Artykuł metodologiczny

Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51549

⸱

23 maja 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Plate-Forme d'Imagerie Dynamique, Imagopole, Institut Pasteur, 2Department of Radiation Oncology, Stanford School of Medicine, 3Service Hospitalier Frédéric Joliot, Institut d'Imagerie Biomédicale, 4Vanderbilt School of Medicine, 5The Walter & Eliza Hall Institute of Medical Research, 6Unité INSERM U786, Institut Pasteur, 7Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur

W tym artykule

Podsumowanie

Rozszerzanie podstaw i możliwości zastosowania Fluorescencji przez Niezwiązane Wzbudzenie z Luminescencji (FUEL) poprzez badanie odpowiednich zasad i wykazanie jej zgodności z wieloma fluoroforami i warunkami ukierunkowanymi na przeciwciała.

Streszczenie

Fluorescencja przez wzbudzenie niezwiązane z luminescencji (FUEL) to proces emisji wzbudzenia radiacyjnego, który powoduje zwiększenie sygnału i kontrastu w in vitro i in vivo. FUEL ma wiele tych samych podstawowych zasad, co bioluminescencyjny rezonansowy transfer energii (BRET), ale znacznie różni się pod względem dopuszczalnych odległości roboczych między źródłem luminescencyjnym a jednostką fluorescencyjną. Podczas gdy BRET jest skutecznie ograniczony do maksymalnie 2-krotności promienia Förstera, zwykle poniżej 14 nm, FUEL może występować w odległościach do μm lub nawet cm przy braku absorbera optycznego. W tym miejscu rozwijamy podstawy i możliwości zastosowania FUEL, dokonując przeglądu odpowiednich zasad stojących za tym zjawiskiem i wykazując jego kompatybilność z szeroką gamą fluoroforów i fluorescencyjnych nanocząstek. Ponadto badana jest użyteczność FUEL ukierunkowanego na przeciwciała. Przedstawione tutaj przykłady dostarczają dowodów na to, że FUEL może być wykorzystywany do zastosowań, w których BRET nie jest możliwy, wypełniając pustkę przestrzenną, która istnieje między BRET a tradycyjnym obrazowaniem całych zwierząt.

Wprowadzenie

Genetyczna modyfikacja organizmów, takich jak wirusy 1,2, bakterie3 lub małe ssaki4 w celu wywołania lub konstytutywnego wyrażenia bioluminescencji, była bardzo udana i szeroko zademonstrowana5-7. Bioluminescencja, reakcja chemiluminescencyjna in vivo z udziałem naturalnie występujących odczynników, ma tę zaletę, że wytwarza światło bez konieczności stosowania zewnętrznego źródła światła. W związku z tym obrazowanie bioluminescencyjne nie cierpi z powodu typowych wad automatycznego i niespecyficznego sygnału, który można znaleźć w obrazowaniu fluorescencyjnym8. W związku z tym bioluminescencja ma znaczny stosunek sygnału do szumu, ponieważ każdy wykryty sygnał pochodzi wyłącznie z zamierzonego źródła. Podczas gdy wiele modeli wykorzystywało operon luksa z Photorhabdus luminescens (maksymalna emisja wyśrodkowana między 480 a 490 nm) do zastosowań in vitro i in vivo 9, jego zastosowanie u małych ssaków było problematyczne ze względu na samą naturę warunków obrazowania; Wszechobecne istnienie absorberów optycznych, takich jak hemoglobina, oraz czynników rozpraszających, takich jak tkanki i kości, silnie wpływa na długości fal od niebieskiego do żółtego3. Ekspresja zmodyfikowanej lucyferazy świetlików (maksimum emisji przy 617 nm) została niedawno opracowana i włączona, dostarczając narzędzia, które znacznie pokonuje absorpcję optyczną10, ale nadal podlega efektom rozpraszania.

W odpowiedzi podjęto wiele prób przesunięcia emitowanego sygnału ku czerwieni do pożądanego okna optycznego 650-900 nm, obszaru zminimalizowanej absorpcji i rozproszenia, przy użyciu transferu energii rezonansu bioluminescencji (BRET)11-13. Jako narzędzie poprawiające wykrywanie sygnału, BRET, który wykorzystuje źródło bioluminescencyjne jako donor i dodany fluorofor jako akceptor, odniósł ograniczony sukces. Jako przełomowy przykład tego zjawiska, "samoświecące kropki kwantowe" (SIQDs)14 składają się ze zmodyfikowanych lucyferazy Renilla reniformis związanych z zewnętrzną warstwą polimerowo-lizynową dostępnych na rynku kropek kwantowych (QD). Po dodaniu substratu, wynikowa reakcja bioluminescencyjna indukuje emisję fluorescencji z QD, generując znaczną produkcję czerwonych fotonów. Jednak te SIQD mają ograniczone zastosowanie do wizualizacji in vivo zdarzeń istotnych z fizjologicznego punktu widzenia. To ograniczone zastosowanie jest prawdopodobnie spowodowane trudnościami w powiązaniu podwójnej sondy z narządem, komórką lub genem będącym przedmiotem zainteresowania, ponieważ SIQD nie mogą być kodowane genetycznie i dlatego wymagałyby wtórnej modyfikacji powłoki polimerowej. Aby poprawić ich zastosowanie, ostatnio zastosowano alternatywne SIQD, w których lucyferazy są bezpośrednio związane z rdzeniem luminescencyjnym15. Opierając się na koncepcji SIQD, uzyskano bardziej odpowiedni system BRET poprzez przyłączenie lucyferazy Cypridina do barwnika indocyjaninowego16, który był w stanie specyficznie celować w nowotwory u myszy, wytwarzając jednocześnie znaczne przesunięcie ku czerwieni z 460 nm do 675 nm. Aby przejść nieradiacyjny transfer energii, BRET podlega tym samym podstawowym ograniczeniom, co jego fluorescencyjny odpowiednik: musi istnieć silne nakładanie się widm między emisją donorową a widmami wzbudzenia akceptora, a odległość robocza między dwiema cząstkami musi być rzędu promienia Förstera (5-14 nm w zależności od pary donor-akceptor, o maksymalnej efektywnej odległości dwukrotnie większej niż promień Förstera17). Ta zależność od odległości znacznie ogranicza typy zdarzeń, które można zaobserwować za pomocą BRET jako środka zwiększającego wykrywanie.

Niedawno zidentyfikowano nowe podejście, które zostało zademonstrowane zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Opierając się na fundamencie BRET, Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)18,19 wymaga również silnego nakładania się widmowego między składnikami luminescencyjnymi i fluorescencyjnymi. Jednak w przeciwieństwie do BRET, FUEL jest procesem całkowicie radiacyjnym, w którym foton emitowany ze źródła luminescencyjnego jest absorbowany przez optycznie dostępny fluorofor, który następnie emituje foton przesunięty ku czerwieni zgodnie z wydajnością kwantową fluoroforu. Podobnie jak w przypadku BRET, podejście to może być również wykorzystane do przezwyciężenia ograniczeń związanych z obrazowaniem w obecności absorberów optycznych. Wynikowe przesunięcie ku czerwieni zapewnia ogólny wzrost i swoistość wykrywanego sygnału ze względu na zmniejszenie tłumienia i zmniejszenie efektów rozpraszania optycznego. Doniesiono, że FUEL występuje między bioluminescencyjnymi Escherichia coli wyrażającymi operon luksa a QDs 18,19. Chociaż eksperymentalnie są podobne do SIQD, istnieje zasadnicza różnica: w FUEL nie jest konieczne, aby źródło luminescencyjne było fizycznie związane z fluoroforem, co pozwala na kodowanie genetyczne sondy luminescencyjnej. Ze względu na udane wykrycie FUEL między bakteriami luminescencyjnymi a QD, możliwe jest, że technika ta może być stosowana zarówno w przypadku infekcji powierzchownych (skóra), jak i tkanek głębokich (płuca, wątroba), takich jak Staphylococcus aureus i Klebsiellia pneumoniae.

Od czasu raportu o jego eksperymentalnym znaczeniu, FUEL rozwinął się, aby zawierać solidny model matematyczny20, który może być używany do przewidywania akceptowalnych par luminescencyjnych i fluorescencyjnych, a jego zastosowania rozszerzyły się o wykorzystanie do identyfikacji cech fotofizycznych, takich jak wydajność kwantowa. Poniżej opisujemy kilka podstawowych technik PALIWA. Po pierwsze, pokazujemy dowody na to zjawisko zarówno na krótkich (μm), jak i długich (cm) odległościach roboczych, co zasadniczo odróżnia FUEL od BRET. Po drugie, rozszerzamy możliwe pary FUEL, badając szeroką gamę fluoroforów i fluorescencyjnych nanocząstek. Po trzecie, zastosowania FUEL są badane poprzez porównywanie docelowych i niedocelowych par FUEL.

Protokół

1. Odczynniki

  1. Zakup lub opracowanie bakterii luminescencyjnych i odpowiednich pożywek hodowlanych, takich jak zmodyfikowane Escherichia coli wyrażające luksyABCDE21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae22.
  2. Przygotuj roztwory soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i pożywki hodowlane zgodnie ze standardowymi recepturami. E. coli i K. pneumoniae hodowano w Luria Bertani (LB) w temperaturze 37 °C, a V. fischeri i Photobacterium sp w LB uzupełnionym 0,5 M NaCl w temperaturze 22 °C.
  3. Kup lub kup sondy fluorescencyjne, takie jak Q-tracker 705 (średnica 40 nm, określana jako QD705), Q-tracker 800 (średnica 40 nm, określana jako QD800), fluorescencyjna (średnica 40 nm) i niefluorescencyjne mikrosfery polistyrenowe (średnica 48 nm) oraz konwencjonalne barwniki fluorescencyjne.
  4. Przygotuj niezbędne odczynniki do znakowania bakterii.
  5. Zapewnij dostęp do całościowego urządzenia do obrazowania bioluminescencyjnego dla zwierząt, takiego jak IVIS Spectrum, które jest w stanie wykrywać sygnał w szerokim zakresie długości fal emisji i czasów ekspozycji. Czytnik płytek zdolny do pomiarów bioluminescencji wystarczy do większości opisywanych tu eksperymentów.

2. Podstawowa rekapitulacja PALIWA

  1. Zaczynając od pojedynczych kolonii na standardowych płytkach hodowlanych, rozpocznij nocne hodowle bakterii luminescencyjnych. Tutaj użyto V. fischeri.
  2. W dniu eksperymentów zainicjuj nowe subkultury i pozwól im się rozwijać, aż do osiągnięcia OD600 1-1,5. W celu uzyskania porównywalnych wyników najlepiej jest używać bakterii w podobnych stanach wzrostu, w których wytwarzają intensywne sygnały. Można to zapewnić, utrzymując stałą średnicę zewnętrzną600.
  3. Połączyć podwielokrotności po 100 μl z każdego z 5 μl QD705 lub soli fizjologicznej (PS), a następnie dodać do 895 μl PS do standardowych kuwet spektroskopowych. Umieść napełnione kuwety w IVIS Spectrum i wykonaj pomiary pod odpowiednimi zestawami filtrów. W tym przypadku zastosowano filtr emisji 710-730 nm.

3. PALIWO na różnych dystansach

  1. Napełnij dwie plastikowe kuwety fotometryczne o zmniejszonej objętości (1 ml) 50 μl QD705 lub 97,2 μl niefluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych 48 nm o łącznej objętości 1 ml PS. Zapewnia to podobną powierzchnię bryły na całkowitą objętość między dwoma elementami.
  2. Przygotuj kuwetę źródła światła, przykrywając trzecią kuwetę standardową czarną taśmą lub innym nieprzezroczystym materiałem zdolnym do blokowania światła. Ostrożnie przygotuj dwa identyczne okienka optyczne po przeciwnych stronach kuwety.
  3. Umieść wcześniej napełnione kuwety bezpośrednio po obu stronach kuwety źródła światła. Dodać 1 ml porcji V. fischeri lub innej kultury (np. luminescencyjnej E. coli lub Photobacterium sp) ze świeżej subkultury do kuwety źródła światła i przykryć ją nieprzezroczystym materiałem, takim jak papier, aby zmniejszyć zanieczyszczenie światłem.
  4. Wyobraź sobie, że trzy kuwety znajdują się pod odpowiednimi filtrami emisyjnymi, takimi jak filtry emisji Total Light i 710-730 nm, z czasami naświetlania wynoszącymi odpowiednio 10, 30 i 30 sekund.
  5. Ustaw obie kuwety zewnętrzne w równoważnych dalszych odległościach od kuwety centralnej, a następnie ponownie wyświetl wizualizację. Powtarzaj tę czynność, aż zostanie osiągnięta ostateczna odległość 3 cm od lewej do środkowej lub o zmniejszonej objętości twarzą w twarz. Na każdym etapie należy uzyskać obraz fluorescencyjny (wzbudzenie 450-480 nm, emisja 710-730 nm), aby zweryfikować lokalizację QD705.

4. Badanie potencjalnych par paliw

  1. Napełnić dwie kuwety o zmniejszonej objętości roztworami o objętości 1 ml zawierającymi fluorofor lub fluorescencyjną nanocząstkę będącą przedmiotem zainteresowania w jednej z nich, a PS lub PS niefluorescencyjnymi nanocząstkami jako kontrolą ujemną w drugiej. W ramach zademonstrowanych prac zbadano różne potencjalnie dostępne na rynku fluorofory FUEL i nanocząstki fluorescencyjne, jak przedstawiono w tabeli 1.
  2. Dodać 1 ml podwielokrotności świeżych bakterii V. fischeri lub innych bakterii luminescencyjnych do zaciemnionej trzeciej kuwety zawierającej dwa fizycznie równe okienka optyczne umieszczone po przeciwnych stronach. Przykryj kuwetę nieprzezroczystą substancją, taką jak kawałek czarnego papieru.
  3. W krótkiej, ale równej odległości umieść dwie kuwety o zmniejszonej objętości po obu stronach zaciemnionej kuwety i wizualizuj je pod odpowiednimi filtrami. Tutaj zastosowano odległość 0,7 cm. Powtórz z pozostałymi fluoroforami.

5. Docelowe PALIWO

  1. Przygotować biotynylowane przeciwciała specyficzne dla bakterii luminescencyjnych. Na przykład w tym przypadku pierwszorzędowe przeciwciała specyficzne dla K. pneumoniae (α-Kp) biotynylowano przy użyciu roztworu zawierającego EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin.
  2. Usunąć nadmiar odczynnika z przeciwciał za pomocą kolumn odsalających pod wirowaniem (1 500 x g) przez 2 minuty.
  3. Użyj standardowego testu Bradforda, aby określić stężenie białka i określić stopień biotynylacji przeciwciał za pomocą testu HABA.
  4. Otrzymać partie przeciwciał biotynylowanych (Ab) α-Kp-biot przez zmieszanie 100 μl (10 mM, rozpuszczonych w 1x PBS) z 40 μl przeciwciała α-Kp, uzyskując końcowy stopień podstawienia 16 reszt biotyny na Ab i końcowe stężenie białka 10 mg ml-1.
  5. Korzystając z wielu kultur replikowanych przez noc, celuj w umyte bakterie wyżej wymienionymi przeciwciałami zgodnie z odpowiednim protokołem.
    1. W szczególności przemyć K. pneumoniae w 1x PBS i ponownie zawiesić w 1x PBS do OD 4 (ok. 4 x 108 CFU ml-1 OD-1).
    2. Dla każdej kontrpróby inkubować 100 μl PBS, przeciwciał α-Kp (10 μl α-Kp-biotB lub 10 μl PBS dla kontroli) i 100 μl komórek przez 90 minut w temperaturze 30 °C. Przemyć komórki trzykrotnie w 1x PBS i ponownie zawiesić w 196 μl PBS.
  6. Oznacz komórki koniugatem streptawidyny QD705 i podziel je na dwie równoważne objętości.
  7. Umyj jeden roztwór trzy razy, a następnie ponownie wymieszaj go do odpowiedniej objętości.
  8. Rozprowadzić 100 μl umytych i nieumytych roztworów do indywidualnych dołków czarnej 96-dołkowej płytki. Zmierz wynikową luminescencję pod filtrami światła całkowitego, 490-510 nm i 710-730 nm. Stężenie fluoroforu można oznaczyć za pomocą wzbudzenia 450-480 nm i emisji 710-730 nm.

Wyniki

Rezonansowy transfer energii (RET) to nieradiacyjny oddziaływanie pomiędzy luminescencyjnym donorem a fluorescencyjnym akceptorem, w którym energia z wzbudzonego donora jest w stanie wywołać odpowiedź fluorescencyjną akceptora poprzez silne oddziaływanie dipol-dipol13. RET, który został opisany z wykorzystaniem donorów fluorescencyjnych23, chemiluminescencyjnych24 i bioluminescencyjnych13, wymaga przede wszystkim: 1. Silnego nakładania się widm emisji donora i wzbudzenia akceptora; 2. Odpowiedniego ustawienia rotacyjnego obu jednostek; oraz 3. Odległości roboczej nieprzekraczającej 0,5- do 2-krotności promienia Förstera, R0, pomiędzy donorem a akceptorem17. W przeciwieństwie do RET, FUEL zachodzi, gdy źródło luminescencyjne, takie jak bakterie bioluminescencyjne, emituje foton, który jest absorbowany i reemitowany przez drugą jednostkę, taką jak fluorofor lub fluorescencyjna nanocząstka, co przesuwa widmo emisji pierwotnego źródła luminescencyjnego w stronę czerwieni. Zatem FUEL przebiega według standardowego procesu wzbudzenie-emisja, podobnego do standardowych warunków epifluorescencyjnych, jednak bez użycia skupionego wzbudzenia. Dowód na to można łatwo zaobserwować poprzez proste zmieszanie bakterii luminescencyjnych i silnie fluorescencyjnych kropek kwantowych. W obecności Vibrio sp. obserwuje się znaczny wzrost sygnału czerwonego, gdy w roztworze znajdowały się również QD705, w porównaniu z kontrolą w postaci niefluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych (Rysunek 1A). Składniki niezbędne do wytworzenia bioluminescencji, w zasadzie substrat aldehydowy, lucyferaza i ATP, są wszystkie produkowane i zawarte w cytoplazmie. Co więcej, enzymatyczna produkcja luminoforu zachodzi wewnątrz cytoplazmy bakteryjnej (Rysunek 1B). Jak doniesiono w innych publikacjach, odległość między błoną wewnętrzną a zewnętrzną bakterii wynosi zazwyczaj więcej niż 30 nm25-27, co jest dystansem, który nie pozwala na wystąpienie znaczącego RET. Ponadto fluorescencyjne nanocząstki nie przenikają do cytoplazmy bakteryjnej, ponieważ nie zachodzi endocytoza ani inne mechanizmy pobierania. Wspólnie ograniczenia te wskazują, że FUEL jest dominującym zjawiskiem wzbudzenie-emisja, które występuje podczas mieszania bakterii luminescencyjnych z fluorescencyjnymi nanocząstkami.

Jak wykazano wcześniej, zjawisko FUEL występuje poza zakresem RET. Aby zbadać zależność FUEL od odległości, można zastosować standardowe spektrofotometryczne kuwety o zredukowanej objętości, z czego jedna zawiera roztwór fluoroforu, druga odpowiednią kontrolę pozwalającą skorygować rozproszenie, a trzecia porcję świeżego roztworu luminescencyjnego. Niezbędne jest owinięcie środkowej kuwety czarną taśmą lub innym nieprzezroczystym materiałem, z wyjątkiem co najmniej dwóch identycznych okien optycznych znajdujących się na przeciwległych ściankach, aby ograniczyć ewentualne zanieczyszczenie światłem z emitera luminescencji. Ponadto dwie pozostałe kuwety należy umieścić w równych odległościach po obu stronach kuwety środkowej. Na koniec, w każdym eksperymencie należy zastosować świeży roztwór luminescencyjny (z wykorzystaniem bakterii lub chemiluminescencji), aby zapewnić maksymalną emisję światła. Po odpowiednim rozmieszczeniu należy zarejestrować sygnał luminescencji przy użyciu wybranych filtrów. W tym przypadku zastosowano filtry Total Light oraz 710-730 nm, choć przedstawiono jedynie dane z tego drugiego. Po każdym pomiarze należy stopniowo zwiększać odległość między ściankami od 1,0 cm do 3 cm (Rysunek 2). Następnie wszystkie dane należy znormalizować do punktu o najwyższej intensywności. W zastosowanych tutaj przykładach miało to miejsce przy najmniejszej odległości (D = 1 cm) między źródłem luminescencji a kuwetą zawierającą QD705. Stosując to podejście, można zaobserwować mierzalny sygnał FUEL aż do ostatniego pomiaru, co sugeruje, że w przypadku braku absorbenta optycznego FUEL może wystąpić w odległościach przekraczających jakikolwiek możliwy rezonansowy transfer energii i może być wyjaśniony wyłącznie jako efekt radiacyjny. Dopasowanie danych wykazuje spadek sygnału jako funkcji odległości D zgodnie z zależnością od D-1 do D-2. W zależności od konfiguracji geometrycznej, pierwsza z nich odpowiada zależności odległości w kondensatorze, a druga prawu odwrotnych kwadratów dla źródeł punktowych. Wynik ten jest zatem zgodny z naszą całościową konfiguracją pomiarową, biorąc pod uwagę rozmiar otworu kuwety oraz odległość między źródłem luminescencji a fluoroforem.

FUEL dotyczy nie tylko kropek kwantowych, ale może być również obserwowane przy użyciu szerokiego zakresu fluoroforów, od serii Alexa po fluorescencyjne mikrosfery (Tabela 2). Aby wyniki były porównywalne z kontrolą, należy stosować równe stężenia poszczególnych fluoroforów i utrzymywać stałą całkowitą powierzchnię nanocząstek (Tabela 1). Po porównaniu fluoroforów i nanocząstek z odpowiednimi kontrolami (PS lub PS z niefluorescencyjnymi mikrosferami polistyrenowymi) zaobserwowano znaczny wzrost sygnału w maksimum emisji każdego obiektu fluorescencyjnego. Stwierdzono, że największy względny wzrost sygnału występuje wtedy, gdy maksimum emisji fluorescencyjnej jest najdalej oddalone od maksimum emisji luminescencyjnej. Jest to najprawdopodobniej spowodowane zwiększoną specyficznością sygnału fluorescencyjnego w porównaniu z szerokim widmem emisji źródła luminescencyjnego. Przeciwnie, najmniej wiarygodny sygnał FUEL odnotowano w przypadku, gdy dwa maksima emisji nie były wyraźnie rozdzielone. Co ciekawe, rozpoznawalny sygnał FUEL zaobserwowano w przypadku żółtych mikrosfer, mimo że różnica widmowa jest minimalna, co wynika najprawdopodobniej z dużej ilości fluoroforu obecnego w pojedynczym koraliku (350 ekwiwalentów fluoresceiny). Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że w odpowiednich warunkach FUEL można osiągnąć z różnorodnymi fluoroforami, co umożliwia dostosowanie sond wybranych do bardziej istotnych zastosowań zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Istotność zaobserwowanego sygnału FUEL określono za pomocą standardowego dwustronnego testu t-Studenta. W ten sposób stwierdzono, że jedynie Alexa555 jest niekompatybilny z zastosowanym źródłem luminescencyjnym.

Aby zbadać efekty celowania w FUEL, zastosowano biotynilowane przeciwciała do celowania w luminescencyjne bakterie oraz kropki kwantowe (QD) sprzężone ze streptawidyną. Ważne jest, aby bakterie lub źródło luminescencji tworzyły warstwę wystarczająco grubą, by zminimalizować możliwość wystąpienia RET pomiędzy luminoforem a odpowiadającym mu fluoroforem. Po inkubacji i przemyciu w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał, bakterie znakowane biotyną poddano działaniu albo sprzężonych ze streptawidyną QD705, albo niefunkcjonalizowanych QD705 jako kontroli; roztwory podzielono i jeden zestaw poddano dodatkowym przemyciom w celu usunięcia wszelkich nieprzylegających QD705. W tym przypadku, dla wszystkich czterech warunków, wynikającą luminescencję obserwowano przy użyciu filtrów Total Light, 490-510 nm oraz 710-730 nm, przy czym do analizy danych wykorzystano tylko dwa ostatnie filtry. Obecność QD705 porównano, stosując filtry wzbudzenia 450-480 nm i emisji 710-730 nm. W toku badań stwierdzono niewielką lub żadną różnicę w sygnale przesuniętym w stronę czerwieni, gdy roztwory pozostawiono w stanie nieprzemytym (Rysunek 3). Wynikający z tego sygnał fluorescencji w tym warunku okazał się również bardzo podobny, co sugeruje, że w obu stanach – celowanym i niecelowanym – obecna była taka sama liczba QD705. Jednak przemycie próbek w celu usunięcia niezwiązanych QD705 spowodowało niemal dwukrotny wzrost względnego sygnału czerwonego dla bakterii celowanych w porównaniu z niecelowaną kontrolą. Badanie fluorescencji może służyć do weryfikacji obecności lub braku QD705. W porównaniu, warunek celowany i przemyty skutkował intensywnością fluorescencji niemal trzykrotnie niższą niż w warunku nieprzemytym, jednak wynikające z tego przesunięcie w stronę czerwieni zmniejszyło się tylko o 30%, co sugeruje, że w warunkach czysto związanych celowanie w bakterie doprowadzi do zwiększenia emisji przesuniętej w stronę czerwieni. Świadczy to o dużej użyteczności celowanego FUEL w przyszłych zastosowaniach.

Wykres zmian krotności w stosunku do długości fali; schemat wzbudzenia optycznego; luminescencja z przepływem oksylucyferyny.
Rycina 1. Interakcja FUEL między bakteriami luminescencyjnymi a dostępnymi komercyjnie kropkami kwantowymi prowadzi do zwiększenia produkcji czerwonych fotonów. Dwie kuwety spektrofotometryczne wypełniono roztworami zawierającymi aliquoty 100 μl świeżej kultury V. fischeri o OD600 wynoszącej 1-1,5, 895 μl PS oraz 5 μl QD705 lub soli fizjologicznej (PS), a następnie umieszczono je w systemie IVIS Spectrum i zarejestrowano widmo emisji. Dzięki obecności QD705 uzyskano znaczny wzrost sygnału czerwonego, co można zauważyć po zwiększeniu liczby wykrytych fotonów•sec-1•cm-2 (p•sec-1•cm-2) w porównaniu z kontrolą przy zastosowaniu filtra emisji 710-730 nm (A). Tutaj podwójna membrana bakterii wyklucza interakcję grup luminescencyjnych (niebieskie kółka) i QD705 (czarne kółka). Te pierwsze znajdują się wyłącznie w cytoplazmie bakteryjnym, podczas gdy te drugie są swobodnie rozproszone w całej objętości roztworu (B). N=3 dla każdego roztworu bakteryjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres znormalizowanego sygnału w funkcji odległości dla Photobacterium i E. coli, podkreślający efekty QD705.
Rysunek 2. Dowód na występowanie FUEL na odległościach całkowicie wykluczających transfer energii przez rezonans. Kuwety spektrofotometryczne wypełniono roztworami zawierającymi albo 50 μl QD705 i 950 μl soli fizjologicznej (PS), albo 97,2 μl niefluorescencyjnych mikrokürek polistyrenowych o średnicy 48 nm i 902,8 μl PS, a następnie rozmieszczono je w równych odległościach po przeciwnych stronach centralnej czarnej kuwety zawierającej 1 ml świeżej luminescencyjnej kultury Photobacterium sp przy OD600 wynoszącym 1-1,5. Centralna kuweta posiadała dwa identyczne okna optyczne, umożliwiając swobodne rozproszenie emitowanych fotonów. Podczas pozyskiwania obrazów w odległościach (D) od 1,0 cm do 3 cm zaobserwowano spadek produkcji czerwonego światła w funkcji odległości, co dowodzi, że FUEL może zachodzić w odległościach nieosiągalnych dla transferu energii przez rezonans. Natężenie wydawało się wykazywać zależność D-2, podobnie jak w prawie odwrotnych kwadratów (lewo). Ten sam protokół zastosowano dla E. coli (prawo). Wynikowe linie trendu potwierdzają koncepcję, zgodnie z którą bakterie działają jako punktowe źródła światła. Wykonano łącznie trzy niezależne pomiary odległości, z których każdy wykorzystywał unikalną subkulturę. Słupki błędów są naniesione na każdy punkt. W niektórych przypadkach słupki błędów były mniejsze niż symbole wskazujące znormalizowane natężenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres bioluminescencji w porównaniu do fluorescencji przedstawiający analizę Kp-QD705; wykres słupkowy, porównanie danych.
Rycina 3. Porównanie między ukierunkowanym (specyficznym) a nieukierunkowanym (roztwór całkowity) FUEL. K. pneumoniae zfunkcjonalizowano przeciwciałami biotynylowanymi, a następnie poddano działaniu QD705 znakowanych streptawidyną (ukierunkowane) lub nieznakowanych (nieukierunkowane). Powstałe roztwory podzielono na równe części, a jeden zestaw przemyto trzykrotnie PBS przed ponownym zawieszeniem w początkowej objętości PBS. Następnie roztwory naniesiono do poszczególnych dołków czarnej płytki 96-dołkowej i obserwowano bioluminescencję przy użyciu filtrów emisyjnych 490-510 nm (500 nm) oraz 710-730 nm (720 nm) (oznaczone niebieskimi słupkami). Wartość p•sec-1•cm-2 uzyskaną z filtra 720 nm dla każdego dołka znormalizowano względem odpowiedniej intensywności bioluminescencji p•sec-1•cm-2 przy 500 nm z tego samego dołka. Względną intensywność fluorescencji wynikającą z wzbudzenia epifluorescencyjnego określono przy użyciu filtrów wzbudzenia 450-480 nm i emisji 710-730 nm (oznaczone czerwonymi słupkami). W warunkach bez przemywania (Nieukierunkowane Nieprzemyte i Ukierunkowane Nieprzemyte) zaobserwowano niewielką lub żadną różnicę w sygnale bioluminescencyjnym lub fluorescencyjnym. Sugeruje to, że związane i swobodne QD705 były w równym stopniu wzbudzane przez fotony bioluminescencyjne. Po przemyciu zaobserwowano prawie dwukrotną różnicę w względnym sygnale czerwonym dla bakterii znakowanych QD705 (Ukierunkowane Przemyte) w porównaniu z kontrolą (Nieukierunkowane Przemyte). Brak QD705 w próbce Nieukierunkowane Przemyte potwierdzono brakiem sygnału fluorescencyjnego, co zweryfikowało znakowanie QD705 w stanie Ukierunkowane Przemyte. Dane pochodzą z czterech niezależnych kultur K. pneumoniae. Dla jasności legenda wskazuje źródło wzbudzenia QD705. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

FluoroforStężenieμlPS (μl)λmaksymalny ex/em (nm)Filtr emisyjny (nm)
Alexa 55537.2 µM4.77995.23555/565570 – 590
Alexa 56837.2 µM4.77995.23578/603590 – 610
Alexa 63337.2 µM4.77995.23632/637650 – 670
Alexa 70037.2 µM4.77995.23702/723710 – 730
Niefluorescencyjny2,62% substancji stałych9.72990.28
µSph Różowy5% substancji stałych4.77995.23580/605610 – 630
µSph Żółty5% substancji stałych4.77995.23505/515510 – 530
QD7052 µM5995465/705710 – 730
QD8002 µM5995465/705790 – 810

Tabela 1. Właściwości fluoroforów wykorzystanych w demonstracjach FUEL.

KontrolafiltrfluoroforKontrolawartość p
p·s-1·cm-2SDp·sek-1·cm-2SD
A555PS5801,08 x 1073,31 x 1069,09 x 1061,75 x 1060.233
A568PS6008,47 x 1064,23 x 1064,49 x 1069,71 x 1050.094
A633PS6602,40 x 1061,25 x 1067,85 x 1052,39 x 1050.046
A700PS7205,53 x 1052,46 x 1051,54 x 1056,05 x 1040.026
MSph Yellowniefluorescencyjny µsphewyniki5201,19 x 1084,85 x 1075,79 x 1071,99 x 1070.057
MSph Pinkniefluorescencyjny µsphewyniki6202,37 x 1071,36 x 1072,16 x 1068,00 x 1050.026
QD705niefluorescencyjny µsphewyniki7201,76 x 1077,33 x 1062,08 x 1057,16 x 1040.007
QD800niefluorescencyjny µsphewynik8007,79 x 1064,72 x 1063,60 x 1041,52 x 1040.023

Tabela 2. Identyfikacja fluoroforów i fluorescencyjnych nanocząstek kompatybilnych z FUEL.

Dyskusja

Podstawową demonstrację FUEL można osiągnąć po prostu poprzez zmieszanie bakterii luminescencyjnych z fluorescencyjnymi nanocząstkami lub QD. Oba podmioty zostaną fizycznie oddzielone i pozostaną poza jakąkolwiek efektywną odległością RET. Trudniejsza jest optymalizacja sygnału FUEL zarówno in vitro , jak i in vivo. W warunkach in vitro , zarówno z obecnym absorberem optycznym, jak i bez niego, zwykle dodanie nadmiaru fluoroforu będzie wystarczające, aby zmaksymalizować odpowiedź FUEL. Jednak przy wysokich stężeniach zjawiska takie jak wygaszanie statyczne lub kolizyjne mogą prowadzić do utraty sygnału fluorescencyjnego. Wykonanie serii rozcieńczeń poprzez niezależną zmianę stężenia źródła luminescencyjnego i fluoroforu pomoże zoptymalizować pożądane stężenia. Ustalenie i optymalizacja FUEL w stężeniach in vivo jest znacznie trudniejsze i wymaga indywidualnego rozpatrzenia każdego przypadku. Stworzenie stanu, w którym źródło luminescencyjne może uzyskać optyczny dostęp do elementu fluorescencyjnego, może być trudne. W związku z tym, począwszy od bezpośredniego współwstrzykiwania dwóch części, można uzyskać informacje na temat powodzenia FUEL w optymalnych warunkach.

Istnieją standardowe protokoły znakowania bakterii i komórek eukariotycznych jednostkami fluorescencyjnymi, takimi jak seria Alexa i QD. Często wymaga to funkcjonalizacji powierzchni lub aktywacji za pomocą przeciwciał, co może prowadzić do niepożądanych efektów, takich jak zmniejszona żywotność komórek lub zmieniona aktywność metaboliczna. Aby temu zaradzić, ważne jest określenie optymalnej ilości potrzebnego przeciwciała lub czynnika aktywującego, który minimalizuje zaburzenia komórkowe, jednocześnie maksymalizując znakowanie fluorescencyjne. Zastosowanie QD jest korzystne ze względu na ich charakterystycznie szerokie widma wzbudzenia, wąskie i przestrajalne widma emisyjne oraz możliwość dużego przesunięcia Stokesa. Jednak QD mogą być cytotoksyczne i mogą nie być pożądane w niektórych przypadkach.

PALIWO jest zjawiskiem obecnym w wielu eksperymentach BRET13 i ma zastosowanie do różnych źródeł luminescencyjnych i fluorescencyjnych. Do tej pory fotony powstające w wyniku FUEL były uważane za produkt niespecyficznych oddziaływań lub niefortunny sygnał tła wynikający ze źle zaprojektowanych eksperymentów BRET. Tylko dzięki eksperymentom przedstawionym tutaj byliśmy w stanie zidentyfikować użyteczność tego niechcianego sygnału. W pokazanych przykładach bakterie luminescencyjne działają jako rozproszone źródło wzbudzenia, zdolne do wywołania standardowej odpowiedzi fluorescencyjnej z szerokiej gamy jednostek fluorescencyjnych. Ponadto, ze względu na znaczną odległość roboczą, można śmiało stwierdzić, że o ile FUEL można zbudować bez występowania BRET, o tyle generalnie nie można zaobserwować BRET bez udziału FUEL. Co ważne, ze względu na brak wymogu celowania, FUEL może być wykorzystany do wypełnienia luki przestrzennej, która istnieje między BRET a konwencjonalnymi technikami obrazowania całego zwierzęcia.

Oświadczenia

Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe. J.D., S.B., K.L.R. i S.L.S. przyczynili się do powstania Europejskiego Patentu EP10290158.4 oraz zgłoszenia patentowego Światowej Organizacji Własności Intelektualnej WO/2011/117847.

Podziękowania

Autorzy pragną wyrazić swoją wdzięczność za wsparcie finansowe od Fundacji Pasteura z Nowego Jorku (dla J.D., C.S., C.S.), programu EU-FP7 "Automatyzacja" (dla S.L.S.), Programu 11 Instytutu Carnota (dla J.D., A.H., A.R., R.T., S.L.S.) oraz Projektu IMNOS (dla R.T., S.L.S.), Conny-Maeve Charitable Foundation (S.L.S.), European Masters in Molecular Imaging (do IT), programy Region Ile de France MODEXA (S.L.S.), SESAME (S.L.S.) i DimMalInf (S.L.S., R.T.), Anr Program Grandes Investissement de l'avenir Infrastructures Nationales en Biologie-Santé: Francja LifebioImaging (FLI) France Life Imaging (R.T., S.L.S.), France Bioimaging (J.D., S.L.S) oraz Instytut Pasteura w Paryżu. Ponadto autorzy pragną podziękować José Bengoechea i Herbertowi Schweizerowi za odczynniki. Ponadto autorzy chcieliby podziękować Cindy Fevre, która wygenerowała przeciwciała.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Escherichia coli wyrażający luxABCDE operon dzięki uprzejmości José A. Bengoechea za zgodą Herberta P. Schweizera
Klebsiella pneumoniae 52145 52145 to szczep referencyjny
Luria Bertani (LB)standardowe podłoże
hodowlane Q-Tracker 705 Q21061MPbiologiczne
Q-Tracker 800Nauki biologiczne
Alexa 555Nauki biologiczneS21381
Alexa 568Nauki biologiczneS11226
Alexa 633Nauki biologiczneS21375
Alexa 700Nauki biologiczneS21383
Mikrosfery niefluorescencyjnePolysciences, Inc15913
Różowe mikrosferyNauki przyrodniczeF8887Średnica 40 nm
Żółte mikrosfery NaukiprzyrodniczeF8888Średnica 40 nm
Ivis SpectrumPerkinElmer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotynaThermo Scientific Pierce21425
Kolumny odsalające Zeba Spin 7K MWCOThermo Scientific Pierce21425
HABA Test Thermo Scientific Pierce28005
BradfordBio-Rad500-0201
o serotypie K2nauki Q21071MP Zestaw testowy

Bibliografia

  1. Hu, K., et al. A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer. J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).
  2. Contag, C. H., et al. Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter. Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).
  3. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  4. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).
  5. Condeelis, J., Weissleder, R. In Vivo Imaging in Cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).
  6. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).
  7. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. 10, (2010).
  8. Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models. Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).
  9. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. Luminescent probes and visualization of bioluminescence. Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).
  10. Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light. Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).
  11. Saito, K., et al. Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging. Nat Commun. 3, 1262(2012).
  12. Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).
  13. Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. The BRET technology and its application to screening assays. Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).
  14. So, M. -K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).
  15. Wu, Q., Chu, M. Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes. Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).
  16. Wu, C., et al. In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).
  17. Piston, D. W., Kremers, G. -J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
  18. Dragavon, J., et al. in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues. , 790210-790219 (2011).
  19. Dragavon, J., et al. In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).
  20. Holland, A. D., et al. In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer. Methods. , (2013).
  21. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).
  22. Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect Immun. 31, 71-77 (1981).
  23. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247, 119-136 (2012).
  24. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).
  25. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria. Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).
  26. Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles. Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).
  27. Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods. Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bioluminescencyjny transfer energii rezonansowejradiacyjna emisja wzbudzeniabakterie bioluminescencyjnekropki kwantowefluorescencyjne nanocz steczkiprzeciwcia a ukierunkowane FUELobrazowy system bioluminescencji ca ego organizmu

Powiązane artykuły