PCR za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego DNA flankującego

Summary

Linear-amplifikacja (LAM)-PCR to metoda opracowana w celu określenia dokładnych pozycji integracji wektorów wirusowych w genomie. Technika ta ewoluowała, aby stać się lepszą metodą badania dynamiki klonalnej u pacjentów z terapią genową, bezpieczeństwa biologicznego nowych technologii wektorowych, różnorodności komórek T, modeli rakowych komórek macierzystych itp.

Abstract

Linear-amplifikacyjny PCR (LAM-PCR) został opracowany do badania hematopoezy w genach skorygowanych komórek pacjentów leczonych terapią genową z integrującymi systemami wektorowymi. Ze względu na stabilną integrację wektorów retrowirusowych, miejsca integracji mogą być wykorzystywane do badania losów klonalnych poszczególnych komórek i ich potomstwa. LAM-PCR po raz pierwszy dostarczył dowodów na to, że białaczka u pacjentów leczonych terapią genową wywodzi się z nadekspresji sąsiedniego protoonkogenu wywołanej przez prowirusy. Wysoka czułość i swoistość LAM-PCR w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak odwrócony PCR i PCR za pośrednictwem ligacji (LM)-PCR, osiąga się poprzez początkowy etap preamplifikacji (liniowy PCR 100 cykli) przy użyciu biotynylowanych starterów specyficznych dla wektorów, które umożliwiają przeprowadzanie kolejnych etapów reakcji w fazie stałej (kulki magnetyczne). LAM-PCR jest obecnie najbardziej czułą dostępną metodą identyfikacji nieznanego DNA, które znajduje się w pobliżu znanego DNA. Niedawno opracowano wariant LAM-PCR, który omija trawienie restrykcyjne, eliminując w ten sposób błąd wyszukiwania miejsc integracji i umożliwia kompleksową analizę lokalizacji prowirusów w genomach gospodarza. Poniższy protokół wyjaśnia krok po kroku amplifikację sekwencji 3', jak i 5'- sąsiadujących ze zintegrowanym wektorem lentiwirusowym.

Introduction

Linear-amplifikacyjny PCR (LAM-PCR) pozwala zidentyfikować i scharakteryzować nieznane DNA flankujące sąsiadujące ze znanym DNA dowolnego pochodzenia. Dokładniej mówiąc, LAM-PCR został opracowany w celu lokalizacji miejsc integracji wektorów wirusowych (IS) w genomie gospodarza^1,2. Elementy genetyczne, takie jak retrowirusy lub transpozony, integrują swój genom z genomem gospodarza w sposób (pół) losowy^3-6. W wielu przypadkach decydujące znaczenie ma dokładna znajomość pozycji, w której te wektory się całkują. Udowodniono, że LAM-PCR jest lepszy od alternatywnych technik, takich jak PCR⁷ i jego warianty za pośrednictwem ligacji lub odwrócony PCR⁸. Czułość i solidność tej metody wynika ze wstępnej amplifikacji połączeń wektor-genom i selekcji magnetycznej amplifikowanych produktów PCR. Podobnie jak wspomniane metody alternatywne, LAM-PCR opiera się na użyciu enzymów restrykcyjnych, wprowadzając błąd systematyczny w zdolności wyszukiwania IS^9-11. W związku z tym tylko podzbiór repertuaru IS (integrom) może być wykryty w jednej reakcji. Błąd ten jest minimalizowany przez równoległą analizę danej próbki przy użyciu optymalnych kombinacji enzymów restrykcyjnych⁹. Ostatnio opracowano wariant technologii określany jako nierestrykcyjny LAM-PCR (nrLAM-PCR), który omija stosowanie enzymów restrykcyjnych i umożliwia bezstronną analizę całego genomu próbki w pojedynczej reakcji^9,12.

W przeszłości LAM-PCR był używany do identyfikacji przyczynowego retrowirusowego IS powodującego białaczkę u kilku pacjentów w klinicznych badaniach klinicznych terapii genowej^13-15. Od tego czasu LAM-PCR został przystosowany do identyfikacji IS od innych wektorów integrujących (wektory lentiwirusowe, transpozony), a także do identyfikacji wzorców integracji wektorów pasywnie integrujących, takich jak wektory związane z adenowirusem (AAV) lub wektory lentiwirusowe z wadą integrazy (IDLV)^16-21. Zastosowania LAM-PCR są szeroko rozpowszechnione: tradycyjnie technika ta jest szeroko stosowana do badania składu klonalnego komórek zmodyfikowanych genowo u pacjentów, którzy przeszli terapię genową lub do oceny bezpieczeństwa biologicznego nowych systemów wektorowych poprzez rozwikłanie ich zachowań integracyjnych^15,16,22-24. Ostatnio projekt LAM-PCR umożliwił określenie swoistości i aktywności poza celem nukleaz zaprojektowanych za pomocą testu pułapkowania IDLV²⁵.

Ponadto, LAM-PCR pozwala łatwo śledzić losy transdukowanej komórki w czasie w organizmie. Pozwala to na identyfikację protoonkogenów, a także genów supresorowych nowotworów, a także na badanie hematopoezy lub biologii nowotworowych komórek macierzystych^26-28. Wreszcie, co nie mniej ważne, LAM-PCR został przystosowany do badania różnorodności receptorów komórek T u ludzi²⁹ (i dane niepublikowane).

Wewnętrzna moc technologii jest wzmocniona przez powiązanie metody z technologiami głębokiego sekwencjonowania, które pozwalają scharakteryzować miliony nieznanych bocznych DNA z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu w całych genomach. W poniższym protokole opisujemy krok po kroku amplifikację i identyfikację flankującego nieznanego DNA w celu identyfikacji wektora lentiwirusowego IS. Oligonukleotydy użyte w protokole wymieniono w tabeli 1. Wyekstrahowane DNA lub cDNA z dowolnego źródła można wykorzystać jako matrycę DNA do LAM-PCR i nrLAM-PCR.

Protocol

1. Przygotowanie kaset z linkerem (LC)

1. Wymieszać 40 μl oligonukleotydu LC1 (Tabela 1), 40 μl oligonukleotydu LC2 (Tabela 1, z odpowiednim zwisem enzymu restrykcyjnego), 110 μl Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) i 10 μl 250 mM MgCl₂.
2. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut i pozwolić reakcji powoli ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać 300 μl_H2O i skoncentrować dsLinker-DNA na filtrze wirującym. Dodać 80 μl_H2Odo eluatu i podwielokrotność 10 μl przygotowanej kasety łącznikowej w probówkach 0,2 PCR.

2. Preamplifikacja połączeń genomu wektora

1. Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować reakcję PCR o objętości 50 μl.
   1. Określić stężenie próbek DNA. Odpipetować x μl (1-1 000 ng dla LAM/100-1 000 ng dla nrLAM) DNA do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Objętość DNA powinna być równa w każdej próbce i mieścić się w zakresie od 0,5 do 25 μl.
   2. Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z opisem w Tabeli 2. Wymieszać (50 - x) μl mieszanki wzorcowej z każdą próbką DNA w probówkach PCR o pojemności 0,2 ml.
2. Wstępna amplifikacja wektorowych połączeń genomowych przy użyciu warunków PCR zilustrowanych w tabeli 2. Po zakończeniu PCR dodaj 0,5 μl polimerazy Taq do każdej probówki PCR i ponownie uruchom program PCR. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 4 dni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.

3. Separacja magnetyczna produktu PCR

1. Przygotowanie koralików magnetycznych
   1. Odpipetować 20 μl (200 μg) kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną do probówki o pojemności 1,5 ml i wystawić na 1 minutę na magnetyczny separator cząstek (MPS) w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
   2. Wyjmij probówkę z MPS i ponownie zawieś kulki magnetyczne w 40 μl PSB/ 0,1% BSA (pH 7,5). Wystawić na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok raz.
   3. Przemyć kulki 20 μl roztworu 3 M LiCl (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), wystawić na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić kulki w 50 μl roztworu 6 M LiCl (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
2. Wymieszaj całą reakcję PCR z kroku 2.2 z 50 μl przygotowanych kulek magnetycznych. Inkubować na wytrząsarce poziomej (300 obr./min) co najmniej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Ten etap umożliwia wiązanie biotynylowanego produktu PCR z kulkami pokrytymi streptawidyną (kompleks DNA-Bead). Kompleks kulek DNA może być inkubowany na wytrząsarce przez noc lub przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 4 dni.
3. Wystawić kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-Bead w 100 μl H₂O. Natychmiast przejdź do kroku 4 dla LAM lub kroku 5 dla nrLAM.

4. Procedura LAM

1. Synteza dwuniciowego DNA (dsDNA) (tylko LAM)
   1. Wystaw kompleks DNA-Bead z kroku 3.3 na MPS na 1 minutę i odrzuć supernatant. Dodać 8,25 μl_H2O, 1 μl 10x buforu heksanukleotydowego, 0,25 μl dNTP (10 mM) i 0,5 μl (2 U) polimerazy Klenowa. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   2. Dodać 90 μl_H2Oi wystawić na działanie MPS przez 1 min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-Bead w 100 μl_H2O.
2. Przegląd ograniczeń
   1. Wystawić kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Dodać 8,5 μl H₂O, 1 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego i 0,5 μl enzymu restrykcyjnego i inkubować reakcję przez 1 godzinę. Powtórz krok 4.1.2.
      UWAGA: Reakcję inkubować w temperaturze zalecanej przez producenta enzymu restrykcyjnego. Upewnij się, że w obrębie lub za miejscem wiązania startera używanym do wstępnej amplifikacji w DNA będącym przedmiotem zainteresowania nie ma miejsca ograniczenia. Aby uzyskać informacje na temat wyboru odpowiednich kombinacji enzymów restrykcyjnych/enzymów restrykcyjnych, patrz ^{punkt 9}.
3. Podwiązanie łącznika ds (LK)
   1. Wystawić kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Dodaj 5 μl H₂O, 1 μl 10x bufor FastLink, 1 μl ATP (10 mM), 2 μl kasety Linker z kroku 1.2 i 1 μl Ligazy DNA Fast-Link (2 U/μl). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz krok 4.1.2.
4. Denaturacja zsyntetyzowanego dsDNA
   1. Wystawić kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Zawiesić kompleks DNA-kulek w 5 μl 0,1 N NaOH. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce poziomej.
   2. Wystaw kompleks DNA-Bead na działanie MPS przez 1 minutę i zbierz wstępnie amplifikowane połączenie wektor-genom zawierające supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Natychmiast przejść do kroku 6 lub przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C.

5. Procedura nrLAM

1. Podwiązanie łącznika jednoniciowego (ssLC) (tylko nrLAM)
   1. Wystaw kompleks DNA-Bead z kroku 3.3 na MPS na 1 minutę i odrzuć supernatant. Dodać 6,5 μl H₂O, 1 μl CircLigase 10x bufor reakcyjny, 0,5 μl MnCl₂ (50 mM), 0,5 μl ATP (1 mM), 1 μl oligonukleotydu ssLinker i 0,5 μl CircLigaze (100 U/μl). Inkubować w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.
   2. Dodać 90 μl_H2Oi wystawić na działanie MPS przez 1 minutę. Wyrzucić supernatant i przemyć kompleks DNA-Bead w 100 μl H₂O. Ponownie wystawić na działanie MPS przez 1 minutę, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-Bead w 10 μl H₂O.

6. Wzmocnienie wykładnicze I

1. Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować reakcję PCR o objętości 50 μl.
   1. Pobrać pipetę z 2 μl matrycy DNA (z etapu 4.4.2 (LAM) lub 5.1.2 (nrLAM)) do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
   2. Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z opisem w tabeli 3. Dodać 48 μl mieszanki wzorcowej do każdej próbki z kroku 6.1.1 i amplifikować połączenia genomu wektora za pomocą warunków PCR, jak pokazano w tabeli 3. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 4 dni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.

7. Separacja magnetyczna produktu PCR

1. Przygotuj koraliki magnetyczne zgodnie z przykładem w krokach 3.1.1 - 3.1.3. Zawiesić kulki w 20 μl (dla LAM) lub 50 μl (dla nrLAM) roztworu 6 M LiCl (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Zmieszać 20 μl (LAM) lub 50 μl (nrLAM) reakcji PCR z etapu 6.1.2 z przygotowanymi kulkami magnetycznymi (etap 7.1) i inkubować na wytrząsarce poziomej (300 obr./min) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Kompleks kulek DNA może być inkubowany na wytrząsarce przez noc lub przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 4 dni.
2. Wystawić kompleks DNA-kulki na działanie MPS przez 1 minutę, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-kulki w 100 μl H₂O. Wystawić kompleks DNA-kulki na działanie MPS przez 1 minutę i odrzucić supernatant.
3. Zawiesić kompleks DNA-kulek w 20 μl (LAM) lub 5 μl (nrLAM) 0,1 N NaOH. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce poziomej, wystawić na działanie MPS przez 1 minutę i zebrać amplifikowane DNA zawierające supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Natychmiast przejść do kroku 8.1 lub przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C.

8. Wzmocnienie wykładnicze II

1. Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować reakcję PCR o objętości 50 μl.
   1. Pobrać pipetę z 2 μl matrycy DNA (z kroku 7.3) do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
   2. Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z opisem w Tabeli 4. Dodać 48 μl mieszanki wzorcowej do każdej próbki z kroku 8.1.1 i amplifikować połączenia genomowe wektora za pomocą warunków PCR, jak pokazano w tabeli 4. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 4 dni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.
2. Aby uwidocznić produkty (nr)LAM-PCR, załaduj 10 μl produktu PCR z kroku 8.1.2 na 2% żel agarozowy. Jeśli prążki są widoczne, przeanalizuj 10 μl produktu LAM-PCR na żelu o wysokiej rozdzielczości. UWAGA: Bromek etydyny jest mutagenny. Pracuj bardzo ostrożnie i zawsze noś odpowiednie rękawice.

9. Przygotowanie do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

1. Oczyszczanie produktów (nr)LAM-PCR
   1. Zmieszaj 40 μl produktu PCR z kroku 8.1.2 z 44 μl kulek magnetycznych AMPure XP o temperaturze pokojowej. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wystawić na działanie MPS przez dodatkowe 2 minuty.
   2. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć 200 μl 70% EtOH na MPS.
   3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kompleks DNA-kulki w 30 μl_H2O. Inkubować przez 1 minutę i przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 0,2 ml. Określ stężenie oczyszczonego DNA.
2. Fusionprimer PCR w celu dodania adapterów specyficznych dla sekwencjonowania.
   1. Dla każdej próbki, która ma być poddana analizie, należy przygotować reakcję PCR o objętości 50 μl.
   2. Odpipetować x μl (40 ng) DNA do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Objętość DNA powinna być równa w każdej próbce i mieścić się w zakresie od 0,5 do 25 μl.
   3. Przygotować główną mieszaninę PCR zgodnie z opisem w tabeli 5. Dodać (50 - x) μl mieszanki wzorcowej do każdej próbki z kroku 9.2.2 i wprowadzić adaptery do sekwencjonowania do produktów (nr)LAM-PCR w warunkach PCR, jak pokazano w tabeli 5. Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do 4 dni lub długotrwale w temperaturze -20 °C.
   4. Aby uwidocznić produkty Fusionprimer-PCR, załaduj 10 μl produktu PCR z kroku 9.2.3 na 2% żel agarozowy. Oczyść pozostały produkt PCR zgodnie z opisem w krokach 9.1.1 - 9.1.3. Przeanalizuj 1 μl oczyszczonego produktu PCR z kroku 9.4 na zautomatyzowanym urządzeniu do elektroforezy o wysokiej rozdzielczości, aby dokładnie określić ilościowo stężenie i wielkość fragmentów produktów Fusionprimer-PCR.

Results

LAM-PCR powoduje amplifikację połączeń genomu wektora z określonym rozmiarem fragmentu dla każdego połączenia. Wielkość poszczególnych fragmentów PCR zależy od odległości między lokalizacją znanego DNA w genomie a najbliższym miejscem rozpoznania enzymu restrykcyjnego. Pozwala to na wizualizację różnorodności amplifikowanych połączeń w analizowanych próbkach za pomocą elektroforezy żelowej, np. jeśli na żelu obecne są tylko pojedyncze (monoklonalne), kilka (oligoklonalne) lub wielokrotne (poliklonalne) prążki. W...

Discussion

Technika LAM-PCR pozwala na identyfikację nieznanych sekwencji DNA, które flankują znany region DNA. Ze względu na wysoką czułość wynikającą z preamplifikacji połączeń ze specyficznymi starterami hybrydyzującymi w znanej sekwencji DNA, możliwa jest amplifikacja i wykrycie nawet rzadkich połączeń aż do poziomu pojedynczej komórki. Przeciwnie, w sytuacji poliklonalnej LAM-PCR jest w stanie wzmocnić tysiące różnych połączeń w jednej reakcji.

Jednak ze względu na zastosowanie enzymów restrykcyjnyc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polimeraza DNA Taq	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Można stosować alternatywne polimerazy Taq
Bufor PCR	Qiagen	201203	Zaleca się stosowanie tego buforu Mieszanina
dNTP	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	lub dowolna inna dNTPs
Oligonukleotydy (startery)	MWG Biotech		HPLC oczyszczone
Dynabeads M-280 Streptawidyna	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0,1% wag./obj. BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7,5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7,5	USB Corporation	22637	lub dowolny inny dostawca
EDTA	Applichem	A1103,0250	lub dowolny inny dostawca
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Mieszanina heksanukleotydów	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonukleaza	NEB		lub jakikolwiek inny dostawca
Zestaw	do ligacji DNA Fast-LinkEpicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	lub dowolny inny dostawca
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	lub jakikolwiek inny dostawca
Bufor TBE	Amresco	0658	lub dowolny inny dostawca
Bromek etydyny	Applichem	A2273,0005	Bromek etydyny jest mutagenny
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	lub dowolny inny drabinka DNA
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	lub dowolny inny dostawca
Magnetyczny separator cząstek Magna-Sep	Life Technologies	K158501	do stosowania z probówkami o pojemności 1,5 ml
Magnetyczny separator cząstek Magna-Sep	Technologies	K158696	do stosowania z płytkami 96-dołkowymi
Amicon Ultra-0,5, membraną Ultracel-30	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	lub innym systemem do elektroforezy
TProfessional 96	Biometra	050-551	lub inny Termocykler do płytek 96-dołkowych
Wytrząsarka orbitalna KS 260 basic	IKA	2980200	lub inna wytrząsarka pozioma
PCR softtubes 0,2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	lub inne probówki do PCR 0,2
ml Probówki 1,5 ml	Eppendorf	12682	lub inne probówki 1,5 ml
System dokumentacji żeli	PeqLab		lub dowolny inny system dokumentacji żeli
Spektrofotometr Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 żel prefabrykowany	Elchrom Scientific	3497
Aparat do elektroforezy żelowej zanurzonej SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Bioanalizator elektroforezy	Agilent Technologies	G2939AA