Artykuł metodologiczny

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

DOI:

10.3791/51537

⸱

2 stycznia 2015

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera jest jedną z dużej grupy zaburzeń neurodegeneracyjnych znanych jako tauopaty, które objawiają się złogami neuronalnymi hiperfosforylowanego białka tau w postaci splątków neurofibrylarnych (NFT). Gęstość NFT dobrze koreluje z upośledzeniem funkcji poznawczych i innymi objawami neurodegeneracyjnymi, co skłania do opracowania terapii opartych na agregacji tau. Do tej pory jednak testy agregacji tau wykorzystują rekombinowany lub syntetyczny tau, który jest pozbawiony śladów fosforylacji związanych z patologią. Tutaj opisujemy dwa testy, w których jako temat podawane jest rekombinowane, hiperfosforylowane tau. Testy te można zwiększyć w celu uzyskania wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować kinetykę lub stabilność hiperfosforylowanych agregatów tau. Nowatorskie metody leczenia choroby Alzheimera i innych tauopatii mogą zostać potencjalnie odkryte przy użyciu hiperfosforylowanych izoform tau.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera (AD) jest jednym z dużego zbioru zaburzeń neurodegeneracyjnych znanych jako tauopatie. Kwintesencją patologii leżącej u podstaw tauopatii są splątki neurofibrylarne, NFT, w neuronach, astrocytach i mikrogleju 1-4. Gęstość NFT koreluje z upośledzeniem funkcji poznawczych 3,5 i utratą neuronów 6. NFT zawiera głównie hiperfosforylowane białko tau (zwane dalej "p-tau"), które tworzy proste lub sparowane włókna spiralne (PHF) 7,8. Tau jest białkiem związanym z mikrotubulami, które ułatwia transport aksonalny, który jest niezbędny do sygnalizacji neuronalnej i transportu 9,10. Każda cząsteczka tau zawiera od 2 do 3 fosforanów w normalnym mózgu, ale zawartość fosforylu wzrasta kilkakrotnie u pacjentów z tauopatią. Wiele kinaz może przyczyniać się do hiperfosforylacji tau, w tym GSK3β (kinaza syntazy glikogenu 3β) i CDK5 (kinaza zależna od cykliny 5) 12,13, ale bezpośredni czynnik wywołujący patologiczną fosforylację pozostaje nieuchwytny 14. Nieprawidłowa fosforylacja w motywach wiążących mikrotubule lub w ich pobliżu dysocjuje tau od mikrotubuli 15 i powoduje błędną lokalizację tau w przedziale somatodendrytycznym, gdzie p-tau oligomeryzuje się w proste lub sparowane spiralne włókna, które mogą ostatecznie polimeryzować w inkluzje NFT. Ścisły związek między hiperfosforylacją tau, tworzeniem NFT i neurodegeneracją doprowadził do powszechnej hipotezy, że splątki p-tau wywołują apoptozę i inne reakcje cytotoksyczne, a zatem są podstawową przyczyną neurodegeneracji tauopatii 16,17. Uruchomiono badania przesiewowe leków i wczesne testy kliniczne oparte na tym założeniu 18 . Hipoteza ta napotyka jednak na wyzwania 19,20. Na przykład SantaCruz i in. wykazali, że funkcje poznawcze transgenicznych myszy można poprawić poprzez tłumienie ekspresji zmutowanego ludzkiego tau, mimo że NFT nadal tworzyły się z istniejących cząsteczek tau 21. W modelu Drosophila wykazano, że NFT sekwestruje toksyczne cytozolowe tau w celu ochrony leżących pod spodem komórek neuronalnych 22,23. Oczywiste jest, że rola patogenezy NFT, jeśli w ogóle będzie miała miejsce, będzie miała ogromny wpływ na kierunek rozwoju terapii tauopatycznych.

W wysokich stężeniach, rekombinowane lub normalne białko tau w mózgu spontanicznie, ale powoli polimeryzuje do struktury podobnej do PHF in vitro, na co wskazuje wiązanie kilku preferowanych przez arkusze β barwników fluorescencyjnych, mikroskopia elektronowa i spektroskopia rozpraszania światła 24-27. Dodanie heparyny lub kwasu arachidonowego, kwasu tłuszczowego występującego w dużych ilościach w ludzkim mózgu, drastycznie przyspiesza tworzenie PHF w sposób zależny od izoformy tau i stężenia induktora 28-32. Co ciekawe, hiperfosforylowane tau oczyszczone z mózgów AD lub przygotowane w wyczerpujących reakcjach fosforylacji in vitro agreguje szybciej i wydajniej 26,33-35. Wyniki te są doskonale zgodne z patologiczną rolą p-tau. System in vitro oparty na agregacji p-tau może zatem służyć jako potężne narzędzie do badań przesiewowych leków w kierunku choroby Alzheimera.

Biorąc pod uwagę ścisły związek między agregacją tau a postępującą neurodegeneracją AD, a także niedawne niepowodzenie w rozwoju leków ukierunkowanych na płytkę Aβ, kolejny kluczowy marker histologiczny AD 36-38, zainteresowanie odkrywaniem leków kontrolujących agregację tau rośnie. Rzeczywiście, kilka grup rozpoczęło już badania przesiewowe leków o różnej przepustowości, wykorzystując reakcje agregacji tau in vitro jako test podstawowy. Stwierdzono, że wiele substancji chemicznych wykazuje działanie hamujące lub odwracające agregację tau in vitro 39-42. Jednak wszystkie obecne badania przesiewowe regulatorów agregacji tau wykorzystują niezmodyfikowane tau, które pomija kluczowy patologiczny znak fosforylacji, co budzi obawy o specyficzność i skuteczność stosowania tych związków w leczeniu AD.

Jedną z głównych przeszkód w rozwoju testów agregacyjnych do charakterystyki biochemicznej i badań przesiewowych leków AD jest produkcja wystarczających ilości patoficzologicznie istotnego hiperfosforylowanego białka tau. Korzystając z systemu katalizy wspomaganego zamkami błyskawicznymi, w którym izoforma 1N4R tau i kinaza GSK-3β ulegają koekspresji w E. coli jako białka fuzyjne leucyny, pokonaliśmy to wyzwanie (Sui i wsp., przedłożone; patrz rysunek 1 dla końcowych produktów tau i p-tau; patrz również 43 dla wstępnej charakterystyki p-tau za pomocą spektrometrii mas). Z panelu dziewięciu przeciwciał specyficznych dla różnych miejsc fosforylacji tau, pozytywne sygnały zaobserwowano w ośmiu pozycjach (dane nie pokazane). Poniżej opisujemy protokoły i oprzyrządowanie, które mogą różnicować różnice kinetyczne agregacji między niezmodyfikowanymi gatunkami tau i p-tau. Testy te zostały zmodyfikowane na podstawie opublikowanych protokołów, które mierzyły wzrost fluorescencji tioflawiny T (ThT) lub tioflawiny S (ThS) po wiązaniu amyloidu (agregatów tau) 26. W pierwszym "końcowym", bezbarwnym podejściu, reakcje agregacji są łączone i inkubowane pod nieobecność barwnika amyloidowego. W różnych punktach czasowych podwielokrotność każdej reakcji jest usuwana i mieszana z równą objętością buforu zawierającego ThT, aby zatrzymać agregację i umożliwić ThT związanie agregatów tau. Fluorescencję mierzy się za pomocą fluorometru IAP FluoroMax-2. W drugim teście ciągłego monitorowania "z barwnikiem" ThT lub ThS jest uwzględniany w reakcjach agregacji. Fluorescencja może być mierzona w sposób ciągły przez cały czas trwania eksperymentu ręcznie lub za pomocą czytnika wielopłytkowego. Ponadto opisujemy test, który wykorzystuje bliskie fizjologicznemu stężeniu tau i p-tau do agregacji w trybie pomiaru ciągłego. Efekt fosforylacji pozostaje łatwo wykrywalny. Poniżej opiszemy procedury operacyjne krok po kroku i pokażemy reprezentatywne wyniki tych testów. Następnie omówione zostaną niektóre zalety i wady każdego podejścia, a także potencjalne zastosowania badań przesiewowych leków.

Przy wysokim stężeniu, tau spontanicznie agreguje się w struktury podobne do amyloidu. Jednak w laboratorium migotanie tau jest zwykle przyspieszane przez takie induktory, jak heparyna (średnia masa cząsteczkowa, 6,000 g/mol) i kwas arachidonowy. Przykłady przedstawione w niniejszym dokumencie obejmują heparynę 30 μM. Tworzenie agregatów amyloidu tau jest monitorowane przez fluorescencję wynikającą z wiązania amyloidu przez tioflawinę T (ThT) lub tioflawinę S (ThS). Po związaniu się z agregatami tau, ThT wykazuje przesunięcie ku czerwieni we fluorescencji (wzbudzenie: 450 nm; emisja szczytowa: 485 nm). Z drugiej strony ThS ma słabą emisję przy 510 nm (wzbudzenie przy 450 nm) przed wiązaniem amyloidu, ale ta fluorescencja znacznie wzrasta w obecności białka amyloidowego, takiego jak zagregowane tau 44. Oba barwniki dobrze sprawdzają się w wykrywaniu agregacji tau i p-tau. Ze względu na silny i stosunkowo szeroki pik emisyjny ThT (patrz rysunek 2), przy długości fali 510 nm następuje tylko 30% redukcja jednostki fluorescencji. Dla wygody używamy tej samej kombinacji długości fal wzbudzenia/emisji (tj. 450 nm/510 nm) do monitorowania agregacji tau podczas stosowania dowolnego barwnika.

Agregacja Tau może być przeprowadzona w obecności lub braku barwnika, w zależności od celu testu i dostępności białka tau. Oba tryby reakcji pokazano poniżej. Ponadto demonstrujemy działanie dwóch różnych przyrządów – fluorometru jednopróbkowego (ISA-SPEX FluoroMax-2) oraz czytnika wielopłytkowego (SpectraMax M2). Czytniki powinny być w stanie dostosować te protokoły do swoich konkretnych potrzeb i dostępności instrumentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować bufor agregacyjny (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Przechowywać w RT, stabilnie przez miesiące. Uzupełnij 1 mM ditiotreitol (DTT) przed użyciem.
    UWAGA: Bufor oparty na HEPES (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) również daje podobne wyniki w agregacji tau.
  2. Przygotować roztwór podstawowy tioflawiny T lub tioflawiny S (3 mM, rozpuszczony w buforze agregacyjnym) i przefiltrować przez sterylną jednostkę filtrującą 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze –20 °C w tubie pokrytej folią aluminiową, stabilnej przez wiele miesięcy.
  3. Przygotować podstawowy roztwór heparyny (300 μM, rozpuszczony w buforze agregacyjnym). Przechowywać w temperaturze –20 °C, stabilnie przez wiele miesięcy.
  4. Przygotować wywar z ditiotreitolu (DTT) (1 M, rozpuszczony w wodzie). Podwielokrotność rozlać na probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze –20 °C. Przed testami agregacji rozmrozić 1 M roztwór w temperaturze pokojowej. Z tego 1,000x zapasu przygotuj porcję 100 mM materiału roboczego z wodą dejonizowaną. Pozostaw na lodzie, aż będzie gotowy.
  5. Wyjmij tau z zamrażarki o temperaturze –80 °C. Rozmrozić na lodzie. Dostosuj tau do wcześniej określonego stężenia za pomocą buforu agregacyjnego. Wirować w mikrowirówce o sile 20 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wstępnie uformowanych dużych agregatów. Ten etap wstępnego wirowania zwiększa spójność w późniejszym pomiarze fluorescencji każdej partii preparatu białkowego. Przenieść supernatant do innej probówki; Pozostawić na lodzie do momentu, gdy będzie gotowa do złożenia reakcji agregacji.

2. Test końcowy bez barwnika

UWAGA: Reakcja agregacji tego testu odbywa się pod nieobecność barwnika fluorescencyjnego. Po wymieszaniu wszystkich składników reakcję pozwala się przeprowadzić do określonych punktów czasowych. Podwielokrotności są następnie wyjmowane z reakcji agregacji i mieszane z ThT lub ThS w celu wiązania amyloidu przed odczytem fluorescencji. Początkowa objętość reakcji agregacji zależy od liczby potrzebnych punktów czasowych. Takie podejście może wymagać dużej ilości białka tau, ale jest szybkie, proste i można je wykonać za pomocą fluorometru lub czytnika płytek wielodołkowych (patrz Dyskusja). Poniżej znajduje się operacja krok po kroku przy użyciu kompaktowego spektrofluorometru ISA SPEX FluoroMax-2 do ilościowego oznaczania fluorescencji.

  1. Umieścić mieszaninę agregacyjną w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml zgodnie z tabelą 1. Każda kolumna reprezentuje składniki potrzebne do reakcji 100 μl, co wystarcza na jeden pomiar punktu czasowego. Dostosuj ilość dla całej kombinacji agregacji na podstawie punktów czasowych potrzebnych do przeprowadzenia danego eksperymentu. Dodaj dodatkowe 10% każdego składnika, aby zrobić miejsce na błąd pipetowania. Pokazana tutaj typowa reakcja z udziałem heparyny może być zastąpiona kwasem arachidonowym lub buforem agregacyjnym. Dodać DTT do 1 mM do mieszaniny reakcyjnej. Jeśli cała reakcja trwa dłużej niż jeden dzień, codziennie uzupełniaj świeżą naziemną telewizję cyfrową (1 mM), aby zapewnić środowisko redukujące.
  2. Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać. Umieścić każdą reakcję w inkubatorze lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszanie nie jest potrzebne do agregacji tau.
  3. Przed pomiarem fluorescencji włącz spektrofluorometr (najpierw lampa, potem komputer).
    UWAGA: Ksenonowa lampa łukowa, której można użyć od razu. Jednak, aby uzyskać najlepsze wyniki, pozwól urządzeniu rozgrzać się przez około 10 minut przed odczytem fluorescencji.
  4. Uruchom oprogramowanie na komputerze.
    1. Wybierz tryb wyświetlania w czasie rzeczywistym w Centrum sterowania instrumentami, ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nm (szczelina do 2 nm) i długość fali emisji na 510 nm (szczelina na 5 nm). Zamknij okno trybu wyświetlania w czasie rzeczywistym, aby powrócić do Centrum sterowania instrumentami.
    2. Wybierz Analiza stałej długości fali, naciśnij przycisk Dodaj>> w górnej ramce, aby dodać zestawy długości fal. Ustaw parametry pobierania Błąd standardowy na 1 i Maksymalna liczba prób na 3, a następnie kliknij przycisk Dodaj. Kliknij przycisk Go!, aby otworzyć okno Data Display.
    3. W oknie Data Display (Wyświetlanie danych) kliknij przycisk Start Acq (Uruchom program Acq), aby otworzyć okno dialogowe New Sample (Nowa próbka). Wybierz "nieznany" dla typu próbki.
  5. Do każdych 100 μl mieszaniny agregacyjnej dodać 98 μl buforu agregacyjnego i 2 μl 3 mM tioflawiny T. Pipet kilkakrotnie w celu wymieszania.
  6. Przenieś całą mieszaninę do kuwety (FCA3, wymiar zewnętrzny, szer. x dł. x wys. = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Umieścić kuwetę w uchwycie na próbkę w komorze na próbkę i zamknąć pokrywę. Kliknij przycisk Uruchom, aby zebrać dane dotyczące fluorescencji. Zapisz dane.
  7. Wyjmij kuwetę i zdekantuj roztwór. Opłucz kuwetę wodą destylowaną 3 razy. Wysuszyć, wdmuchując powietrze do i na zewnątrz kuwety.

3. Test w trybie ciągłym z barwnikiem na czytniku płytek SpectraMax M2

UWAGA: Ten test różni się od poprzedniego tym, że barwnik fluorescencyjny ThT lub ThS jest zawarty w reakcji agregacji. Pozwala to na ciągły pomiar tego samego zestawu reakcji. Ze względu na powtarzające się stosowanie reakcji, metoda ta jest lepiej wykonywana za pomocą automatycznego czytnika płytek wielodołkowych (jak pokazano poniżej działanie SpectraMax M2). Zwykły fluorometr również działa, ale częstotliwość pomiaru reakcji szybkiej agregacji jest nieco ograniczona, ze względu na ręczny charakter operacji.

  1. Umieścić mieszaninę agregacyjną na 96-dołkowej płytce (96-dołkowa stała płytka, objętość studzienki 360 μl, płaskie dno), jak w tabeli 2. Każda kolumna reprezentuje składniki potrzebne do reakcji 200 μl, co wystarcza na jeden pomiar punktu czasowego. Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie pipetując. Uzupełniaj świeżą naziemną telewizję cyfrową 1mM codziennie przez cały czas trwania eksperymentów.
  2. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C.
  3. W każdym punkcie czasowym przed pomiarem fluorescencji włącz wielomodowy czytnik mikropłytek i komputer. Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby maszyna się ustabilizowała, około 10 minut.
  4. Uruchom oprogramowanie na komputerze. Ustaw temperaturę na 37 °C i wybierz tryb intensywności fluorescencji (FI-Top Read), ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nm i długość fali emisji na 510 nm.
  5. Włóż 96-dołkową płytkę do szuflady i naciśnij READ, aby rozpocząć pomiar.
  6. Po odczytaniu odczytu wyjąć płytkę i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Skopiuj dane i wklej je do arkusza kalkulacyjnego Excel w celu analizy danych i wykreślenia.

4. Test z barwnikiem, tryb ciągły na kompaktowym spektrofluorometrze

  1. Umieścić mieszaninę agregacyjną w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml, jak pokazano w Tabeli 3. Każda kolumna reprezentuje składniki potrzebne do reakcji 200 μl, co wystarcza na jeden pomiar punktu czasowego.
  2. Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać.
  3. Włącz spektrofluorometr i ustaw oprogramowanie jak w krokach 2.3 i 2.4.
  4. Przenieś całą mieszaninę do kuwety. Umieścić kuwetę w uchwycie na próbkę w komorze na próbkę i zamknąć pokrywę. Kliknij przycisk Uruchom, aby zebrać dane dotyczące fluorescencji. Zapisz dane.
  5. Kontynuuj czytanie w odpowiednich odstępach czasu, klikając przycisk Uruchom i rejestrując dane. Jeśli agregacja ma być monitorowana z wysoką częstotliwością (np. co 30 lub 60 sekund), należy pozostawić reakcję w kuwecie i w maszynie do czasu zakończenia pomiaru lub gdy jest wystarczająco dużo czasu na wymianę reakcji lub kuwet.
  6. Wyjmij kuwetę i zdekantuj roztwór. Opłucz kuwetę wodą destylowaną 3 razy. Wysuszyć, wdmuchując powietrze do i na zewnątrz kuwety.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używając rekombinowanego tau i p-tau (Rysunek 1), ustaliliśmy dwa różne protokoły do porównania kinetyki agregacji tau i p-tau, wykorzystując silną emisję fluorescencji ThT i ThS podczas wiązania z agregatami białek amyloidowych, w tym tau i p-tau (Rysunek 2). Z barwnikiem fluorescencyjnym w reakcji agregacji lub bez niego, zaobserwowaliśmy konsekwentne zwiększanie agregacji tau przez hiperfosforylację (ryc. 3-5). Stymulacja ta jest niezależna od heparyny (dane nie pokaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten demonstruje różne warunki testowe i instrumenty, które wykrywają zależną od fosforylacji kinetykę szybkiej agregacji tau. W teście końcowym barwnik fluorescencyjny ThT dodaje się do części reakcji usuniętej z mieszanki wzorcowej w każdym punkcie czasowym. Następnie mierzy się fluorescencję indukowaną wiązaniem amyloidu 26. W drugim, z trybem barwnikowym, agregacja tau odbywa się w obecności ThT lub ThS, co sprawia, że ten rodzaj reakcji nadaje się do automatycznej oceny wzrostu agregatów tau w cza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institute on Aging (AG039768) dla MHK. Dziękujemy doktorom Thomasowi Sharkeyowi i Honggao Yanowi za hojne dostarczenie instrumentów, a także Seanowi Weise'owi i Yan Wu za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trizma  podstawaSigmaT1503
NaClMacron Fine ChemicalsMAL-7581-06
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Invitrogen15576-028
Tioflawina TSigmaT3516Przechowywana w ciemnej
Tioflavinie SSigmaT1892Przechowywana w ciemnej
heparynieSigmaH3393
DL-Ditiothreitol (DTT)SigmaD9779Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C
96-dołkowa płytkaCorning3917
ISA SPEX FluoroMax-2Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate ReaderUrządzenia
Mysz Przeciwciało monoklonalne anty-TauR& Systemy DMAB3494przechowywane w – 80 stopni Celsjusza; Z
molekularne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 24, 1121-1159 (2001).
  2. Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 (2007).
  3. Arriagada, P. V., Marzloff, K., Hyman, B. T. Distribution of Alzheimer-type pathologic changes in nondemented elderly individuals matches the pattern in Alzheimer's disease. Neurology. 42 (9), 1681-1688 (1992).
  4. Arriagada, P. V., Growdon, J. H., Hedley-Whyte, E. T., Hyman, B. T. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer's disease. Neurology. 42 (3 Pt 1), 631-639 (1992).
  5. Bancher, C., Braak, H., Fischer, P., Jellinger, K. A. Neuropathological staging of Alzheimer lesions and intellectual status in Alzheimer's and Parkinson's disease patients. Neurosci Lett. 162 (1-2), 179-182 (1993).
  6. Guillozet, A. L., Weintraub, S., Mash, D. C., Mesulam, M. M. Neurofibrillary tangles, amyloid, and memory in aging and mild cognitive impairment. Arch Neurol. 60 (5), 729-736 (2003).
  7. Hasegawa, M., et al. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J Biol Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  8. Matsuo, E. S., et al. Biopsy-derived adult human brain tau is phosphorylated at many of the same sites as Alzheimer's disease paired helical filament tau. Neuron. 13 (4), 989-1002 (1994).
  9. Bamburg, J. R., Bloom, G. S. Cytoskeletal pathologies of Alzheimer disease. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (8), 635-649 (2009).
  10. Denk, F., Wade-Martins, R. Knock-out and transgenic mouse models of tauopathies. Neurobiol Aging. 30 (1), 1-13 (2009).
  11. Gong, C. X., Iqbal, K. Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau: a promising therapeutic target for Alzheimer disease. Curr Med Chem. 15 (23), 2321-2328 (2008).
  12. Mazanetz, M. P., Fischer, P. M. Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 464-479 (2007).
  13. Brunden, K. R., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer's disease and related tauopathies. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 783-793 (2009).
  14. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  15. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33 (1), 95-130 (2000).
  16. Lee, V. M., Brunden, K. R., Hutton, M., Trojanowski, J. Q. Developing therapeutic approaches to tau, selected kinases, and related neuronal protein targets. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006437(2011).
  17. Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Biochemistry and cell biology of tau protein in neurofibrillary degeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006247(2012).
  18. Bulic, B., Pickhardt, M., Mandelkow, E. Progress and Developments in Tau Aggregation Inhibitors for Alzheimer Disease. J Med Chem. 56 (11), 4135-4155 (2013).
  19. Cowan, C. M., Quraishe, S., Mudher, A. What is the pathological significance of tau oligomers. Biochem Soc Trans. 40 (4), 693-697 (2012).
  20. Spires-Jones, T. L., Kopeikina, K. J., Koffie, R. M., de Calignon, A., Hyman, B. T. Are tangles as toxic as they look. J Mol Neurosci. 45 (3), 438-444 (2011).
  21. SantaCruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
  22. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293 (5530), 711-714 (2001).
  23. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  24. Wille, H., Drewes, G., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro. J Cell Biol. 118 (3), 573-584 (1992).
  25. Alonso, A., Zaidi, T., Novak, M., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6923-6928 (2001).
  26. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  27. Wilson, D. M., Binder, L. I. Polymerization of microtubule-associated protein tau under near-physiological conditions. J Biol Chem. 270 (41), 24306-24314 (1995).
  28. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  29. Perez, M., Valpuesta, J. M., Medina, M., Montejo de Garcini, E., Avila, J. Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction. J Neurochem. 67 (3), 1183-1190 (1996).
  30. Carlson, S. W., et al. A complex mechanism for inducer mediated tau polymerization. Biochemistry. 46 (30), 8838-8849 (2007).
  31. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  32. King, M. E., Gamblin, T. C., Kuret, J., Binder, L. I. Differential assembly of human tau isoforms in the presence of arachidonic acid. J Neurochem. 74 (4), 1749-1757 (2000).
  33. Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pseudo-phosphorylation of tau at Ser202 and Thr205 affects tau filament formation. Brain Res Mol Brain Res. 138 (1), 84-93 (2005).
  34. Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pre-assembled tau filaments phosphorylated by GSK-3b form large tangle-like structures. Neurobiol Dis. 31 (3), 368-377 (2008).
  35. Grundke-Iqbal, I., et al. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  36. Castellani, R. J., Perry, G. Pathogenesis and disease-modifying therapy in Alzheimer's disease: the flat line of progress. Arch Med Res. 43 (8), 694-698 (2012).
  37. Green, R. C., et al. Effect of tarenflurbil on cognitive decline and activities of daily living in patients with mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA. 302 (23), 2557-2564 (2009).
  38. Gauthier, S., et al. Effect of tramiprosate in patients with mild-to-moderate Alzheimer's disease: exploratory analyses of the MRI sub-group of the Alphase study. J Nutr Health Aging. 13 (6), 550-557 (2009).
  39. Pickhardt, M., et al. Anthraquinones inhibit tau aggregation and dissolve Alzheimer's paired helical filaments in vitro and in cells. J Biol Chem. 280 (5), 3628-3635 (2005).
  40. Crowe, A., Ballatore, C., Hyde, E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. High throughput screening for small molecule inhibitors of heparin-induced tau fibril formation. Biochem Biophys Res Commun. 358 (1), 1-6 (2007).
  41. Taniguchi, S., et al. Inhibition of heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J Biol Chem. 280 (9), 7614-7623 (2005).
  42. Sigurdsson, E. M. Tau-focused immunotherapy for Alzheimer's disease and related tauopathies. Curr Alzheimer Res. 6 (5), 446-450 (2009).
  43. Tan, Y. J., et al. Phosphopeptide Enrichment with TiO-Modified Membranes and Investigation of Tau Protein Phosphorylation. Anal Chem. 85 (12), 5699-5706 (2013).
  44. Santa-Maria, I., Perez, M., Hernandez, F., Avila, J., Moreno, F. J. Characteristics of the binding of thioflavin S to tau paired helical filaments. J Alzheimers Dis. 9 (3), 279-285 (2006).
  45. Lira-De Leon, K. I., et al. Molecular mechanism of tau aggregation induced by anionic and cationic dyes. J Alzheimers Dis. 35 (2), 319-334 (2013).
  46. DiNitto, J. P., Wang, L., Wu, J. C. Continuous fluorescence-based method for assessing dicer cleavage efficiency reveals 3' overhang nucleotide preference. BioTechniques. 48, 303-311 (2010).
  47. Maeda, S., et al. Granular tau oligomers as intermediates of tau filaments. Biochemistry. 46 (12), 3856-3861 (2007).
  48. Pickhardt, M., et al. Phenylthiazolyl-hydrazide and its derivatives are potent inhibitors of tau aggregation and toxicity in vitro and in cells. Biochemistry. 46 (35), 10016-10023 (2007).
  49. Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology. Mol Neurodegener. 2, 12(2007).
  50. McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
  51. Herrup, K. Reimagining Alzheimer's disease--an age-based hypothesis. J Neurosci. 30 (50), 16755-16762 (2010).
  52. Gavett, B. E., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: a potential late effect of sport-related concussive and subconcussive head trauma. Clin Sports Med. 30 (1), 179-188 (2011).
  53. Tsitsopoulos, P. P., Marklund, N. Amyloid-beta Peptides and Tau Protein as Biomarkers in Cerebrospinal and Interstitial Fluid Following Traumatic Brain Injury: A Review of Experimental and Clinical Studies. Front Neurol. 4, 79(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Agregacja bia ka tautioflawina Stioflawina Ttest fluorescencjikinetyka agregacjitest in vitrofosforylacja bia ekschorzenia neurodegeneracyjnechoroba Alzheimera

Powiązane artykuły