Ten protokół opisuje wykrywanie wirusa cytomegalii metodą qPCR w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie, co jest szybkie, czułe, specyficzne i przydatne do interpretacji niejednoznacznych wzorców barwienia hematoksyliną i eozyną lub immunohistochemicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kluczowe jest zidentyfikowanie zakażenia wirusem cytomegalii (CMV) w przewodzie pokarmowym (GI) pacjentów z obniżoną odpornością, biorąc pod uwagę ich większe ryzyko rozwoju ciężkiej infekcji. Opracowano wiele metod laboratoryjnych do wykrywania zakażenia CMV, w tym serologię, hodowlę wirusa i metody molekularne. Często metody te odzwierciedlają ogólnoustrojowe zajęcie CMV i nie identyfikują jednoznacznie miejscowego zajęcia tkanki. W związku z tym wykrywanie zakażenia CMV w przewodzie pokarmowym jest często wykonywane za pomocą tradycyjnej histologii tkanki biopsyjnej. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w połączeniu z immunohistochemią (IHC) pozostało podstawą badania tych biopsji. H&E i IHC czasami skutkują nietypowymi (niejednoznacznymi) wzorami barwienia, co utrudnia interpretację. Wykazano, że ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) w kierunku CMV może być z powodzeniem przeprowadzana na tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE) o bardzo wysokiej czułości i swoistości. Celem tego protokołu jest pokazanie, jak wykonywać testy qPCR w celu wykrycia CMV w tkance biopsji FFPE w klinicznych warunkach laboratoryjnych. Metoda ta może być bardzo korzystna dla pacjentów w przypadkach niejednoznacznego barwienia CMV w biopsjach przewodu pokarmowego.
Wprowadzenie
Interpretacja zakażenia wirusem cytomegalii (CMV) w próbkach klinicznych jest niezwykle ważna. CMV należy do podrodziny herpesvirinae herpeswirusów. Podobnie jak inne herpeswirusy, CMV ma zdolność do tworzenia trwałej lub utajonej infekcji charakteryzującej się brakiem aktywnej replikacji wirusa1. Reaktywacja wirusa może nastąpić w okresach stresu lub innej immunosupresji, co prowadzi do aktywnej replikacji wirusa charakteryzującej się uwalnianiem wirionu, któremu mogą towarzyszyć objawy choroby2-4. Objawy choroby CMV w przewodzie pokarmowym (GI) często obejmują ból brzucha i/lub krwawe stolce1.
Rozpoznanie zapalenia żołądka i jelit CMV za pomocą histologii wykorzystuje hematoksylinę i eozynę (H&E) do identyfikacji inkluzji wirusa CMV. W przypadkach, gdy podejrzenie kliniczne jest wysokie, ale nie obserwuje się żadnych oczywistych inkluzji, immunohistochemia (IHC) jest często stosowana jako metoda badania uzupełniającego. Jednak IHC może być również utrudnione przez rzadkie, nieklasyczne wzorce barwienia komórkowego (niejednoznaczne), co utrudnia interpretację (ryc. 2)5. Starano się wykorzystać DNA wyekstrahowane z tkanki biopsji przewodu pokarmowego utrwalonego w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE) oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) do wykrywania CMV w biopsjach przewodu pokarmowego. Wykazano, że technika ta jest cenna w wykrywaniu CMV w biopsjach przewodu pokarmowego i jest szczególnie pomocna w przypadkach niejednoznacznego barwienia IHC5,6. Wykazano również, że qPCR dobrze koreluje z dodatkowymi danymi klinicznymi z testów CMV, gdy są one dostępne6. Zastosowanie qPCR w wykrywaniu CMV może prowadzić do wcześniejszej diagnozy i leczenia w przypadkach, gdy kliniczne podejrzenie CMV jest wysokie, ale H&E i CMV IHC są ujemne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Za zgodą Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej, przeprowadzono przeszukiwanie elektronicznej bazy danych laboratorium w celu zidentyfikowania bloków utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) reprezentujących przypadki zakażenia wirusem cytomegalii (CMV) w biopsjach przewodu pokarmowego (GI) rozpoznanych przez histopatologię (hematoksylina i eozyna (H&E) i/lub immunohistochemia (IHC)).
1. Przetwarzanie tkanek z tkanek biopsyjnych FFPE GI
- Pobrać bloki tkanek z biopsji przewodu pokarmowego FFPE pod kątem ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) wirusa cytomegalii (CMV). Bloki te są przechowywane w temperaturze pokojowej.
- Wstępnie oznacz probówki do mikrofuge o pojemności 1,7 ml unikalnym numerem identyfikacyjnym bloku.
- Zablokuj pokrętło mikrotomu.
- Umieść blok tkanki w kasecie clamp.
- Używając świeżego, nieużywanego ostrza, dopasuj blok do kąta noża na mikrotomie.
- Dostosuj mikrotom, aby ciąć odcinki o grubości 10 μm.
- Odblokuj pokrętło i przesuń klocek w kierunku ostrza.
- Wytnij 5 odcinków bloku w odstępach o grubości 10 μm, pozwalając każdemu cięciu zwinąć się w zwój tkanki. Upewnij się, że każdy zwój zawiera odpowiednią reprezentację pożądanych tkanek z biopsji.
- Zablokuj pokrętło mikrotomu.
- Za pomocą kleszczy umieść wszystkie 5 zwojów tkanki we wstępnie oznakowanej probówce wirówkowej, uważając, aby manipulować zwojem tylko za pomocą parafiny, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Zatrzaśnij nakrętkę na tubie i umieść ją z powrotem na stojaku.
- Usuń blok tkankowy z mikrotomu.
- Wyjmij i wyrzuć ostrze.
- Odkazić wszelkie powierzchnie lub narzędzia, które mogły mieć kontakt z poprzednią tkanką.
- Umieść świeże, nieużywane ostrze w uchwycie noża.
- Powtórz kroki 1.4-1.14 dla każdego dodatkowego bloku, który ma zostać przetworzony. Probówki do mikrofuge zawierające zwoje tkankowe mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej do czasu ekstrakcji DNA.
2. Ekstrakcja DNA ze zwojów tkanki biopsji przewodu pokarmowego FFPE
UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z ulotki dołączonej do zestawu do ekstrakcji DNA tkanek FFPE (UWAGA: patrz Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS)).
- Dodaj 1 ml ksylenu (UWAGA: patrz karta charakterystyki) do każdej probówki do mikrofuge próbki. Zamknij pokrywkę i energicznie wiruj przez 10 sekund.
- Kontynuuj ekstrakcję DNA zgodnie z opisem w ulotce produktu producenta, z następującymi modyfikacjami.
- Najpierw dodaj 6 μl kontroli wewnętrznej (IC) do każdej probówki do mikrofuge.
- Po inkubacji ATL/proteinazy K w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę, inkubować w temperaturze 99 °C przez 30 minut, a nie w temperaturze 90 °C przez 1 godzinę.
- Podczas ostatniego etapu elucji DNA ostrożnie otwórz pokrywę kolumny oczyszczającej DNA i nałóż 50 μl destylowanej wody wolnej od DNAzy/RNAzy na środek błony, zamiast buforować ATE.
UWAGA: Zapoznaj się z ulotką dołączoną do opakowania, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego przechowywania i przygotowania odczynników. DNA powinno zostać wyekstrahowane ze wszystkich 5 zwojów FFPE. Wszystkie etapy wirowania należy wykonać w temperaturze pokojowej (15-25 °C).
3. qPCR dla CMV
- Procedura reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)
- Wygeneruj arkusz PCR programu Excel dla przebiegu testu CMV. Ten arkusz programu Excel oblicza całkowitą ilość każdego odczynnika potrzebnego do przygotowania mieszanki głównej z Mg. Mnoży ilość każdego odczynnika potrzebnego na próbkę (wymienioną poniżej) razy liczbę próbek i próbek kontrolnych plus jeden (w celu skompensowania strat spowodowanych pipetowaniem).
- Włączyć następujące odczynniki do każdej reakcji PCR we wskazanej ilości:
Ilość odczynnika na próbkę
CMV LC master mix fiolka 12,5 μl
Mg Roztwór żółty fiolka 2,5 μl
Objętość całkowita: 15,0 μl
- Włączyć następujące odczynniki do każdej reakcji PCR we wskazanej ilości:
- W każdym teście należy przeprowadzić kontrolę wody lub brak celu (NTC), kontrolę ujemną, niską kontrolę pozytywną, wysoką kontrolę pozytywną oraz QS3 lub QS4 oraz wszystkie próbki pacjentów. Kapilary należy ustawić w tej kolejności.
- Zaopatrzyć się w blok chłodzący specyficzny dla przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym, który jest przechowywany w temperaturze 4 °C. Umieścić odpowiednie rurki kapilarne w bloku chłodzącym. Nie dotykaj powierzchni rurek kapilarnych. Podczas pracy z naczyniami włosowatymi należy zawsze używać rękawiczek.
- Ustaw wszystkie reakcje łańcuchowe polimerazy w czystym okapie, niezanieczyszczonym produktami wzmacniającymi.
- Wyjmij odpowiednią liczbę fiolek głównych z zestawu do PCR, aby przetestować wszystkie próbki pacjenta oraz 5 próbek kontrolnych. Pozwól, aby fiolki główne, roztwór Mg i woda klasy PCR rozmroziły się w bloku chłodzącym. Każda fiolka wzorcowa zawiera wystarczającą ilość odczynników do przeprowadzenia 12 testów.
- Delikatnie zwiruj fiolki główne i szybko odwiruj je w wirówce z maksymalną prędkością.
- Połączyć zawartość każdej fiolki wzorcowej w jedną fiolkę i ponownie delikatnie wprowadzić wir.
- Połącz mieszaninę wzorcową i roztwór Mg w ilościach wskazanych w arkuszu PCR w jednej sterylnej probówce do mikrofuge.
- Delikatnie wymieszać i podatkować 15 μl mieszanki wzorcowej z Mg do każdej rurki kapilarnej, z wyjątkiem kapilary w pozycji 5, która jest przeznaczona dla wzorca oznaczalności (QS).
- Przenieść blok chłodzący zawierający rurki kapilarne i mieszanie główne z Mg z czystego okapu do okapu technologicznego.
- Dodać 2 μl kontroli wewnętrznej (IC) do pozostałych 30 μl mieszanki wzorcowej z Mg. Delikatnie wymieszać i podsycić 15 μl do kapilary w pozycji 5 (pozycja dla QS).
- Pobrać pipetą 10 μl wody, kontrolnego DNA lub próbki DNA do odpowiedniej rurki kapilarnej. Zakryj rurki kapilarne za pomocą narzędzia do zamykania.
- Przenieś blok chłodzący/próbki do urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym.
- Wygeneruj arkusz PCR programu Excel dla przebiegu testu CMV. Ten arkusz programu Excel oblicza całkowitą ilość każdego odczynnika potrzebnego do przygotowania mieszanki głównej z Mg. Mnoży ilość każdego odczynnika potrzebnego na próbkę (wymienioną poniżej) razy liczbę próbek i próbek kontrolnych plus jeden (w celu skompensowania strat spowodowanych pipetowaniem).
- Zaprogramuj instrument do PCR w czasie rzeczywistym (patrz Tabela 1)
- Amplifikacja i detekcja wykonywane na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym
- Zaloguj się do komputera
- Kliknij dwukrotnie ikonę instrumentu i zaloguj się do oprogramowania.
- Włącz instrument do PCR w czasie rzeczywistym
- Kliknij "CMV/EBV" na ekranie przednim.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora makr.
- Zaznacz to pole, aby uruchomić autotest po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie. Autotest należy wykonywać raz dziennie, gdy urządzenie jest w użyciu.
- Nazwij przebieg.
- Dostosuj liczbę próbek znajdującą się w lewym górnym rogu strony do sumy osób z grupy kontrolnej i pacjentów uwzględnionych w przebiegu i wprowadź numer identyfikacyjny każdej próbki pacjenta.
- Kliknij zakładkę "Abs Quant".
- W sekcji "Typ próbki" przypisz odpowiedni typ próbki dla normy.
- Wpisz oczekiwane stężenia dla wzorca oznaczalności (QS).
- Wyjmij rurki kapilarne z bloku chłodzącego i umieść je w odpowiedniej pozycji w karuzeli (próbka bloku chłodzącego #1 powinna być umieszczona w pozycji #1 na karuzeli itp.).
- Umieść karuzelę w wirówce urządzenia i naciśnij start.
- Otwórz wirówkę i wyjmij karuzelę.
- Umieść karuzelę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. Zamknij pokrywę.
- Naciśnij "Rozpocznij bieg".
- Przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym sprawdzi każdą pozycję dla próbki. Nie odchodź od instrumentu, dopóki ta kontrola nie zostanie zakończona, zwłaszcza jeśli jedna z naczyń włosowatych nie znajduje się w karuzeli. Przyrząd odnotuje to i zapyta, czy bieg ma być kontynuowany. Odpowiedz tak przed wyjazdem.
- Po zakończeniu przebiegu zamknij wygenerowany raport.
- Kliknij "Bezwzględna ocena ilościowa".
- Kliknij strzałkę obok opcji Kompensacja kolorów.
- Kliknij "Wybierz kompensację kolorów" z listy rozwijanej.
- Wybierz najbardziej aktualny plik kompensacji kolorów, który ma zostać zastosowany do przebiegu.
- Kliknij OK, gdy pojawi się okno.
- Kliknij strzałkę obok opcji Krzywa standardowa.
- Wybierz "użyj zewnętrznego" z menu rozwijanego.
- Wybierz bieżący plik zewnętrznej krzywej standardowej, a następnie kliknij przycisk OK.
- Przyjrzyj się każdej krzywej w menu Kwantyfikacja bezwzględna, aby upewnić się, że obecne są krzywe, a nie płaska linia, jeśli przypisano stężenie. Kwantyfikacja bezwzględna dla modelu 705/Back 530 jest analizowana automatycznie.
- Kontrola jakości
- Generuj nową krzywą wzorcową za każdym razem, gdy otrzymany zostanie nowy numer partii odczynników lub co sześć miesięcy, w zależności od tego, co dzieje się częściej.
- Dodać 10 μl każdego wzorca do mieszanki wzorcowej z Mg. Wzorce dołączone do zestawu należy traktować jako uprzednio wyekstrahowane DNA.
- Dodać 1 μl kontroli wewnętrznej dla każdego wzorca do mieszanki wzorcowej z Mg użytej do wygenerowania krzywej wzorcowej w celu zapewnienia dokładnej oceny ilościowej. Nie dodawaj IC do mieszanki głównej z Mg dla kontroli bez matrycy (NTC).
- Przygotować NTC i trzy powtórzenia wzorców ilościowych QS 4, 3, 2, 1 oraz rozcieńczenie QS4 w stosunku 1:10 dla serii w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, sumując się w 16 punktach danych.
- Wybierz "replikuj" z menu rozwijanego, aby uzyskać powtarzające się standardy
- Wybierz kanał 530/back none i włącz kompensację kolorów podczas analizy przebiegu,
- W sekcji "Krzywa standardowa (w biegu)" wybierz "zapisz jako zewnętrzną" i nazwij krzywą. Wprowadź komentarz "zastosowana jako krzywa standardowa" podczas zapisywania.
- Przedstaw wyniki na wykresie. Wynikowy współczynnik liniowości musi wynosić ≥0,81.
- W przypadku codziennych przebiegów dołącz jedną kopię QS3 lub QS4 jako kontrolkę w przebiegu. Bieżąca zewnętrzna krzywa standardowa może zostać zaimportowana do przebiegu w fazie analizy.
- Uruchom kontrole: brak kontroli DNA, kontrola negatywna, niskie i wysokie kontrole pozytywne. Oczekiwana wiremia jest określana i dostosowywana dla każdego dostawcy i numeru partii.
- Dodaj IC do każdej próbki i kontroluj podczas ekstrakcji DNA.
- Jeśli którakolwiek z kontroli znajdzie się poza zakresem, zapisz niedopuszczalne wyniki i skieruj test do rozwiązania problemu.
- Częstotliwość kontroli
- Uwzględnij w każdym przebiegu: NTC, kontrolkę ujemną, nisko dodatnią, wysoką dodatnią i standardową.
UWAGA: Dopuszczalne limity dla kontroli. Nie należy obserwować pików w przypadku braku matrycy (NTC) i kontroli ujemnych. Piki powinny być obecne w kanale 530, a oczekiwane miano wirusa jest określane i dostosowywane dla każdego dostawcy i numeru partii dla niskich i wysokich kontroli dodatnich.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Łącznie 228 bloków tkanek przebadano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), z czego 91 przypadków było pozytywnych pod kątem cytomegalowirusa (CMV) na podstawie histologii i pozytywnej immunohistochemii (IHC), 18 miało wątpliwy wynik IHC pod kątem CMV, a 79 stanowiły kontrole negatywne. Jak pokazano na Rysunku 2, przypadki CMV-dodatnie wykazywały typowe wtrącenia wirusowe CMV (A) i/lub pozytywne barwienie IHC (B). Przypadki wątpliwe wykazywały rzadki...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dostępnych jest wiele metod laboratoryjnych do diagnozowania zakażenia wirusem cytomegalii (CMV), w tym serologia, hodowla wirusa, testy wiremii molekularnej, histologia materiału biopsyjnego oraz, jak ostatnio wykazano, testy molekularne tkanki biopsyjnej utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE)5,6. Serologia, niegdyś podstawa diagnostyki, jedynie wiarygodnie identyfikuje narażenie i nie koreluje dobrze z ostrym zakażeniem CMV7. Hodowla wirusa, zarówno konwencjonalna, jak i wczesna f...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Amy Thomasson za pomoc w przygotowaniu tego rękopisu, oraz Fredrikowi Skarstedtowi i Ryanowi Christy'emu za ich wysiłki w przygotowaniu rysunków.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,7 ml Probówki do mikrofug | Costar | 3620 | |
| Ząbkowane kleszcze | Usługi mikroskopii elektronowej | 62086-1S | Mikrokleszcze MF-1 |
| Wirówki stołowe (mikrofugi) | Eppendorf | 5424 | |
| Ksylen | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 galon |
| Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% | |
| Mikrotom | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Zestaw tkanek | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| Zestaw suplementów CMV LC PCR Wirówka | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler | Roche | 75005087 | |
| Blok chłodzący LightCycler | Roche | ||
| Narzędzie do zamykania LightCycler | |||
| Roche | 2158850 | ||
| LightCycler 20 μ l Kapilary | Roche | 1 909 339 | |
| Ostrza | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
Bibliografia
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
