Artykuł metodologiczny

Metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych

DOI:

10.3791/51581

⸱

4 lutego 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Heath, University of Minnesota, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Maricopa Medical Center and St Josephs Hospital and Medical Center, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie opisuje szczegółową metodę izolacji i charakterystyki komórek pierwotnego raka jajnika z litych próbek klinicznych. Próbki kliniczne raka jajnika są poddawane trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania żywotnych, wolnych od fibroblastów komórek nabłonkowego raka jajnika (EOC), które doskonale nadają się do dalszych zastosowań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pilnie potrzebne są niezawodne narzędzia do badania inicjacji i progresji raka jajnika. Chociaż wykorzystanie linii komórkowych raka jajnika pozostaje cennym narzędziem do zrozumienia raka jajnika, ich zastosowanie ma wiele ograniczeń. Należą do nich brak heterogeniczności i mnogość zmian genetycznych związanych z przedłużonym pasażowaniem in vitro. W tym artykule opisano metodę, która pozwala na szybkie ustalenie pierwotnych komórek raka jajnika z litych próbek klinicznych pobranych w czasie operacji. Metoda polega na poddaniu próbek klinicznych trawieniu enzymatycznemu przez 30 minut. Wyizolowana zawiesina komórkowa może rosnąć i może być stosowana do dalszych zastosowań, w tym do badań przesiewowych leków. Przewagą linii komórkowych pierwotnego raka jajnika nad ustalonymi liniami komórkowymi raka jajnika jest to, że są one reprezentatywne dla oryginalnych specyficznych próbek klinicznych, z których pochodzą, i mogą pochodzić z różnych miejsc, niezależnie od tego, czy jest to pierwotny lub przerzutowy rak jajnika.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo stosunkowo niskiej częstości występowania, rak jajnika jest najbardziej śmiertelną z chorób ginekologicznych i piątą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka wśród kobiet1,2. Wynika to głównie z braku wiarygodnych narzędzi i modeli, które wiernie odwzorowują początek i postęp choroby3. Większość naszej dzisiejszej wiedzy na temat raka jajnika jest możliwa dzięki zastosowaniu unieśmiertelnionych komórek nabłonka powierzchni jajnika (IOSE), linii komórkowych raka jajnika i komórek pierwotnego raka jajnika odzyskanych z płynu puchlinowego4-7. Niestety, ich stosowanie ma kilka ograniczeń, w tym szereg zmian genetycznych i fenotypowych związanych z procesem unieśmiertelniania lub pasażami in vitro oraz niejednorodność populacji wynikającą z preparatu płynu puchowego.

Dlatego pierwotne komórki raka jajnika pochodzące z możliwych do zidentyfikowania i specyficznych stałych próbek raka jajnika stanowią unikalne narzędzie do badania progresji raka jajnika.

Główne trudności związane z uzyskaniem tych złośliwych komórek wynikają z przerostu komórek zrębu lub fibroblastów wraz z utratą żywotności i przedwczesnym brakiem zdolności proliferacyjnych w hodowli tych komórek EOC. Obecnie istnieje kilka metod tworzenia zawiesin jednokomórkowych z guzów litych, za pomocą środków mechanicznych lub dysocjacji enzymatycznej, jednak niektóre techniki dają większą ilość preferowanego wyniku8. Tutaj pokazujemy, że trawienie enzymatyczne z dyspazą II powoduje skuteczną regenerację żywotnych, wolnych od fibroblastów komórek EOC. Uzyskane w ten sposób kultury EOC są wysoce podatne na manipulacje genetyczne i są również przydatne w testach przesiewowych leków, co wskazuje, że te kultury EOC są odpowiednie do wielu dalszych zastosowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne
Stałe próbki raka jajnika uzyskano z University of Minnesota Tissue Procurement Facility (TPF) po zatwierdzeniu przez Institutional Review Board Committee: Human Subject Board (IRB).

1. Konfiguracja odczynnika

  1. Przygotuj kompletną pożywkę DMEM, uzupełniając DMEM o 10% FBS i 100 jednostek penicyliny-streptomycyny. Przed użyciem przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i ogrzać je do temperatury 37 °C.
  2. Podwielokrotność porcji rozdrobnić II do oddzielnych objętości 5–10 ml, aby uniknąć wielokrotnego rozmrażania i przechowywać w temperaturze -20 °C w zamrażarce niezabezpieczonej przed zamarzaniem.

2. Pobieranie tkanek

  1. Zbierz stałe próbki raka jajnika (o wielkości ~5 g) w czasie operacji z obszarów makroskopowo zidentyfikowanych jako rak przez patologa. Próbki kliniczne są pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i rejestrowane zgodnie z protokołami instytucjonalnymi.
  2. Umieść próbki w sterylnym, zakręcanym pojemniku na próbki polipropylenowe wypełnionym 30 ml lodowatego PBS. Przetransportować próbki z laboratorium patologii chirurgicznej do laboratorium badawczego w celu przetworzenia na lodzie i w ciągu 30 minut od pobrania próbki (ryc. 1).

3. Przetwarzanie tkanek

  1. Pracując w sterylnych warunkach, przenieść próbki na szalkę Petriego (60 mm x 60 mm) zawierającą 10 ml świeżego, lodowatego PBS i za pomocą sterylnej żyletki pociąć na najmniejsze możliwe kawałki (2 mm lub mniej) (rysunki 2A i 2B).
  2. Przenieść rozdrobnione tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml podgrzanej (37 °C przez 30 min) dypazy II (2,4 U/ml) w DMEM i inkubować w temperaturze 5% CO2 i 37 °C przez 30 min. Aby zapewnić optymalne trawienie próbek, należy ręcznie mieszać zawiesinę komórkową co 5 minut.
  3. Po 30 minutach inkubacji przenieść (za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml) zawiesinę komórek na sitko do komórek (oczko 70 μm) umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i delikatnie docisnąć siatkę za pomocą tłoka strzykawki. Odrzucić wszelką niezdysocjowaną tkankę (pozostałą na wierzchu siatki) i zebrać otrzymaną zawiesinę komórkową do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 320 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C (rysunek 3).
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml DMEM zawierającym 10% FBS.
  5. Zawiesinę komórkową inkubować na szalce Petriego w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C (ryc. 4).
  6. Zmienić podłoże po 24 godzinach od pierwszego poszycia. Pozwala to na usunięcie resztek komórkowych i większości erytrocytów obecnych w hodowli.
  7. Zmieniaj pożywkę co trzy dni przez kolejne dwa tygodnie, po czym kultury pierwotnego EOC są gotowe do dalszych zastosowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Świeże próbki kliniczne raka jajnika są pobierane po operacji (Rysunek 1) i cięte na małe kawałki (Rysunki 2A i 2B) stanowiące zawiesinę komórkową. Pozwala to na optymalną ekspozycję próbek na obróbkę enzymatyczną. Zawiesinę komórkową poddaje się trawieniu enzymatycznemu i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 30 minut. W czasie inkubacji gnojowica staje się coraz bardziej mętna (zwłaszcza po każdym mieszaniu), co jest oznaką dezagregacji tkanek. Pod koniec czasu inkubacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lepsze zrozumienie etiologii i rozwoju raka jajnika ma kluczowe znaczenie dla poprawy wyników leczenia kobiet dotkniętych tą wyniszczającą chorobą. W tym kontekście, wykorzystanie uznanej i "komercyjnie dostępnej" linii komórkowej raka jajnika było niewątpliwie niezwykle przydatne. Jednak dziś wiemy, że linie komórek nowotworowych nie są reprezentatywne dla ludzkiego nowotworu, z którego pochodzą, pod wieloma względami, w tym z powodu braku heterogeniczności9,10.

W tym miejscu przed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować personelowi Zakładu Pozyskiwania Tkanek Uniwersytetu Minnesoty za pomoc w pobieraniu próbek tkanek od pacjentów. Praca ta była wspierana przez Program Badań nad Rakiem Jajnika (OCRP) Departamentu Obrony OC093424 do MB, przez Randy Shaver Cancer Research and Community Fund do MB, przez Minnesota Ovarian Cancer Alliance do MB oraz przez fundusz Departamentu Onkologii Ginekologicznej do MB. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x PBS, sterylne Invitrogen14190-144
Zakręcana pokrywka, polipropylenowy pojemnik na próbki, sterylneThermo Scientific02 1090
DMEM podłoże, sterylne Invitrogen11995-065
Surowica bydlęca płodowa, sterylnaThermo Scientific HycloneSH30396.03
100x Penicylina-streptomycyna, płynInvitrogen15140-122
Dispase II, sterylneRoche04942 078 001
Małe kleszczyki z cienką końcówką i ostrze skalpela, sterylneKleszcze Fisher Scientific: 08-953E, ostrza: 08-927-5D
Nożyczki preparacyjne małe, sterylneFisher Scientific08-945
15 ml Probówki stożkowe, sterylneBD Falcon352097
50 ml Probówki stożkowe, sterylneFalcon352027
10 ml Pipeta serologiczna Corning13-678-11E
6 ml Tłok strzykawki, sterylny Tyco Healthcare8881516911
Filtr nylonowy (70 μ m ) sitko do komórek, sterylneBD Falcon352350
5 cm szalka Petriego, sterylne Corning430166
10 cm szalka Petriego, sterylna Corning430167

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
  2. Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
  3. Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
  4. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  5. Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
  6. Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
  7. Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
  8. Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
  9. Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
  10. Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Linie kom rkowe raka jajnikatrawienie enzymatyczneizolacja kom rektrawienie tkanekhodowla kom rkowaprzesiew lek wnab onkowy rak jajnikazawiesina kom rkowa

Powiązane artykuły