Artykuł metodologiczny

Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo

25.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51557

⸱

3 lipca 2014

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular Pathogenesis, Friedrich-Loeffler-Institut

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje techniki bronchoskopowe w płucach bydlęcych w warunkach eksperymentalnych, tj. inokulację pod kontrolą bronchoskopową, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelową biopsję płuc.

Streszczenie

Trwają poszukiwania alternatywnych modeli zwierzęcych w badaniach nad medycyną układu oddechowego. W zależności od celu badań, duże zwierzęta jako modele chorób płuc często znacznie lepiej przypominają sytuację ludzkiego płuca niż myszy. Praca z dużymi zwierzętami daje również możliwość wielokrotnego pobierania próbek od tego samego zwierzęcia w określonym czasie, co pozwala na długoterminowe badania bez poświęcania zwierząt.

Celem było ustalenie metod pobierania próbek in vivo do wykorzystania w bydlęcym modelu infekcji oddechowej Chlamydia psittaci. Pobieranie próbek powinno być wykonywane w różnych punktach czasowych u każdego zwierzęcia podczas badania, a próbki powinny być odpowiednie do badania reakcji gospodarza, a także patogenu w warunkach doświadczalnych.

Bronchoskopia jest cennym narzędziem diagnostycznym w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej. Jest to zabieg bezpieczny i mało inwazyjny. W artykule opisano inokulację wewnątrzoskrzelową cieląt, a także metody pobierania próbek z dolnych dróg oddechowych. Wideoendoskopowa inokulacja dooskrzelowa prowadzi do bardzo spójnych wyników klinicznych i patologicznych u wszystkich zaszczepionych zwierząt i dlatego dobrze nadaje się do stosowania w modelach zakaźnej choroby płuc. Opisane metody pobierania próbek to płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelowa biopsja płuc. Wszystkie te narzędzia są cennymi narzędziami diagnostycznymi w medycynie ludzkiej i mogą być dostosowane do celów eksperymentalnych u cieląt w wieku 6-8 tygodni. Uzyskane próbki nadawały się zarówno do wykrywania patogenów, jak i charakterystyki nasilenia zapalenia płuc u gospodarza.

Wprowadzenie

Wartości dużych modeli zwierzęcych w badaniach biomedycznych

W nowoczesnych interdyscyplinarnych badaniach biomedycznych, modele zwierzęce są nadal niezbędne do wyjaśnienia złożonych interakcji - związanych ze zdrowiem lub statusem choroby - w organizmach ssaków. Pomimo 17 nagród Nobla przyznanych naukowcom, którzy badali bydło, konie, owce lub drób jako modele do badań biomedycznych1, obecnie zdecydowana większość eksperymentów na zwierzętach jest przeprowadzana na gryzoniach, podczas gdy mniej niż 1% badań dotyczy zwierząt domowych lub gospodarskich.

Małe zwierzęta oferują wiele praktycznych zalet (np. niskie koszty, plastyczność genetyczna, wysoka przepustowość, dostępność licznych genetycznych i immunologicznych narzędzi i zestawów), a genetycznie modyfikowane modele myszy są ogólnie akceptowane do przeprowadzania badań mechanistycznych odkrywających szczególne szlaki molekularne. W badaniach biomedycznych nad złożonymi systemami biologiczne znaczenie i przydatność kliniczna modeli mysich staje się coraz bardziej wątpliwa. Mogą one wprowadzać w błąd i wiązać się z ryzykiem nadmiernego uproszczenia złożoności biologicznej2-9.

Ze względu na międzygatunkowe specyfiki, żaden pojedynczy gatunek zwierząt nie będzie całkowicie odzwierciedlał sytuacji ludzkiej, a użycie więcej niż jednego modelu wydaje się być korzystne w interdyscyplinarnym podejściu do badań biomedycznych. W kontekście medycyny translacyjnej duże zwierzęta mogą służyć jako modele porównawcze, dostarczając wyników o wysokim znaczeniu biologicznym podwójnego zastosowania zarówno dla zdrowia ludzi, jak i zwierząt1. Co ciekawe, ludzki genom jest bardziej podobny do genomu bydła niż do genomu gryzoni laboratoryjnych. Niedawno potwierdzono również, że w porównaniu z innymi taksonami, genom myszy jest znacznie bardziej przegrupowany10-12.

W złożonym projekcie badawczym, wykorzystanie zwierząt gospodarskich oferuje unikalną możliwość wewnątrzindywidualnych, długoterminowych badań poprzez wielokrotne pobieranie różnych próbek in vivo od jednej i tej samej jednostki bez poświęcania zwierzęcia. W związku z tym zmiany czynnościowe, zapalne i morfologiczne mogą być monitorowane u tego samego podmiotu przez pewien okres czasu13.

Płuco bydlęce jako odpowiedni model oddechowy

Ze względu na dużą liczbę istotnych różnic w anatomii płuc, fizjologii układu oddechowego i immunologii płuc, myszy nie odtwarzają wielu ważnych patofizjologicznych aspektów ludzkiej choroby płuc. Należy to wziąć pod uwagę przy stosowaniu ich jako zwierzęcych modeli chorób układu oddechowego2,9,14-16. Chociaż istnieją osobliwości anatomiczne i strukturalne dla każdego płuca ssaka, cechy funkcjonalne (tj. objętość płuc, przepływ powietrza i mechanika oddechowa) są lepiej porównywalne między dorosłymi ludźmi a cielętami ze względu na podobną masę ciała (50-100 kg).

Specyficzne dla gatunku cechy płuca bydlęcego są podsumowane w następujący sposób: lewe płuco składa się z dwóch płatów (lobus cranialis, który jest podzielony na dwa segmenty, i lobus caudalis), podczas gdy prawe płuco składa się z czterech płatów (lobus cranialis, lobus medius, lobus caudalis, i lobus accessorius). W przeciwieństwie do anatomii płuc większości innych ssaków, oskrzela prawego płata czaszki rozgałęziają się bezpośrednio z prawej bocznej strony tchawicy. Jeśli chodzi o anatomię podbrzuszną, płuca bydła charakteryzują się wysokim stopniem zrazikowania i wysokim odsetkiem tkanki śródmiąższowej17,18, co prowadzi do stosunkowo niskiej swoistej podatności płuc i wyższej odporności tkanki płucnej19. W związku z tym wymagana aktywność oddechowa jest dość wysoka w porównaniu z innymi gatunkami20,21. Wysoki stopień zrazienia prowadzi do silnej niezależności segmentów. W ten sposób procesy zapalne są ograniczone przez przegrody tkanki łącznej, a chore i zdrowe segmenty często leżą w tym samym płacie. Ze względu na brak pobocznych dróg oddechowych, płuco bydlęce jest szczególnie odpowiednie do odzwierciedlania obturacyjnych dysfunkcji płuc13. Jeśli chodzi o unaczynienie w płucach bydła, małe tętnice płucne wykazują bardzo wyraźne warstwy mięśni gładkich. Dlatego cielę może również służyć jako dobrze ugruntowany zwierzęcy model nadciśnienia płucnego lub przebudowy naczyń22-24.

Jeśli chodzi o infekcje dróg oddechowych, naturalnie występujące choroby występują u zwierząt gospodarskich, które mają wiele podobieństw do porównywalnej choroby u człowieka. Typowymi przykładami są gruźlica bydła25, infekcje syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) u cieląt26-28 lub naturalnie nabyte infekcje Chlamydia 29. Tak więc duże modele zwierzęce bardzo przypominają sytuację u naturalnego gospodarza. Dlatego są one najbardziej przydatne do badania interakcji gospodarz-patogen i złożonej patofizjologii odpowiadającej im choroby u ludzi30,31.

Jako biologicznie istotny model zakażenia Chlamydia psittaci, wybrano cielęta, ponieważ bydło stanowi naturalnych gospodarzy dla tego patogenu32-35. Informacje uzyskane z tego modelu, w odniesieniu do patogenezy choroby lub możliwych dróg przenoszenia się między zwierzętami a ludźmi, pomogą poszerzyć naszą wiedzę, która będzie miała wpływ zarówno na bydło, jak i człowieka. Model może również pomóc w weryfikacji ogólnie przyjętych i alternatywnych opcji terapeutycznych w zakresie eliminacji zakażeń płucnych C. psittaki, co jest ponownie interesujące zarówno w medycynie weterynaryjnej, jak i ludzkiej.

Techniki stosowane i próbki uzyskiwane z układu oddechowego bydła

Ten artykuł opisuje i ilustruje techniki i metody diagnostyczne stosowane do płuc bydlęcych i używane w naszym modelu do oceny zarówno wpływu patogenu na płuca ssaków, jak i skuteczności interwencji terapeutycznej.

Bronchoskopia jest wykonywana w medycynie ludzkiej od lat 60. i jest uważana za bezpieczną procedurę36. U cieląt eksperymentalną bronchoskopię opisano po raz pierwszy w 1968 roku37. Dooskrzelowe stosowanie patogenów zostało zasugerowane przez Potgietera i wsp. jako niezawodna metoda wywoływania chorób dolnych dróg oddechowych u cieląt38 i jest obecnie szeroko rozpowszechnioną metodą w badaniach bydła34,39,40. Inokulacja dooskrzelowa określonej ilości patogenu pod kontrolą wideoendoskopową pozwala na selektywne umieszczenie czynnika zakaźnego w płucach. Prowadzi to do spójnych wyników klinicznych i patologicznych u wszystkich zwierząt34 i umożliwia ukierunkowane pobieranie próbek z regionów płuc, które prawdopodobnie ulegną zmianie w wyniku narażenia na patogen

.

Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) jest dobrze opisanym wskaźnikiem obecności i nasilenia zapalenia płuc. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) jest standardową procedurą w medycynie ludzkiej w diagnostyce różnych chorób układu oddechowego41. U żywego bydła BAL został wprowadzony przez Wilkie i Markhama pod koniec lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku42. Uznano ją za bezpieczną i powtarzalną technikę badania dolnych dróg oddechowych bydła. Ze względu na brak wystarczających danych na temat parametrów BALF u zdrowych zwierząt, w 1988 roku Pringle i wsp. wykonali BAL na zdrowych cielętach za pomocą elastycznego bronchoskopu światłowodowego. Autorzy zwrócili również uwagę na potrzebę standaryzacji protokołów BAL w warunkach eksperymentalnych w celu uzyskania porównywalnych wyników43. BAL jest nadal stosowany jako metoda pobierania próbek in vivo u cielątw wieku 44-46 lat.

Szczotkowanie oskrzeli jest powszechnie używane w medycynie ludzkiej jako narzędzie diagnostyczne do pobierania próbek zmian nowotworowych lub do analizy mikrobiologicznej36. Do celów badawczych można uzyskać pierwotne hodowle komórkowe komórek nabłonka pobranych metodą szczotkowania cytologicznego47. U bydła opisano stosowanie szczotek oskrzelowych do analizy mikrobiologicznej w celu scharakteryzowania środowiska mikrobiologicznego płuc43.

Przezoskrzelowa biopsja płuc dostarcza próbek tkanki płucnej i jest cennym narzędziem diagnostycznym dla rozlanych chorób płuc u ludzi. Jatrogenna odma opłucnowa i krwotok związany z zabiegiem to powikłania związane z tą techniką. Ich częstość występowania wynosi mniej niż jeden procent u ludzi48. Przezoskrzelowa biopsja płuc nie jest powszechną metodą stosowaną u bydła ze względu na wysoki koszt wymaganego sprzętu i czas potrzebny do uzyskania biopsji. Zamiast tego przezskórne biopsje płuc są wygodniejsze w warunkach polowych49-51.

Protokół

Oświadczenie etyczne
Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z europejskimi i krajowymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach i Ochrony Zwierząt w kraju związkowym Turyngia w Niemczech (numer zezwolenia: 04-004/11). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone pod nadzorem upoważnionego instytucjonalnego Agenta Ochrony Zwierząt. Bronchoskopia była wykonywana wyłącznie w znieczuleniu ogólnym. W trakcie badania dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować dyskomfort czy cierpienie.

Uwagi ogólne
Opisane techniki zostały opracowane dla cieląt w wieku około 6-8 tygodni o wadze około 60-80 kg. W przypadku stosowania u innych dużych gatunków zwierząt lub cieląt różniących się wiekiem i masą ciała, techniki te muszą być dostosowane do wielkości i masy ciała oraz uwzględniać anatomię płuc poszczególnych gatunków zwierząt. Cały używany sprzęt musi być sterylny. Chlamydia psittaci jest bakterią odzwierzęcą, która może powodować choroby układu oddechowego i ogólne u ludzi. Nieptasi szczep C. psittaci DC15 stosowany w niniejszym protokole musi być traktowany zgodnie z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 2. Wszystkie prace z patogenem i zakażonymi zwierzętami należy wykonywać przy użyciu środków ochrony osobistej, takich jak respirator, kombinezon przeciwbryzgłowy, gumowe buty i rękawice. Noszenie odpowiedniej respiratora ma ogromne znaczenie, ponieważ naturalną drogą zakażenia C. psittaci jest choroba układu oddechowego. Opakowanie i etykietowanie próbek musi być zabezpieczone przed środkami dezynfekującymi, ponieważ przed opuszczeniem pomieszczenia dla zwierząt wszystkie rzeczy muszą być poddane działaniu środka dezynfekującego skutecznego przeciwko chlamydiom zgodnie z instrukcjami producenta.

1. Przygotowanie zwierzęcia do bronchoskopii

  1. Określ wagę cielęcia do dawkowania środków znieczulających.
  2. Umieścić dostęp dożylny (IV) w lewej żyle szyjnej.
  3. Najpierw powoli wstrzyknąć ksylazynę (0,2 mg/kg masy ciała) przez około 30 sekund, a następnie, po wystąpieniu sedacji, wstrzyknąć ketaminę (2,0 mg/kg masy ciała).
  4. Podnieś zwierzę na stół i umieść je w prawej bocznej pozycji leżącej. Gdy zwierzę zostanie odpowiednio umieszczone na stole, sprawdź, czy dostęp do kroplówki jest nadal na swoim miejscu i w razie potrzeby wyreguluj go. Podczas znieczulenia regularnie sprawdzaj odruch powiekowy, aby określić głębokość znieczulenia.
  5. Gdy zwierzę zacznie oddychać miarowo, poproś kogoś, aby wyciągnął język i rozciągnął szyję. Umieść wziernik z metalową rurką w pysku zwierzęcia, wykonując lekkie ruchy obrotowe. Popchnij wziernik do przodu pod kontrolą wzroku, używając latarki, aż krtań będzie widoczna.
  6. Utrzymuj znieczulenie przez cały czas trwania procedury endoskopowej, wstrzykując bolus składający się z 7 mg ksylazyny i 70 mg ketaminy w razie potrzeby.

2. Inokulacja (Miejsca Inokulacji: Rysunek 1)

  1. Przygotować 3 strzykawki z inokulum, zawierające 1, 2 i 5 ml inokulum.
  2. Włóż rurkę teflonową do kanału roboczego endoskopu. Rurka nie powinna wystawać z końcówki endoskopu.
  3. Przełóż endoskop przez metalowy wziernik. Nieznaczne korekty wziernika mogą być konieczne, aby umożliwić przejście krtani. Oskrzela tchawicy, które rozgałęzia się na prawą stronę, pomaga wyrównać obraz na monitorze.
  4. Podłączyć strzykawkę z 5 ml inokulum do końca probówki teflonowej. Skieruj probówkę do gałęzi, w których ma zostać zdeponowane inokulum i nałóż żądaną ilość (Prawe płuco: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml i 1,0 ml; Lewe płuco: Lobus cranialis, Pars cranialis: 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1,5 ml). Podłączyć strzykawkę z 1 ml inokulum do probówki, a następnie przejść do oskrzela tchawicy i umieścić inokulum (Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml). Pomocne jest, aby zawsze podchodzić do lokalizacji w tej samej kolejności.
  5. Usuń endoskop i wziernik.
  6. Rozpylić 1 ml inokulum do każdego nozdrza za pomocą aktywatora.
  7. Przynieś zwierzę z powrotem do stajni i ułóż je w pozycji leżącej, aby się obudziło. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki lub w towarzystwie innych zwierząt, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Stajnia rekonwalescencji powinna być klimatyzowana, ponieważ zdolność zwierzęcia do termoregulacji jest zmniejszona w znieczuleniu ogólnym.
    UWAGA: Pierwsze objawy kliniczne powinny wystąpić około 24-36 godzin po inokulacji, w zależności od zastosowanego patogenu.

3. Procedury pobierania próbek (miejsca pobierania próbek: Rysunek 2)

  1. Przygotuj zwierzę zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.6.
  2. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe
    1. Umieścić 5 strzykawek zawierających 20 ml sterylnego izotonicznego roztworu soli fizjologicznej w łaźni wodnej i pozostawić do ogrzania do temperatury około 38 °C.
    2. Wprowadzić cewnik do płukania do kanału roboczego endoskopu, a następnie włożyć endoskop do metalowego wziernika i poruszać się do przodu do głównego oskrzela lewego płuca, aż zostanie osiągnięta "pozycja klinowa", w której endoskop nie może być dalej wysunięty do przodu.
    3. Jedna po drugiej podłącz strzykawki z ciepłym roztworem NaCl do cewnika do płukania, wkraplaj płyn i odsysaj go bezpośrednio. Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego musi być przechowywany w silikonowanych szklanych butelkach i umieszczony na lodzie natychmiast po wyzdrowieniu, aby zapobiec przyczepianiu się makrofagów pęcherzykowych do powierzchni szkła. Zwróć uwagę zarówno na ilość wkroplonej soli fizjologicznej, jak i ilość odzyskanego płynu.
    4. Usunąć cewnik do płukania z kanału roboczego.
  3. Szczotkowanie oskrzeli
    1. Skieruj endoskop do żądanego miejsca pobierania próbek, w opisanym protokole jest to Bifurcatio tchawica.
    2. Przykryj szczoteczkę rurką przed włożeniem jej do kanału roboczego endoskopu, aż końcówka szczoteczki pojawi się na monitorze.
    3. Popchnij szczotkę z plastikową rurką do przodu o około 5 cm i odsłoń ją z plastikowej rurki, popychając uchwyt, a następnie skieruj ją w miejsce, które ma być szczotkowane.
    4. Zetrzyj wezwania nabłonkowe, delikatnie popychając i ciągnąc szczoteczkę do przodu iz powrotem podczas poruszania się po endoskopie, aby zapewnić kontakt między szczoteczką a ścianą oskrzela. Przestań pocierać, gdy wystąpi krwawienie. Przykryj szczotkę rurką przed wyciągnięciem jej z kanału roboczego.
    5. Przygotuj do pięciu rozmazów na szkiełkach mikroskopowych, delikatnie przesuwając szczoteczkę po szkiełku. Utrwalić rozmazy w zimnym metanolu na 10 minut, wysuszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    6. Szczotka może być płukana w różnych mediach, w zależności od przeznaczenia pobieranych komórek. Jeśli wykonujesz wiele szczotkowań tą samą szczoteczką, pamiętaj, aby płukać ją tylko w mediach, które nie podrażniają błony śluzowej.
  4. Biopsja przezoskrzelowa płuca
    1. Skieruj endoskop do żądanego miejsca pobierania próbek, w opisanym protokole jest to Pars caudalis Lobus cranialis. Przed włożeniem kleszczyków do biopsji do kanału roboczego otwórz go i zamknij kilka razy, aby upewnić się, że działa płynnie.
    2. Wciśnij kleszcze do biopsji w gałąź ogonową oskrzela tchawicy, aż pojawi się lekki opór. Cofnij się o 2-3 cm, otwórz kleszcze, popchnij do przodu o około 2 cm, zamknij kleszcze, odciągnij i wyjmij kleszcze z kanału roboczego. Wymaga to pewnej wprawy.
    3. Ostrożnie usuń tkankę z kleszczy biopsyjnych za pomocą igły lub małych kleszczy. W zależności od dalszego wykorzystania tkanki należy ją przechowywać w ciekłym azocie lub odpowiednim podłożu utrwalającym. Powinno to nastąpić zaraz po usunięciu, aby zapobiec procesom autolitycznym.
  5. Leczenie pozabiegowe
    1. Przynieś zwierzę z powrotem do stajni i ułóż je w pozycji leżącej, aby się obudziło. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki lub w towarzystwie innych zwierząt, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Stajnia rekonwalescencji powinna być klimatyzowana, ponieważ zdolność zwierzęcia do termoregulacji jest zmniejszona w znieczuleniu ogólnym.
    2. Uważnie obserwuj zwierzę pod kątem oznak odmy opłucnowej przez następne 24 godziny. Zapewnij mu paszę i świeżą wodę, gdy zwierzę odzyska pełną świadomość.

Wyniki

Przebieg choroby

Wpływ patogenu na stan zdrowia zwierząt można ocenić za pomocą badania klinicznego. W naszych modelach infekcji dróg oddechowych zwierzęta były badane dwa razy dziennie, a obserwacje kliniczne zapisywano przy użyciu systemu punktowego. Dodatkowe informacje pozyskiwano, stosując inne metody pobierania próbek in vivo, np. pobieranie krwi i wymazów lub pomiar funkcji płuc. Badania patomorfologiczne przeprowadzano w różnych punktach czasowych po inokulacji, aby opisać postępy infekcji32-34.

Wskaźnik odzyskania BALF

Wskaźnik odzysku wprowadzonego płynu wyniósł 83,05 ± 4,58% (średnia ± SD).

Wykrywanie patogenów

Rekultywację patogenu można przeprowadzić z materiału pobranego za pomocą szczoteczki oskrzelowej. Możliwe jest również badanie przesiewowe PCR różnych próbek w celu wykrycia patogenu, np. biopsji tkankowej, wymazu cytologicznego, komórek płynu z przemycia bronchoalveolarnego (BALF)52 lub wymazu z gardła. Wizualizacja patogenu jest możliwa poprzez wykonanie immunohistochemii mrożonych przekrojów biopsji płuc oraz preparatów osadowych z komórek BALF (Rysunek 3). W poprzednich eksperymentach wykonano PCR próbek krwi oraz wymazów (z spojówek, kału, nosa), aby scharakteryzować rozprzestrzenianie się i wydalanie patogenu32.

Markery miejscowego stanu zapalnego tkanki płucnej

W płynie z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BALF) można badać różne parametry stanu zapalnego płuc. Całkowita liczba komórek oraz proporcja neutrofili zazwyczaj wzrastają w przypadku wystąpienia stanu zapalnego płuc. W celu różnicowania komórek preparaty osadowe komórek BALF można barwić metodą Giemsy i różnicować przy użyciu imersji olejowej (Rysunek 4). Frakcję komórkową i ciekłą BALF rozdziela się poprzez wirowanie (300 x g; 20 min). Nadfiltr BALF zawiera różne markery, które zmieniają się podczas procesów zapalnych w płucach i mogą być badane w warunkach eksperymentalnych. Przykładami są całkowite białko oraz eikozanoidy29,34.

Schematyczny przegląd potencjalnych dalszych zastosowań opisanych próbek przedstawiono na Rysunku 5.

<b>Schemat anatomii płuc; opisane oskrzela i płaty do celów edukacyjnych.</b>
Rycina 1. Schemat płuca bydlęcego z zaznaczonymi miejscami inokulacji (kolor żółty). Numery wskazują kolejność podawania inokulum do poszczególnych oskrzeli. R: prawy; L: lewy. Płuco prawe: 1 Lobus medius: 0.5 ml, 2 Lobus accessorius: 0.5 ml, 3 Lobus caudalis: 0.5 ml oraz 4 1.0 ml; Płuco lewe: Lobus cranialis, 5 Pars cranialis: 0.5 ml, 6 Pars caudalis: 0.5 ml, 7 Lobus caudalis: 1.5 ml, 8 Lobus cranialis, Pars caudalis: 1.0 ml.

Schemat drenażu limfatycznego płuc z zaznaczonymi drogami węzłów do badań edukacyjnych.
Rysunek 2. Schemat płuca bydła z miejscami inokulacji (żółte) i miejscami pobierania próbek: płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (niebieskie), szczotkowania oskrzeli (zielone) oraz biopsji płuc (pomarańczowe). Należy zwrócić uwagę, że wszystkie próbki pobrano z obszarów, w których wcześniej naniesiono patogen. R: prawy, L: lewy.

Barwione przekroje histologiczne; a) struktura tkanki, b) liczba komórek; obraz mikroskopowy, skala 100 μm.
Rycina 3. a) Biopsja płuca cielęcia zaszczepionego Chlamydia psittaci 4 dni po szczepieniu (dpi), b) osad komórkowy BALF z cielęcia zaszczepionego C. psittaci 9 dpi. Barwienie immunohistochemiczne przeciwko chlamydiom. Wtrącenia chlamydialne (strzałki) obecne są w płucu (a) oraz w makrofagach pęcherzykowych (b). Kontrastowanie hematoksyliną.

Obraz mikroskopowy barwionych ludzkich komórek; skala 20μm; obserwacja struktury komórkowej.
Rycina 4. Osad komórkowy BALF z cielęcia inokulowanego C. psittaci w 9 dpi. Makrofagi pęcherzykowe (#) są dominującym typem komórek w BALF. Liczba granulocytów neutrofilowych (*) wzrasta w obecności procesów zapalnych. Modyfikowane barwienie Pappenheima.

Schemat pobierania próbek z oskrzeli: diagram płukania, szczotkowania i biopsji; obejmuje etapy PCR i mikroskopii.
Rycina 5. Możliwe metody przygotowania próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opracowano bronchoskopową metodę inokulacji i dostosowano różne bronchoskopowe metody pobierania próbek do stosowania u dużych zwierząt w warunkach doświadczalnych. Opisane techniki są łatwe do nauczenia, nawet dla egzaminatorów z niewielkim doświadczeniem w endoskopii. Proces bronchoskopii jest minimalnie inwazyjny i u żadnego ze zwierząt nigdy nie zaobserwowano żadnych działań niepożądanych związanych z metodami inokulacji, a także opisanymi metodami pobierania próbek (BAL, przezoskrzelowa biopsja płuc, szczotkowanie oskrzeli). Powikłania związane z przezoskrzelową biopsją płuc u ludzi to krwawienie i odma opłucnowa48, żadnego z nich nie zaobserwowano u cieląt, które przeszły tę procedurę. Biopsja przezoskrzelowa płuca jest bardziej czasochłonna i wymaga większej ilości sprzętu niż metoda przezskórna, ale jest mniej inwazyjna i nie niesie ze sobą ryzyka zakażenia rany.

Kontrolowana wizualnie, endoskopowa metoda inokulacji pozwala na osadzenie określonej ilości patogenu w określonych miejscach płuc. W ten sposób prowadzi to do bardzo spójnych objawów klinicznych i patologicznych u wszystkich zaszczepionych zwierząt32-34. Nie przypomina jednak wszystkich cech naturalnej infekcji u cieląt. W modelu zakażenia C. psittaci układu oddechowego opisana technika inokulacji doprowadziła do zmian w płucach związanych z miejscami rozmieszczenia patogenu34, podczas gdy w zakażeniach nabytych naturalnie u cieląt zwykle rozwija się zapalenie płuc płatów wierzchołkowych. Fakt ten należy wziąć pod uwagę przy interpretacji znaczenia wyników doświadczeń doświadczalnych w kontekście naturalnie nabytych zakażeń płuc u bydła.

Wideoendoskopowy BAL umożliwia pobranie próbki z określonego obszaru płuc. Do celów eksperymentalnych jest to zaleta w porównaniu z użyciem cewnika do nosa w warunkach ślepoty. Ze względu na anatomię płuca bydlęcego, ślepo wprowadzony cewnik byłby w większości przypadków wepchnięty do prawego płata przepony53,54 i badający nie ma wpływu na obszar płuca, który jest płukany. Kolejną zaletą endoskopowego BAL u znieczulonych cieląt w pozycji leżącej bocznej jest wysoki średni wskaźnik odzysku wkroplonego płynu wynoszący ponad 80%. Porównanie z innymi badaniami pokazuje, że u cieląt w pozycji stojącej, poddanej sedacji, odnotowano powrót do zdrowia 133,3 ± 1,6 ml 46 i 127,13 ± 3,53 ml 45 po wkropleniu 240 ml płynu do płata ogonowego. U cieląt w pozycji leżącej mostka można było odzyskać 51% wkroplonego płynu z płata czaszki i 62% z płata ogonowego43. Oznacza to, że około połowa wkroplonego płynu może zostać odzyskana w pionowej pozycji łydki. W zależności od ilości BALF potrzebnej do dalszego przygotowania próbki, może to nie pozostawić wystarczającej ilości materiału do przeprowadzenia wszystkich pożądanych eksperymentów. BAL u bydła był stosowany przez wiele grup badawczych i badano wiele różnych parametrów w różnych warunkach. Większość autorów wykonywała płukanie płatów podstawy43,45,46, ale ilość płynu użytego do płukania różni się w zależności od grupy badawczej. Prowadzi to do niespójności w rozcieńczaniu odzyskanych komórek, białek i innych substancji, co utrudnia porównywanie wyników z różnych publikacji. Dlatego do stosowania u bydła zaleca się płukanie pięcioma frakcjami po 20 ml (tj. łącznie 100 ml) izotonicznego roztworu soli fizjologicznej o pojemności 20 ml (tj. łącznie 100 ml), które są odzyskiwane natychmiast po wkropleniu. W przypadku stosowania cewnika do płukania o dużej średnicy (tj. >2 mm) objętość każdej frakcji należy nieznacznie zwiększyć, w zależności od ilości płynu, który pozostanie w cewniku.

Wysoce segmentowa anatomia płuca bydła prowadzi do metodycznego ograniczenia; Wyniki uzyskane z jednej części płuca mogą nie być prawdziwe dla pozostałej części płuca. Ponieważ nie ma kontroli wzroku całego obszaru płuc badanego za pomocą biopsji przezoskrzelowej i płukania, egzaminator nie może stwierdzić, czy pobrane obszary były zdrowe, czy chore. Dlatego bardzo ważne jest pobieranie próbek z miejsc, w których patogen był wcześniej inokulowany, aby uzyskać wyższy wskaźnik wyzdrowienia patogenu i mieć większą możliwość pobrania próbek z chorych obszarów płuc. Kolejnym ograniczeniem jest zwiększone ryzyko znieczulenia u zwierząt o złym stanie klinicznym. Opisane metody powinny być stosowane wyłącznie w modelach łagodnej do umiarkowanej choroby, aby utrzymać obciążenie zwierząt na jak najniższym poziomie. Znieczulenie ogólne u przeżuwaczy powinno być zawsze jak najkrótsze, ponieważ wytwarzanie się gazów w żwaczu zwiększa ryzyko znieczulenia u tych gatunków. Zwierzęta muszą być umieszczone w pozycji leżącej natychmiast po bronchoskopii, aby umożliwić wypływ wytworzonego gazu i muszą być ściśle monitorowane aż do całkowitego wyzdrowienia po znieczuleniu. Opisane techniki nie są również odpowiednie dla interwałów pobierania próbek krótszych niż 24 godziny.

Opisany protokół może być dostosowany do innych czynników zakaźnych. Opisano endoskopowe inokulacje różnych patogenów, takich jak C. psittaci32-34, Pasteurella haemolytica38-40,42, Haemophilus somni55 i wirus wirusowej biegunki bydła44. Również miejsca odkładania się patogenów w płucach można dostosować do pożądanego modelu. Przy wyborze miejsc pobierania próbek należy wziąć pod uwagę kilka ważnych faktów: (i) Miejsca pobierania próbek powinny być wybierane na podstawie miejsc inokulacji i spodziewanych zmian patologicznych. (ii) Gdy ma zostać przeprowadzona sekcja zwłok, należy dołożyć starań, aby pozostawić wystarczającą ilość niepobranych próbek do pobrania próbek ex vivo . (iii) Miejsca pobierania próbek muszą być wybrane w taki sposób, aby można było do nich dotrzeć ze sprzętem. Szczególnie w przypadku przezoskrzelowej biopsji płuc istnieją ograniczenia ze względu na długość kleszczy biopsyjnych. (iv) Kolejność pobierania próbek jest ważna, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelowa biopsja płuc mogą prowadzić do niewielkiego krwawienia, które mogłoby zanieczyścić BALF. Dlatego BALF musi być zawsze najpierw uzyskany. W przypadku stosowania protokołu u innych gatunków należy wziąć pod uwagę anatomię płuc specyficzną dla danego gatunku.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są bardzo wdzięczni Federalnemu Ministerstwu Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) Niemiec za finansowanie ich pracy. Autorzy dziękują również Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolfowi Rücknagelowi i wszystkim innym kolegom pracującym w zespole animal house (FLI, Niemcy) za ich pomoc techniczną przy bronchoskopii. Są bardzo wdzięczni Marii-Christinie Haase (FLI, Niemcy) za pomoc w dostarczaniu literatury. Ponadto autorzy pragną wyrazić wdzięczność dr Angeli Berndt (FLI, Niemcy) i Nicolette Bestul (University of Wisconsin-River Falls) za krytyczną lekturę manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Weterynaryjny wideoendoskopKarl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, NiemcyPV-SG 22– 140średnica: 9 mm, kanał roboczy: 2,2 mm, długość robocza 140 cm
Cewnik do myciaKarl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Niemcyśrednica: 2 mm; długość: 180 cm, Adapter Luer-lock
SiłownikWEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Niemcy32660długość: 60 mm
Kleszczyki do biopsjiKarl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, NiemcyREF 60180LT1,8 mm, ząbkowane, owalne
Omnifix 20 ml, Luer-LockB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy4617207V
Szczoteczka do cytologiimtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Niemcy110240-10długość robocza 180 cm, długość szczotki: 15 mm, średnica 1,8 mm
iv acessHenry Schein Vet GmbH, Hamburg, Niemcy370-211średnica: 1,2 mm; długość: 43 mm
Rompun 2% (xylazin)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy0,2 mg/kg masy ciała
Ketamin 10% (ketamina)bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Niemcy2,0 mg/kg masy ciała
Izotoniczny roztwór soliB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy
SUB 6 kąpiel wodnaCLF analytische Laborgerä te GmbH, Emersacker, Niemcyn/a
Wziernik z metalowej rurkin/adotyczyśrednica: 3,5 cm; długość: 35 cm
Latarkan/a/d
Butelki ze szkła silikonowanegoniedotyczysilikonu z Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)
Omnifix Luer 3 mlB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy4616025V
Omnifix Luer 5 mlB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy4616057V
Zatyczki uszczelniająceHenry Schein Vet GmbH, Hamburg, Niemcy900-3057
Inokulumn/arozcieńczony patogen w 8 ml buforze
fizjologicznej 3200950 nie n

Bibliografia

  1. Ireland, J. J., Roberts, R. M., Palmer, G. H., Bauman, D. E., Bazer, F. W. A commentary on domestic animals as dual-purpose models that benefit agricultural and biomedical research. Journal of animal science. 86, 2797-2805 (2008).
  2. Persson, C. G. Con: mice are not a good model of human airway disease. American journal of respiratory and critical care medicine. 166, 6-7 (2002).
  3. Haley, P. J. Species differences in the structure and function of the immune system. Toxicology. 188, 49-71 (2003).
  4. Hein, W. R., Griebel, P. J. A road less travelled: large animal models in immunological research. Nature reviews. Immunology. 3, 79-84 (2003).
  5. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
  6. Elferink, R. O., Beuers, U. Are pigs more human than mice. Journal of hepatology. 50, 838-841 (2009).
  7. Jawien, J., Korbut, R. The current view on the role of leukotrienes in atherogenesis. Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society. 61, 647-650 (2010).
  8. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3507-3512 (2013).
  9. Pabst, R. Allergy and Allergic Diseases. 1, (2009).
  10. Bovine Genome, S., et al. The genome sequence of taurine cattle: a window to ruminant biology and evolution. Science. 324, 522-528 (2009).
  11. Tellam, R. L., et al. Unlocking the bovine genome. BMC genomics. 10, 193 (2009).
  12. Graphodatsky, A. S., Trifonov, V. A., Stanyon, R. The genome diversity and karyotype evolution of mammals. Molecular cytogenetics. 4, 22 (2011).
  13. Kirschvink, N., Reinhold, P. Use of alternative animals as asthma models. Current drug targets. 9, 470-484 (2008).
  14. Coleman, R. A. Of mouse and man--what is the value of the mouse in predicting gene expression in humans. Drug discovery today. 8, 233-235 (2003).
  15. Kips, J. C., et al. Murine models of asthma. The European respiratory journal. 22, 374-382 (2003).
  16. Coraux, C., Hajj, R., Lesimple, P., Puchelle, E. In vivo models of human airway epithelium repair and regeneration. European Respiratory Review. 14, 131-136 (2005).
  17. McLaughlin, R. F., Tyler, W. S., Canada, R. O. A Study of the Subgross Pulmonary Anatomy in Various Mammals. American Journal of Anatomy. , 149-165 (1961).
  18. Robinson, N. E. Some functional consequences of species differences in lung anatomy. Adv Vet Sci Comp Med. 26, 1-33 (1982).
  19. Lekeux, P., Hajer, R., Breukink, H. J. Effect of Somatic Growth on Pulmonary-Function Values in Healthy Friesian Cattle. Am J Vet Res. 45, 2003-2007 (1984).
  20. Veit, H. P., Farrell, R. L. The anatomy and physiology of the bovine respiratory system relating to pulmonary disease. Cornell Vet. 68, 555-581 (1978).
  21. Gallivan, G. J., McDonell, W. N., Forrest, J. B. Comparative pulmonary mechanics in the horse and the cow. Res Vet Sci. 46, 322-330 (1989).
  22. Hunter, K. S., et al. In vivo measurement of proximal pulmonary artery elastic modulus in the neonatal calf model of pulmonary hypertension: development and ex vivo validation. Journal of applied physiology. 108, 968-975 (2010).
  23. Stenmark, K. R., et al. Severe pulmonary hypertension and arterial adventitial changes in newborn calves at 4,300 m. Journal of applied physiology. 62, 821-830 (1987).
  24. Tian, L., et al. Impact of residual stretch and remodeling on collagen engagement in healthy and pulmonary hypertensive calf pulmonary arteries at physiological pressures. Annals of biomedical engineering. 40, 1419-1433 (2012).
  25. Van Rhijn, I., Godfroid, J., Michel, A., Rutten, V. Bovine tuberculosis as a model for human tuberculosis: advantages over small animal models. Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 711-715 (2008).
  26. Otto, P., et al. A model for respiratory syncytial virus (RSV) infection based on experimental aerosol exposure with bovine RSV in calves. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 19, 85-97 (1996).
  27. Gershwin, L. J., et al. A bovine model of vaccine enhanced respiratory syncytial virus pathophysiology. Vaccine. 16, 1225-1236 (1998).
  28. Gershwin, L. J. Immunology of bovine respiratory syncytial virus infection of cattle. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases. 35, 253-257 (2012).
  29. Jaeger, J., Liebler-Tenorio, E., Kirschvink, N., Sachse, K., Reinhold, P. A clinically silent respiratory infection with Chlamydophila spp. in calves is associated with airway obstruction and pulmonary inflammation. Veterinary research. 38, 711-728 (2007).
  30. Martinez-Olondris, P., Rigol, M., Torres, A. What lessons have been learnt from animal models of MRSA in the lung. The European respiratory journal. 35, 198-201 (2010).
  31. Sadowitz, B., Roy, S., Gatto, L. A., Habashi, N., Nieman, G. Lung injury induced by sepsis: lessons learned from large animal models and future directions for treatment. Expert review of anti-infective therapy. 9, 1169-1178 (2011).
  32. Ostermann, C., et al. Infection, Disease, and Transmission Dynamics in Calves after Experimental and Natural Challenge with a Bovine Chlamydia psittaci Isolate. PloS one. 8, (2013).
  33. Ostermann, C., Schroedl, W., Schubert, E., Sachse, K., Reinhold, P. Dose-dependent effects of Chlamydia psittaci infection on pulmonary gas exchange, innate immunity and acute-phase reaction in a bovine respiratory model. Vet J. 196, (2012).
  34. Reinhold, P., et al. A bovine model of respiratory Chlamydia psittaci infection: challenge dose titration. PloS one. 7, (2012).
  35. Reinhold, P., Sachse, K., Kaltenboeck, B. Chlamydiaceae in cattle: commensals, trigger organisms, or pathogens. Vet J. 189, 257-267 (2011).
  36. Dionisio, J. Diagnostic flexible bronchoscopy and accessory techniques. Revista portuguesa de pneumologia. 18, 99-106 (2012).
  37. Hilding, A. C. Experimental bronchoscopy: resultant trauma to tracheobronchial epithelium in calves from routine inspection. Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol. 72, 604-612 (1968).
  38. Potgieter, M. M., Hopkins, F. M., Walker, R. D., Guy, J. S. Use of fiberoptic bronchoscopy in experimental production of bovine respiratory tract disease. Am J Vet Res. 45, 1015-1019 (1984).
  39. Ackermann, M. R., Kehrli Jr, M. E., Brogden, K. A. Passage of CD18- and CD18+ bovine neutrophils into pulmonary alveoli during acute Pasteurella haemolytica pneumonia. Veterinary pathology. 33, 639-646 (1996).
  40. Malazdrewich, C., Ames, T. R., Abrahamsen, M. S., Maheswaran, S. K. Pulmonary expression of tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 in the acute phase of bovine pneumonic pasteurellosis. Veterinary pathology. 38, 297-310 (2001).
  41. Wells, A. U. The clinical utility of bronchoalveolar lavage in diffuse parenchymal lung disease. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society. 19, 237-241 (2010).
  42. Wilkie, M. R. Sequential titration of bovine lung and serum antibodies after parenteral or pulmonary inoculation with Pasteurella haemolytica. Am J Vet Res. 40, 1690-1693 (1979).
  43. Pringle, J. K., et al. Bronchoalveolar lavage of cranial and caudal lung regions in selected normal calves: cellular, microbiological, immunoglobulin, serological and histological variables. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 52, 239-248 (1988).
  44. Silflow, R. M., Degel, P. M., Harmsen, A. G. Bronchoalveolar immune defense in cattle exposed to primary and secondary challenge with bovine viral diarrhea virus. Veterinary immunology and immunopathology. 103, 129-139 (2005).
  45. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Caswell, J. L. Alterations in the bovine bronchoalveolar lavage proteome induced by dexamethasone. Veterinary immunology and immunopathology. 118, 283-293 (2007).
  46. Mitchell, G. B., Clark, M. E., Siwicky, M., Caswell, J. L. Stress alters the cellular and proteomic compartments of bovine bronchoalveolar lavage fluid. Veterinary immunology and immunopathology. 125, 111-125 (2008).
  47. Lordan, J. L., et al. Cooperative effects of Th2 cytokines and allergen on normal and asthmatic bronchial epithelial cells. J Immunol. 169, 407-414 (2002).
  48. Tukey, M. H., Wiener, R. S. Population-based estimates of transbronchial lung biopsy utilization and complications. Respiratory medicine. 106, 1559-1565 (2012).
  49. Braun, U., Estermann, U., Feige, K., Sydler, T., Pospischil, A. Percutaneous lung biopsy in cattle. Journal of the American Veterinary Medical Association. 215, 679-681 (1999).
  50. Burgess, B. A., et al. The development of a novel percutaneous lung biopsy procedure for use on feedlot steers. Canadian journal of veterinary research = Revue canadienne de recherche veterinaire. 75, 254-260 (2011).
  51. Sydler, T., Braun, U., Estermann, U., Pospischil, A. A comparison of biopsy and post-mortem findings in the lungs of healthy cows. Journal of veterinary medicine. A, Physiology, pathology clinical medicine. 51, 184-187 (2004).
  52. Voigt, K., et al. PCR examination of bronchoalveolar lavage samples is a useful tool in pre-clinical diagnosis of ovine pulmonary adenocarcinoma (Jaagsiekte). Research in Veterinary Science. 83, 419-427 (2007).
  53. Caldow, G. Bronchoalveolar lavage in the investigation of bovine respiratory disease. In Practice. 1, 41-43 (2001).
  54. Heilmann, P., Müller, G., Reinhold, P. Bronchoscopy and Segmental Bronchoalveolar Lung Lavage of Anesthetised Calf. Monatsh. Veterinärmed. 43, 79-84 (1988).
  55. Gogolewski, R. P., et al. Protective ability and specificity of convalescent serum from calves with Haemophilus somnus pneumonia. Infection and immunity. 55, 1403-1411 (1987).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p ukanie oskrzelowo p cherzykoweszczotkowanie oskrzeliprzezoskrzelowa biopsja p ucChlamydia psittaciinterakcja gospodarz patogenwielokrotne pobieranie pr bek

Powiązane artykuły