Artykuł metodologiczny

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

DOI:

10.3791/51533

⸱

17 maja 2014

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodki danio pręgowanego są potężnym narzędziem do badań przesiewowych małych cząsteczek na dużą skalę. Transgeniczne danio pręgowane, które wyrażają fluorescencyjne białka reporterowe, są często wykorzystywane do identyfikacji substancji chemicznych modulujących ekspresję genów. Badania chemiczne, które badają fluorescencję u żywych danio pręgowanych, często opierają się na drogim, specjalistycznym sprzęcie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości. Opisujemy procedurę z użyciem standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego ze zmotoryzowanym stolikiem do automatycznego obrazowania zarodków danio pręgowanego i wykrywania fluorescencji specyficznej dla tkanki. Korzystając z transgenicznych danio pręgowanego, które zgłaszają aktywność receptora estrogenowego poprzez ekspresję GFP, opracowaliśmy półautomatyczną procedurę badania przesiewowego pod kątem ligandów receptora estrogenowego, które aktywują reportera w sposób specyficzny dla tkanki. W tym filmie opisujemy procedury układania zarodków danio pręgowanego w ciągu 24-48 godzin po zapłodnieniu (hpf) na 96-dołkowej płytce i dodawania małych cząsteczek wiążących receptory estrogenowe. Przy 72-96 hpf obrazy każdej studzienki z całej płytki są automatycznie zbierane i ręcznie sprawdzane pod kątem fluorescencji specyficznej dla tkanki. Protokół ten wykazuje zdolność do wykrywania estrogenów, które aktywują receptory w zastawkach serca, ale nie w wątrobie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgeniczne danio pręgowane, które pozwalają na bezpośrednią wizualizację aktywności w szlakach sygnałowych, takich jak czynniki wzrostu fibroblastów1, kwas retinowy2 iestrogeny3, w żywych zarodkach. Takie narzędzia umożliwiają badania przesiewowe w kierunku substancji chemicznych, które zaburzają szlaki sygnałowe (oznaczane jako zmiana intensywności fluorescencji) lub substancji chemicznych, które modulują sygnalizację w sposób specyficzny dla tkanki (zmiana lokalizacji fluorescencji)4. Zautomatyzowane przechwytywanie obrazów znacznie zwiększa przepustowość badań przesiewowych substancji chemicznych5,6. Ekrany, które automatycznie badają fluorescencję u żywego danio pręgowanego, często opierają się na drogim, specjalistycznym sprzęcie. Tak zwane badania przesiewowe o wysokiej zawartości zapewniają korzyści w postaci obrazowania ilościowego o wysokiej rozdzielczości, ale kosztem użycia specjalistycznych czytników płytek wyposażonych w mikroskopię konfokalną7,8. Celem tej metody jest automatyczne oznaczenie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego na 96-dołkowej płytce przy użyciu standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego. Fluorescencja specyficzna dla tkanek może być rozróżniana przy użyciu tej techniki i może być rozsądnym podejściem dla laboratoriów, które nie mają dostępu do specjalistycznych czytników płytek lub sprzętu do badań przesiewowych o wysokiej zawartości.

W tym protokole używamy automatycznego obrazowania do wykrywania specyficznych tkankowo agonistów receptora estrogenowego (ER) u żywych ryb danio pręgowanego po 3 dniach od zapłodnienia (dpf). Linia transgeniczna Tg(5xERE:GFP)c262/c262 zawiera 5 tandemowych sekwencji DNA elementu odpowiedzi estrogenowej (ERE) przed białkiem zielonej fluorescencji (GFP)3. W przypadku braku liganda ER są zwykle nieaktywne. Wiązanie ligandów wyzwala zmianę konformacyjną, umożliwiając receptorom wiązanie DNA ERE i regulację transkrypcji9. 5xERE: GFP ryba może być używana do przesiewania bibliotek chemicznych dla modulatorów ER i może być używana do badania próbek wody środowiskowej pod kątem zanieczyszczeń estrogenowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół został zatwierdzony przez University of Alabama at Birmingham Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Hodowla danio pręgowanego i kolekcje jaj

  1. Trzy dni przed rozpoczęciem ekspozycji chemicznej zmontuj zbiorniki hodowlane z przegrodami, aby oddzielić samce i samice. Napełnij każdy zbiornik do połowy wodą z systemu akwakultury. Za pomocą sieci przenieś ryby Tg(5xERE:GFP)c262/c262 do zbiorników hodowlanych, umieszczając 2 samce i 3 samice w każdym zbiorniku oddzielone przegrodą. Umieść pokrywkę na każdym zbiorniku i oznacz etykietę z datą i szczepami, które mają zostać skrzyżowane.
  2. Następnego ranka usuń wszystkie bariery i przegrody uchylne, aby utworzyć płytki obszar na jednym końcu zbiornika hodowlanego. Pozwól danio pręgowanemu na kojarzenie się, zbierając zarodki w 10-minutowych odstępach, aby zapewnić precyzyjną ocenę etapu rozwoju. Oczyść jajka, przepłukując je przez sitko do herbaty na pożywce E3B i delikatnie wypłucz zarodki na szalki Petriego. Przywróć dorosłe ryby do stałych zbiorników.
  3. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego posortuj, policz i usuń wszelkie niezapłodnione, nieprawidłowe lub uszkodzone zarodki. Umieścić zarodki na szalkach Petriego na pożywce E3B i w temperaturze 28,5 °C w cyklu 14:10 światło: ciemność. Gęstość zarodków może wpływać na rozwój. Umieścić nie więcej niż 100 zarodków w szalce o wymiarach 100 x 35 mm i nie więcej niż 50 zarodków w szalce o wymiarach 60 x 15 mm.
  4. Przez 24 hpf zastąp pożywkę E3B zawierającą 200 μM 1-fenylo2-tiomocznika (PTU). PTU zapobiega tworzeniu się pigmentu i utrzymuje przezroczystość zarodków i larw danio pręgowanego, co poprawia klarowność obrazu. UWAGA: skoncentrowane zapasy PTU są niebezpieczne; nosić rękawice podczas wytwarzania roztworu E3B + PTU.
  5. Po 1 dniu od zapłodnienia (dpf) ręcznie usuń kosmówkę z każdego zarodka za pomocą cienkich kleszczy. Wydaje się, że kosmówka nie wpływa na przenikanie estrogenów, jednak usunięcie zwiększa klarowność obrazu. Nie ma potrzeby usuwania kosmówki z podłoża. UWAGA: Jako alternatywę dla ręcznej dechorionacji, partie zarodków mogą być chemicznie dechorionowane przy użyciu 1 mg/ml pronazy, jak opisano wcześniej11.

2. Chemiczna obróbka embrionów

  1. Dzień przed zabiegiem należy przygotować roztwory podstawowe każdej substancji chemicznej o 1000-krotnym stężeniu w DMSO (lub odpowiednim rozpuszczalniku). Na przykład, aby wystawić zarodki na działanie 10 μM bisfenolu A (BPA), przygotuj 10 mM roztwór podstawowy BPA w 100% DMSO. Zapewnia to równomierne stężenie DMSO w każdym zabiegu i pozwala na nietoksyczne rozcieńczenie DMSO w stosunku 1:1,000, które służy jako kontrola nośnika. Przechowywać roztwory podstawowe w temperaturze -20 °C. W przypadku tego protokołu zarodki zostaną wystawione na działanie 1 μM i 10 μM BPA, 18,5 nM i 1,85 μM genisteiny, 367 nM estradiolu (kontrola pozytywna) i nośnika (0,1% DMSO, kontrola ujemna).
    UWAGA: Chemikalia, takie jak BPA i estradiol, są niebezpieczne i mogą mieć szkodliwy wpływ na płód ludzki. Z substancjami zaburzającymi funkcjonowanie układu hormonalnego należy obchodzić się ostrożnie i zawsze używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
  2. W dniu zabiegu rozmrozić przygotowane podstawowe roztwory chemiczne. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 000 przez pipetowanie 1 ml E3B + PTU do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodanie 1 μl podstawowego roztworu chemicznego. Wiruj energicznie. Rozcieńczyć DMSO 1:1,000 do E3B + PTU jako sterowanie pojazdem. Użyj 1 ml E3B + PTU w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml jako kontrolę bez poddanej obróbki.
  3. Za pomocą plastikowej pipety transferowej o dużym otworze przenieś zarodki z szalek Petriego do każdego dołka na 96-dołkowej płytce, 3 zarodki na dołek, 3 dołki na warunek. Aby zapobiec parowaniu podczas długotrwałego leczenia, należy pominąć zarodki z zewnętrznych rzędów i kolumn płytki (rzędy A i E, kolumny 1 i 12). Studzienki zewnętrzne można wypełnić 300 μl E3B + PTU. Odpowiednio oznacz pokrywę talerza.
  4. Usuń pożywkę z każdej studzienki za pomocą plastikowej pipety transferowej z cienką końcówką. Pracuj szybko, aby uniknąć wysuszenia zarodków.
  5. Dodać 200 μl roztworu do uzdatniania do odpowiedniego dołka. Umieść pokrywkę pod płytką jako prowadnicę, aby zapewnić dodanie zabiegów do odpowiednich studzienek. Zmieszać każdą probówkę przed pipetowaniem, aby rozprowadzić substancję chemiczną w roztworze. Potwierdź wzrokowo, że każdy zarodek znajduje się w roztworze leczniczym. Jeśli zarodki znajdują się z boku studzienki, użyj czystej pipety transferowej, aby umyć je do studzienki z roztworem leczniczym.
  6. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C. Zarodki zostaną przeanalizowane pod kątem fluorescencji w temperaturze 72 hpf.

3. Automatyczne obrazowanie zarodków na 96-dołkowych płytkach

  1. Znieczulić zarodki, dodając 10 μl 4 mg/ml trikainy do każdej studzienki.
    UWAGA: Znieczulić zarodki przed obrazowaniem. Przy 24-96 hpf danio pręgowany wykazuje spontaniczny ruch i reakcję zaskoczenia na zmieniające się źródło światła podczas przechwytywania obrazu. Znieczulenie zarodków ogranicza ruch podczas obrazowania.
  2. Umieść 96-dołkową płytkę w zmotoryzowanym stage i skalibruj stage. Korzystając z oprogramowania Zeiss Zen Blue 2011 do automatyzacji i kontroli mikroskopii, wybierz opcję nośnika próbki i wybierz multiwell 96. Wybierz opcję Kalibruj. Postępuj zgodnie z instrukcjami krok po kroku, aby skalibrować stage.
    UWAGA: Nie odznaczaj przycisku kafelków po tym kroku. Jeśli przycisk płytek nie jest zaznaczony, ustawienia kalibracji mogą zostać utracone, a płytka 96-dołkowa będzie musiała zostać ponownie skalibrowana.
  3. Korzystając z obiektywu 10x i ustawienia jasnego pola (BF), zidentyfikuj zarodek kontroli pozytywnej i ustaw ustawienia ekspozycji odpowiednio dla kanałów BF i GFP, upewniając się, że sygnał fluorescencji nie nasyca aparatu. Skoncentruj się na pojedynczym zarodku i zaprogramuj mikroskop tak, aby uzyskał łącznie 3 przekroje Z, jeden obraz 50 μm powyżej i jeden 50 μm poniżej aktualnej płaszczyzny ogniskowej.
    UWAGA: Ponieważ różne tkanki zajmują różne płaszczyzny ogniskowe, zapewni to, że dla każdego danio pręgowanego obrazy zostaną wykonane z ostrością serca i wątroby.
  4. Ustaw parametry oprogramowania, aby uzyskać obraz kafelkowy przy użyciu kanałów GFP i BF. Na karcie pobierania wybierz pozycję konfiguracja zaawansowana. Wybierz regiony kafelków, a następnie kafelki. Wybierz opcję studni okrągłej.
    UWAGA: Kafelkowanie służy do tworzenia złożonego obrazu każdej studni. Pojedyncze pole widzenia rejestruje tylko niewielką część każdej studni. Funkcja kafelkowania może automatycznie uchwycić wiele sąsiednich pól widzenia z każdej studni, tworząc złożony obraz całej studni. Dzięki temu możliwe jest automatyczne przechwycenie 96 obrazów kompozytowych na płytkę, przy czym każdy obraz kompozytowy zawiera kilkadziesiąt pojedynczych obrazów z jednego dołka.
  5. Wybierz nośnik i współczynnik wypełnienia 90%. Wybranie współczynnika wypełnienia 90% spowoduje uchwycenie wielu obrazów wybranych studzienek, tak że 90% obszaru każdej studzienki będzie widoczne na obrazie kompozytowym.
    UWAGA: Po wybraniu współczynnika wypełnienia zostanie wyświetlony wykres przedstawiający obszar, który ma zostać zobrazowany. Wybierz wartość procentową, która będzie obejmować obszar studni odpowiedni dla eksperymentu.
  6. W obszarze Opcje wybierz żądany stopień nakładania się.
    UWAGA: Podczas zszywania płytek w celu uzyskania jednego reprezentatywnego obrazu, nakładanie się 5-10% pozwala na gładki szew między obrazami. Jeśli jednak zszywanie obrazów nie jest konieczne, użycie nakładania 0% skróci czas obrazowania. Przy użyciu 90% współczynnika wypełnienia i 5% nakładania się, złożony obraz pojedynczego dołka składa się z 59 pojedynczych obrazów.
  7. Rozpocznij obrazowanie. Mikroskop automatycznie uzyska obrazy.
  8. Ręcznie sprawdź złożone obrazy każdej studzienki pod kątem fluorescencji specyficznej dla tkanki (ryc. 1).
  9. UWAGA: Najlepiej jest rozpocząć od kontroli pozytywnej, aby potwierdzić, że narażenie na działanie substancji chemicznej zadziałało przed obserwacją eksperymentalnych studzienek uzdatniających.

4. Ręczne przechwytywanie obrazu zarodków na płytce 96-dołkowej

UWAGA: Aby potwierdzić wyniki, użyj obiektywu o 20-krotnej dużej odległości roboczej, aby uzyskać bardziej szczegółowe obrazy ręcznie (Rysunek 2).

  1. Korzystając z obiektywu 20x i ustawienia jasnego pola (BF), zidentyfikuj zarodek kontroli pozytywnej i odpowiednio ustaw ustawienia ekspozycji dla kanałów BF i GFP, upewniając się, że sygnał fluorescencji nie nasyca aparatu.
  2. Identyfikuj poszczególne zarodki i ręcznie rejestruj obrazy.
    UWAGA: Po wybraniu ustawień ekspozycji dla zarodka kontroli pozytywnej nie należy ich zmieniać. Pozwala to na porównanie intensywności fluorescencji, ponieważ każdy obraz jest rejestrowany w jednolitych warunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje obrazy złożone z poszczególnych dołków płytki 96-dołkowej. Każdy obraz kompozytowy składa się z 59 pojedynczych obrazów, które nakładają się na siebie w 5%. Zauważ, że żywe danio pręgowane są rozmieszczone losowo w każdej studzience, ale jesteśmy w stanie odróżnić fluorescencję w sercu od wątroby. Obrazy w jasnym polu są przydatne jako odniesienia do oceny orientacji danio pręgowanego i wizualizacji nieprawidłowości morfologicznych (ryc. 1A i 1C). Zautomatyzowane obraz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje prostą metodę automatycznego obrazowania specyficznej dla tkanek fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego. Protokół został opracowany przy użyciu obserwatora Zeiss Axio. Z1 z oprogramowaniem Zen Blue 2011, jednak technikę tę można dostosować przy użyciu dowolnego mikroskopu odwróconego z zmotoryzowanym stolikiem i oprogramowaniem sterującym mikroskopem, które może wykonywać kafelkowanie w celu tworzenia złożonych obrazów. Wyposażenie mikroskopu odwróconego w stolik z napędem może stanowić praktycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Susan Farmer i personelowi ośrodka badawczego UAB za opiekę nad danio pręgowanym. Dofinansowanie ze środków start-upu z Zakładu Farmakologii i Toksykologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipety transferowe z tworzywa sztucznego; szeroki otwórFisher13-711-23
Pipety transferowe z tworzywa sztucznego; cienka końcówkaFisher13-711-26
96-dołkowe, okrągłe, płytki z płaskim dnemFisher21-377-203
Płytki 100 x 35 mmFisher08-757-100D
Płytki 35 x 60 mmFisher08-757-100B
Kleszcze Dumont #5 FineScience Tools11254-20wymiary końcówki 0,05 x 0,01 mm, do ręcznego usuwania kosmówki z zarodków
Metanosulfonian trikainySigma AldrichA5040-25Gpatrz Książka danio pręgowanego po przepis (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) 
1-fenylo 2-tiomocznik (PTU)Sigma AldrichP7629-10GPrzygotuj 20 mM zapasu (100x) i użyj w 200 μ M w E3B 
Zeiss Axio Observer Z1Carl ZeissProtocol wymaga odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z zmotoryzowanym stolikiem
20-krotny obiektyw o dużej odległości roboczejCarl ZeissUżywamy obiektywu o zasięgu roboczym 0,4 NA i 8,4 mm
Aparat cyfrowy Axiocam HRmCarl Zeiss
ZenBlue 2011Carl ZeissProtokół wymaga oprogramowania do automatyzacji i sterowania mikroskopią, aby umożliwić przechwytywanie obrazów kafelkowych za pomocą zmotoryzowanego stolika
Methylene BlueSigma AldrichMB-1; 25 gramówdaje 2% roztwór w wodzie RO do użycia w E3B (poniżej)
E3B60X E3 ROZWIĄZANIE:
NaCl                                      - 17,2 grama
KCl                                            - 0,76 grama
CaCl2-2H2O        - 2,9 grama
MgSO4-7H2O  - 4,9 grama lub MgSO4 - 2,39 grama
Rozpuścić w 1 litrze wody Milli-Q; przechowywać w sterylnej butelce o pojemności 1 litra.

1X E3B ROZTWÓR DLA DANIO PRĘGOWANEGO:
60X E3          150 ml
2% błękitu metylenowego        100 μ l 
Doprowadzić do 9 litrów za pomocą wody Milli-Q
 
Oprogramowanie sterujące mikroskopem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).
  2. Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
  3. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
  4. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
  5. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
  6. Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
  7. Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
  8. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
  9. Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
  10. Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
  11. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie fluorescencyjnezmotoryzowany stolikmikroskop epifluorescencyjnyreceptor estrogenowyp ytka 96 do kowareporter GFPprzesiewy chemiczneobrazowanie w przekroju Z

Powiązane artykuły