Metody in vitro Model hodowli komórkowej do badań toksycznych substancji chemicznych wdychanych

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie metody ekspozycji kultur komórkowych na wdychane toksyczne chemikalia. Narażenie zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz (ALI) komórek nabłonka dróg oddechowych zapewnia unikalny model narażenia dróg oddechowych na toksyczne gazy, takie jak chlor. W niniejszej pracy opisano wpływ ekspozycji na chlor na hodowle komórek nabłonka i zanurzonych kultur kardiomiocytów na granicy faz powietrze-ciecz. Systemy ekspozycji in vitro umożliwiają przeprowadzenie ważnych badań mechanistycznych w celu oceny szlaków, które można następnie wykorzystać do opracowania nowych środków terapeutycznych.

Streszczenie

Hodowle komórkowe są niezbędne do opracowania i zbadania skuteczności środków terapeutycznych, przed ich użyciem w modelach zwierzęcych. Posiadamy unikalną zdolność do modelowania dobrze zróżnicowanych komórek ludzkiego nabłonka dróg oddechowych i mięśnia sercowego. Może to być nieocenione narzędzie do badania szkodliwych skutków toksycznych wdychanych substancji chemicznych, takich jak chlor, które normalnie mogą wchodzić w interakcje z powierzchnią komórek i tworzyć różne produkty uboczne w reakcji z wodą i ograniczać ich skutki w zanurzonych kulturach. Nasz model wykorzystujący dobrze zróżnicowane hodowle komórek nabłonka ludzkich dróg oddechowych na granicy powietrze-płyn omija to ograniczenie, a także daje możliwość oceny krytycznych mechanizmów toksyczności potencjalnie trujących wdychanych substancji chemicznych. Opisujemy zwiększoną utratę integralności błony, uwalnianie kaspazy i śmierć po toksycznym wdychanym substancjach chemicznych, takich jak narażenie na chlor. W tym artykule proponujemy metody modelowania ekspozycji na chlor w komórkach nabłonka serca i dróg oddechowych ssaków w hodowli oraz proste testy oceniające jego wpływ na te typy komórek.

Wprowadzenie

Narażenie na toksyczne wdychane chemikalia (TIC)/gazy, takie jak chlor (Cl₂), pozostaje ciągłym problemem zdrowotnym w przypadku przypadkowych ekspozycji, jak również w ich potencjalnym użyciu jako czynnika zagrożenia chemicznego. Chociaż płuca są głównym celem, narządy takie jak serce i mózg są również dotknięte^1-3. Modele in vivo są zazwyczaj stosowane do badania toksyczności spowodowanych przez TIC, ale testy in vitro do oceny toksyczności są prostsze, szybsze i bardziej opłacalne. Modele in vitro pozwalają również na szeroko zakrojone badania interakcji czynnik-komórka, które mogą być trudne do oceny in vivo. Takie systemy ekspozycji in vitro są rzadkie, a ponadto w niektórych konwencjonalnych modelach, w których czynniki toksyczne są dodawane do pożywki, w której zanurzone są komórki, właściwości czynników mogą się zmieniać w wyniku interakcji i wiązania się ze składnikami pożywki. W takich scenariuszach obiecujące mogą być systemy hodowli komórkowych, takie jak hodowle na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) pierwotnych komórek nabłonka ludzkich dróg oddechowych, które mogą być bezpośrednio narażone na działanie czynników gazowych.

Komórki nabłonkowe wyściełające drogi oddechowe są pierwszą linią obrony przed wdychanymi toksycznymi substancjami chemicznymi. Ludzki nabłonek dróg oddechowych tworzy fizyczną barierę między światłem a leżącymi poniżej komórkami w płucach i uczestniczy w odpowiedzi płuc. Wytwarza szereg cytokin i innych czynników pro- i przeciwzapalnych, a także wydziela śluz/płyn powierzchniowy dróg oddechowych (ASL) pokrywający nabłonek. Jednym z ograniczeń konwencjonalnych zanurzonych systemów hodowli in vitro jest również to, że ASL i śluz pokrywający powierzchnię nabłonka są usuwane lub rozcieńczane. Nie odzwierciedla to stanu fizjologicznego komórek nabłonka płuc, które są wystawione na działanie powietrza. W związku z tym idealny system in vitro do badania toksyczności TIC powinien odzwierciedlać tę architekturę. Istnieje duże zainteresowanie opracowywaniem szybkich metod badań przesiewowych, które przewidują toksyczność in vivo. Komórki nabłonkowe wyhodowane w ALI różnicują się i mają dobrze zróżnicowane struktury i funkcje w porównaniu z komórkami hodowanymi w zanurzeniu i służą lepszemu modelowi dróg oddechowych.

W tym badaniu opisujemy użycie hodowli interfejsu powietrze-ciecz ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych (tchawiczo-oskrzelowych) do testowania toksyczności trującego wdychanego gazu i porównujemy go z zanurzoną hodowlą komórkową kardiomiocytów, badając w ten sposób kolejny ważny cel toksyczności.

Protokół

1. Hodowle kardiomiocytów szczurów

1. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, IACUC.
2. Uzyskać kardiomiocyty szczurów z serc (komór) samców szczurów (240-260 g) metodami opisanymi wcześniej⁴. Krótko mówiąc, znieczulić zwierzęta za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu (100 mg/kg; potwierdzić znieczulenie metodą szczypania palców u stóp), a następnie usunąć serca do 10,0 ml, 1 mM Ca²⁺ zawierającego bufor Krebsa Ringera, pH 7,4.
3. Opłucz serca 5-6 razy, aby usunąć krew, a następnie zmień na wolny od Ca²⁺ bufor Pierścienia Krebsa zawierający 0,02% proteazy i 0,06% kolagenazy A (5,0 ml / serce). Inkubować serca w tym roztworze przez 10-15 minut w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu wstrząsając.
4. Po 10-15 minutach przepłukać roztwór enzymatyczny buforem Krebsa wolnym od^Ca2+ przez dodatkowe 5 minut. Uwolnić komórki z wiotkiej tkanki za pomocą pipety o pojemności 25 ml, kilkakrotnie pipetując zawiesinę w górę i w dół.
5. Oddziel komórki od tkanki, filtrując przez nylonową siatkę o grubości 70 μm i pozwól im osiąść w buforze Krebs Ringer zawierającym 0,1 mM Ca²⁺. Zawiesić osad komórkowy w 1,0 ml buforze Krebs Ringer zawierającym 0,2 mM Ca²⁺.
6. Ostrożnie nałożyć 5,0 ml albuminy surowicy bydlęcej o stężeniu 60 μg/ml (BSA) w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml, aby oddzielić kardiomiocyty od niemiocytów i pozostawić je na 30 minut. Kardiomiocyty są cięższe i przemieszczają się na dno rurki. Ostrożnie usunąć sklarowane komórki i pożywkę. Powtórz ten krok raz, aby jeszcze bardziej oczyścić komórki.
7. Stopniowo przemywać (etapami przy użyciu buforu zawierającego 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM i 1,0 mM Ca²⁺) miocyty komorowe/kardiomiocyty do buforu zawierającego 1,0 mM Ca²⁺ i ponownie zawiesić w pożywce ACCT składającej się ze zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco, DMEM zawierającego 2 mg/ml BSA, 2 mM L-karnityny, 5 mM kreatyny, 5 mM tauryny, 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
8. Płytki kardiomiocytów w pożywce ACCT o gęstości od 100 do 150 komórek/^mm2 na plastikowych szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm lub 35 mm pokrytych lamininą lub szklanych szkiełkach nakrywkowych o wymiarach 40 x 22 mm wstępnie pokrytych lamininą (1 μg/^cm2). Po 1 godzinie umyj naczynia 2,0 ml ACCT, aby usunąć komórki, które nie są przyczepione. Dodać 10,0 ml świeżej pożywki i inkubować komórki.

2. Zróżnicowany interfejs powietrze-ciecz (ALI) Hodowla ludzkich komórek podstawnych nabłonka dróg oddechowych

1. Kupuj ludzkie tkanki tchawicy i oskrzeli z National Disease Research Interchange zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Review Board. Pobranie komórek i przeprowadzenie hodowli z zastosowaniem opublikowanej procedury^5,6. W tej procedurze wykorzystuje się hodowle komórkowe, ponieważ są one precyzyjnym modelem narażenia ludzi przez drogi oddechowe na TIC, jednak w razie potrzeby można je wyizolować i wyhodować w komórkach nabłonka dróg oddechowych myszy i/lub szczura^{ALI 7,8}.
2. Krótko mówiąc, zrób małe kawałki (~ 1/4 cala) tkanki po usunięciu całej tkanki łącznej i węzłów chłonnych. Umyj tkankę kilka razy w roztworze Ringera z mleczanami. Dodać tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać roztwór proteazy (1% proteazy/0,01% DNazy w minimalnych niezbędnych podłożach, MEM, stosunek tkanki do płynu (1:10)).
3. Kołysz chusteczką w temperaturze 4 °C przez noc. Zakończ dysocjację tkanki, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej. Zeskrobać powierzchnię nabłonka skalpelem chirurgicznym i zebrać komórki przez odwirowanie (2 000 obr./min przez 10 min).
4. Komórki płytki w pasażu pierwszym na zatrzaskach pokrytych kolagenem w specjalnym pożywce ALI przygotowanym zgodnie ze szczegółowym opisem Fulchera i wsp. ⁹. Hodowla przez 5 dni przed zmianą na granicę faz powietrze-ciecz (ALI) poprzez usunięcie pożywki wierzchołkowej.
5. Karmić komórki za pomocą pożywki ALI co drugi dzień i pozwolić komórkom różnicować się przez dodatkowe 2-3 tygodnie (obserwuj liczne rzęski bijące i wydzielanie śluzu) przed wykonaniem ekspozycji. Umyj powierzchnię wierzchołkową ciepłym PBS wraz z wymianą podłoża.

3. Narażenie na chlor

1. Umieścić system ekspozycji na chlor (CES) w kwalifikowanym okapie chemicznym o prędkości operacyjnej 100 fpm, który zapewnia niezbędną wtórną hermetyzację, aby zapobiec narażeniu personelu w przypadku przypadkowych wycieków chloru.
2. Eksploatuj system pod niewielkim nadciśnieniem (0.5 cala wody). Suche powietrze jest podawane z prędkością 15 l/min i podawany jest odpowiedni poziom chloru, aby osiągnąć pożądane końcowe stężenie chloru. Komory posiadają zamykaną pokrywę z 4 zamkami mini BCU i silikonową uszczelką o niskiej twardości, która zapewnia uszczelnienie ciśnieniowe.
3. Dostarczyć mieszaninę Cl₂ przez regulator przepływu masowego. CES wykorzystuje butlę ze sprężonym gazem zawierającą 1,0% Cl₂ w suchym azocie.
4. Reguluj przepływ powietrza rozcieńczającego za pomocą specjalnie zaprojektowanego panelu sterowania i podobnie reguluj stężenie Cl₂ dostarczanego do komór ekspozycyjnych. Pompa do pobierania próbek o małej objętości wciąga spaliny z komór do analizatora chloru w celu monitorowania stężeń, które są następnie rejestrowane w rejestratorze danych podłączonym do analizatora.
5. Zmierz natężenia przepływu w komorach przed ekspozycją za pomocą przepływomierza, aby zapewnić równe natężenie przepływu i spalin.
6. Przygotować hodowle komórkowe do ekspozycji, usuwając pożywkę sklarowaną nad osadem i dodając świeżą pożywkę (pożywki podstawno-boczne w hodowlach ALI). W tym czasie można wykonać wszelkie zabiegi wstępne za pomocą środków.
7. Wystawić hodowle ALI komórek nabłonka dróg oddechowych na działanie gazu Cl₂ (50, 100 lub 300 ppm przez 30 minut) w dwóch szczelnych komorach bioizolacyjnych polisulfonów. Kardiomiocyty (zanurzone lub zlewające się kultury na błonach) są wystawione na działanie 50 lub 100 ppm Cl₂ przez 15 minut.
8. Po ekspozycji przepłukać komory powietrzem, aż poziom Cl₂ spadnie poniżej 1 ppm i będzie można go bezpiecznie otworzyć w celu usunięcia komórek (w ciągu 5 minut).

4. Pomiar transepitelialnego oporu elektrycznego (TER)

1. Zmierz TER kultur powietrze-ciecz-granica, ALI, za pomocą woltoomomierza nabłonkowego z parą elektrod "pałeczkowych" chlorku srebra.
2. Zrównoważyć elektrodę pałeczki w pożywce ALI 15 minut przed użyciem.
3. Dodać ciepłą pożywkę do powierzchni wierzchołkowej (1,0 ml) i podstawno-bocznej (2,0 ml) i zmierzyć TER za pomocą elektrod pałeczek woltoomomierza.
4. Zanurz krótsze ramię elektrody w ośrodku wierzchołkowym, a dłuższe ramię w ośrodku podstawno-bocznym. Kliknij przycisk "zmierz" na woltoomomierzu, aby ocenić opór elektryczny.
5. Woltomierz ma możliwość pomiaru omów lub k omów. Odejmij oporność na podłożu hodowli bezkomórkowej od odporności mierzonej na każdej warstwie komórki, aby uzyskać oporność przeznabłonkową (TER).

5. Pomiar kaspazy

1. Po ekspozycji dodać świeżą pożywkę ALI (2,0 ml) do powierzchni podstawno-bocznej i inkubować komórkę w temperaturze pokojowej. Zebrać pożywki sklarowane nad osadem po 4 i 24 godzinach.
2. Zmierz aktywność kaspazy 3/7 w supernatantach pożywki za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania kaspazy 3/7.

6. Western Blot i immunocytochemia

1. Wykonaj western blot przy użyciu lizatów komórkowych, jak opisano wcześniej¹⁰. Zawiesić lizat białkowy (20 μg) w 5-krotnie zredukowanym buforze próbki i gotować przez 5 minut. Poddaj lizat białkowy SDS-PAGE (4-15%) i przenieś oddzielone białka do membrany nitrocelulozowej za pomocą elektroforetycznego blottingu.
2. Zablokować niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację błony z 5% mlekiem w buforze do przemywania (PBS + 0,1% detergentu) i zbadać błony pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko SERCA2 lub aktynie sarkomerowej w rozcieńczeniu 1:1 000, przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj i inkubuj błony z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą i rozwiń do wykrywania, jak opisano wcześniej¹⁰, używając dostępnego w handlu zestawu do wykrywania peroksydazy.
3. Do celów immunocytochemicznych żywe komórki wyhodowane na wkładkach lub szklanych szkiełkach nakrywkowych na płytkach 6-dołkowych należy traktować 0,4% Triton-X-100 w 10 mM buforze cytrynianu sodu przez 20 minut po spłukaniu PBS.
4. Zablokuj niespecyficzne wiązanie, traktując komórki 5% surowicą osła przez 20 minut, a następnie inkubuj komórki z niespecyficznymi IgG lub indywidualnymi przeciwciałami pierwszorzędowymi specyficznymi dla aktyny sarkomerowej lub Ki-67.
5. Przemyć komórki PBS i inkubować z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi w celu wykrycia przeciwciała pierwszorzędowego i barwienia jądrowego (1 μg/ml DAPI).
6. Umyć PBS i zamontować szkiełka nakrywkowe za pomocą dostępnych na rynku nośników montażowych.
7. Wizualizuj barwienie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Wyniki

Pierwotne pręcikowate kardiomiocyty przytwierdzają się do matryc lamininy, rozprzestrzeniają i różnicują w kultury konfluentne (Rycina 1A oraz jej powiększenie). Komórki te zostały dodatkowo scharakteryzowane na podstawie ekspresji aktyny sarkomerowej oraz SERCA2 (Ryciny 1B i 1C). Kardiomiocyty szczura są bardzo podatne na toksyczność chloru, ponieważ 15 min ekspozycji na 100 ppm chloru spowodowało rozległe zaokrąglenie i śmierć komórek w kulturach zanurzonych oraz przer...

Dyskusja

Najczęstszy rodzaj ostrej toksyczności występuje, gdy wdycha się trującą substancję chemiczną do płuc. Te substancje chemiczne mogą być również szybko wchłaniane do krwiobiegu i mogą wpływać na inne narządy, takie jak mózg i serce. Toksyczność inhalacyjna różnych czynników wykorzystujących modele zwierzęce jest szeroko badana i opisywana, jednak mechanizmy są mniej poznane. Jest to główna przeszkoda w opracowywaniu skutecznych terapii. Brak systemów ekspozycji in vitro jest główną przyczyną braku wglądu mechanis...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczury	Harlan Laboratories	Sprague-Dawley
Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Chlorine	AirGas, Inc	X02NI99CP163LS1
zestaw kaspazy 3/7	Promega	G8091
Woltoomomierz nabłonkowy i elektroda pałeczka	World Precision Instruments	EVOM i STX2
Wkładki Snapwell	Corning	07-200-708
Sitko do komórek nylonowych 70 mikronów	Corning	#352360
Komory bioizolacyjne polisulfonowe	BCU, Allentown Cage Equipment BCU
DMEM	Life technologies	12491-015
Przeciwciało sarkomeryczne aktyny	Abcam Cambridge, MA	ab28052
Przeciwciało SERCA2	Bioodczynniki powinowactwa, złote, CO	MA3-9191
Przeciwciało Ki-67	Dako, Carpinteria, CA	M7248
Przeciwciało drugorzędowe sprzężone Alexa 488	Invitrogen, Grand Island, Nowy Jork	A11029
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Karnityna	Sigma-Aldrich	C0283
Tauryna	Sigma-Aldrich	T8691
Kreatynina	Sigma-Aldrich	C6257
Bufor Dzwonka Krebsa	Proteaza Sigma-Aldrich	K4002
	Sigma-Aldrich	P5147
Kolagenaza	Sigma-Aldrich	C6885
DNAaza	Sigma-Aldrich	DN-25
Mleczanowy roztwór Ringera	Abott Laboratories	7953
Surowica osła	Fisher Scientific	017-000-001
PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	D1408
4-15% żele SDS-PAGE	Bio-Rad	456-1083
Membrana nitrocelulozowa	Bio-Rad	162-0115
Dergent, Tween	Sigma-Aldrich	P1379
Zestaw do wykrywania peroksydazy	Pierce	3402
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Podłoże montażowe, Fluormount G	eBiosciences	00-4958-02
Cytrynian sodu	Sigma-Aldrich	71497
Kolagen	Sigma-Aldrich	C7521
MEM	Sigma-Aldrich	M8028
Laminin	BD nauki biologiczne	354259
Penicylina/streptomycyna	Technologie życia	15070063
FBS	Gibco	200-6140AJ