYS342.500
Zestaw trifosforanu rybonukleozydu, 100mMRoche11277057001
Digoxigenin-11-UTPRoche11209256910
inhibator Rnazy (Rnase OUT)Invitrogen 10777-019
T7 Polimeraza RNAFermentasEPO111
T3 Polimeraza RNAFermentasEPO101
SP6 Polimeraza RNAFermentasEPO131
Dnaza 1Invitrogen 18047-019
Surowica owcza  Żubr31150
Odczynnik blokującyRoche11096176001
BM fioletowy Ap SubstrateRoche11442094001
Anty-Digoxigenin-Ap Fragmenty FebRoche11093274910
MetanolVWRCAMX0485-7
NaClBioShopSOD002.10
SDSEM 7910
EDTABioShopEDT001.500
TrisBioShopTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4SigmaM-2643
MopyBioShopMOP001.250
EGTASigmaE-3889-25G
ParaformaldehydBioShopPAR070.500 
Formamid  Firma VWR       CAFX0420-4 
RNARoche10109223001
Kwas maleinowy  Firma VWR       CAMX0100-3
Cytrynian tri-sodowyBioShopCIT001
Nadtlenek wodoru (30% roztwór)EM HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
Alkohol benzylowySigmaB-1042
Benzoesan benzyluSigmaB-6630
UltraPure Agaroza Invitrogen Średnica 16500-500
TGL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
  2. Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
  3. Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
  4. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  5. Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
  6. Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
  7. Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
  8. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
  10. Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
  12. Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
  13. Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
  14. Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
  15. Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
  16. Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
  17. Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
  18. Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
  19. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
  20. Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zarodki Xenopusbadanie organogenezyanaliza ekspresji gen wfiksacja zarodk wsynteza sondybarwienie przeciwcia amioptymalizacja obrazowaniaseria metanolowat o ARO

Powiązane artykuły