Demonstracja proteolitycznej aktywacji nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) poprzez połączenie pomiarów prądu z detekcją fragmentów rozszczepienia

Podsumowanie

Proteolityczną aktywację nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) heterologicznie wyrażanego w oocytach Xenopus laevis można wykazać łącząc obecne pomiary z podejściem biotynylacyjnym w celu zbadania wyglądu produktów rozpadu kanałów jonowych na powierzchni komórki. Funkcjonalnie ważne miejsca rozszczepienia można zidentyfikować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.

Streszczenie

Opisane metody mogą być użyte do zbadania wpływu proteaz na kanały jonowe, receptory i inne białka błony plazmatycznej heterologicznie wyrażane w oocytach Xenopus laevis. W połączeniu z mutagenezą ukierunkowaną na miejsce, podejście to zapewnia potężne narzędzie do identyfikacji funkcjonalnie istotnych miejsc rozszczepienia. Aktywacja proteolityczna jest charakterystyczną cechą wrażliwego na amilorydy nabłonkowego kanału sodowego (ENaC). Ostatnim etapem aktywacji jest rozszczepienie podjednostki γ kanału w krytycznym regionie potencjalnie celem kilku proteaz, w tym chymotrypsyny i plazminy. Aby określić stymulujący wpływ tych proteaz serynowych na ENaC, wrażliwy na amiloryd prąd całej komórki (ΔI_ami) mierzono dwukrotnie w tym samym oocycie przed i po ekspozycji na proteazę przy użyciu techniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego. Równolegle z eksperymentami elektrofizjologicznymi zastosowano podejście biotynylacyjne w celu monitorowania pojawiania się fragmentów rozszczepienia γENaC na powierzchni komórki. Za pomocą opisanych metod wykazano, że przebieg w czasie proteolitycznej aktywacji prądów całych komórek za pośrednictwem ENaC koreluje z pojawieniem się produktu rozszczepienia γENaC na powierzchni komórki. Wyniki te sugerują związek przyczynowo-skutkowy między rozszczepieniem kanału a aktywacją kanału. Co więcej, potwierdzają koncepcję, że zdarzenie rozszczepienia w γENaC jest wymagane jako ostatni etap aktywacji kanału proteolitycznego. Opisane tutaj metody mogą mieć zastosowanie do odpowiedzi na podobne pytania dotyczące innych typów kanałów jonowych lub białek błonowych.

Wprowadzenie

Proteazy to enzymy, które biorą udział w różnych reakcjach fizjologicznych, począwszy od dobrze znanej proteolitycznej degradacji białek, w kontekście trawienia, aż po wysoce wyrafinowane kaskady proteaz zaangażowane w złożone regulacyjne szlaki sygnałowe. Proteazy dzielą się na siedem grup w zależności od ich katalitycznego miejsca aktywnego: proteazy asparaginianu, asparaginy, cysteiny, kwasu glutaminowego, metalozyny, seryny i treoniny. Różne proteazy celują w różne miejsca rozszczepienia, które nie zawsze są łatwe do przewidzenia na podstawie pierwotnej struktury białka. Baza danych MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/) zawiera szczegółowe informacje na temat szerokiej gamy proteaz i ich preferencyjnych miejsc cięcia. Funkcjonalnie istotne miejsca rozszczepienia można zidentyfikować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.

Jest dobrze znane, że proteolityczne przetwarzanie ENaC jest ważnym mechanizmem aktywacji tego konkretnego kanału jonowego^1,2. Co ciekawe, istnieją dowody na to, że funkcja powiązanego kanału jonowego 1a (ASIC1a) może być również modyfikowana przez proteazy^3-5. Obecnie otwartym pozostaje pytanie, czy rozszczepienie kanałów proteolitycznych odgrywa istotną rolę fizjologiczną w regulacji aktywności innych kanałów jonowych lub transporterów. Wiadomo jednak, że rozszczepienie proteolityczne aktywuje grupę receptorów sprzężonych z białkiem G, receptorów aktywowanych proteazą (PAR)⁶. Wykazano, że kilka proteaz serynowych (np. proteazy aktywujące kanały (CAP1-3), chymotrypsyna, trypsyna, furyna, plazmina, elastaza neutrofilowa i kalikreina) proteolitycznie aktywują ENaC². Oprócz proteaz serynowych inne grupy proteaz mogą być zaangażowane w proteolityczną aktywację ENaC. Rzeczywiście, ostatnie dane pokazują, że metaloproteinaza meprin-β⁷ i katepsyna proteazy cysteinowej^{S 8} mogą również aktywować ENaC. Jednak (pato-)fizjologicznie istotne proteazy dla aktywacji ENaC pozostają do ustalenia i mogą się różnić w zależności od tkanki.

Wiadomo, że proteazy preferencyjnie rozszczepiają się w określonych miejscach w sekwencji aminokwasów. Na przykład chymotrypsyna proteazy serynowej wykazuje specyficzny wzór rozszczepienia, rozszczepiając się po resztach aminokwasów aromatycznych fenyloalaniny i tyrozyny. W przeciwieństwie do tego, proteaza serynowa trypsyna preferencyjnie rozszczepia się po podstawowych resztach lizynie lub argininie. Wykorzystując zmutowane ludzkie konstrukty γENaC wygenerowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, można zidentyfikować funkcjonalnie istotne miejsca cięcia w ENaC heterologicznie wyrażane w systemie ekspresji oocytów^8-13.

Poprzez wstrzyknięcie cRNA do trzech podjednostek ENaC (αβγ) do izolowanych oocytów, ENaC może być funkcjonalnie wyrażany w tych komórkach, a aktywność kanałów obecnych na błonie plazmatycznej może być mierzona za pomocą techniki dwuelektrodowego zacisku napięcia. Dzięki zastosowaniu amilorydu moczopędnego, specyficznego inhibitora ENaC, wrażliwy na amiloryd składnik prądu całej komórki, w którym pośredniczy ENaC (ΔI_ami), można oddzielić od niespecyficznych prądów upływowych lub od prądów przewodzonych przez inne kanały jonowe. Zatem wartości ΔI_ami odzwierciedlają ogólną aktywność ENaC i można je określić, odejmując prądy całokomórkowe mierzone w obecności amilordu od odpowiadających prądów całokomórkowych zarejestrowanych przy braku amilorku. Aby sprawdzić, czy proteaza ma stymulujący wpływ na ENaC, ΔI_ami mierzy się dwukrotnie w tym samym oocycie, tj. przed i po inkubacji oocytu w roztworze zawierającym proteazę. Wzrost_{ΔI ami} od pierwszego do drugiego pomiaru wskazuje na proteolityczną aktywację ENaC. Wiadomo, że chymotrypsyna lub trypsyna maksymalnie stymulują ENaC w systemie ekspresji oocytów^2,14 i mogą być stosowane do potwierdzenia, że proteolityczna aktywacja ENaC jest wykrywalna w danej partii oocytów.

Równolegle do pomiarów prądu dla całej komórki, zastosowano metodę biotynylacji⁹ w celu zbadania, czy wzrost_{ΔI ami} wykryty po ekspozycji oocytów na proteazy koreluje z pojawieniem się fragmentów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki. Białka na powierzchni komórki są znakowane biotyną i mogą być oddzielone od białek wewnątrzkomórkowych poprzez wiązanie biotynylowanych białek z kulkami agarozy znakowanymi neutrawidyną. Biotynylowane białka mogą być analizowane za pomocą western blot. Fragmenty rozszczepienia γENaC na powierzchni komórki można wykryć za pomocą specyficznego przeciwciała skierowanego przeciwko epitopowi w C-końcu γENaC. Aby zidentyfikować funkcjonalnie istotne miejsce (miejsca) rozszczepienia, przewidywane miejsca rozszczepienia można zmutować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Kanały typu dzikiego i zmutowanego są porównywane w równoległych eksperymentach z wykorzystaniem oocytów z tej samej partii.

Dzięki temu metodologicznemu podejściu po raz pierwszy wykazano, że proteolityczna aktywacja prądów całokomórkowych za pośrednictwem ENaC koreluje z zależnym od czasu pojawieniem się fragmentów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki. Wyniki te sugerują związek przyczynowo-skutkowy między rozszczepieniem kanału a aktywacją kanału. Ponadto, stosując mutagenezę ukierunkowaną na miejsce przypuszczalnych miejsc rozszczepienia w połączeniu z techniką dwuelektrodowego zacisku napięciowego, zidentyfikowano funkcjonalnie istotne miejsca cięcia plazminy, chymotrypsyny¹³ i katepsyny-S⁸.

Protokół

1. Izolacja oocytów Xenopus i mikroiniekcja cRNA

1. Pozyskaj oocyty od dorosłej samicy Xenopus laevis. Znieczulić zwierzęta 0,2% MS222 i wyciąć płaty jajników przez małe nacięcie w jamie brzusznej.
2. Wyizolować oocyty z płatów jajników przez trawienie enzymatyczne w temperaturze 19 °C przez 3-4 godziny z 600-700 U/ml kolagenazy typu 2 z Clostridium histolyticum rozpuszczonej w roztworze OR2 wolnym od wapnia (przepis w tabeli 1).
3. W celu selekcji umieścić zdeflkulowane oocyty na szalce Petriego pod mikroskopem lornetkowym w roztworze o wysokiej zawartości sodu (ND96: przepis w Tabeli 1).
4. Wybrać oocyty w stadium V-VI i umieścić je na innej szalce Petriego za pomocą pipety Pasteura. UWAGA: pipeta Pasteura przez płomienie, aby zapobiec uszkodzeniu oocytów.
5. Wstrzyknąć oocytom cRNA (np. 0,2 ng na podjednostkę αβγENaC). Rozpuść cRNA w wodzie wolnej od RNaz. UWAGA: Całkowita objętość wstrzyknięta do każdego oocytu wynosi 46 nl.
6. Przechowuj wstrzyknięte oocyty w temperaturze 19 °C w roztworze o niskiej zawartości sodu, aby zapobiec obciążeniu oocytów sodem (ND9: przepis w tabeli 1). Uzupełnij roztwór 100 j./ml penicyliny sodowej i 100 μg/ml siarczanu streptomycyny, aby zapobiec rozwojowi bakterii. Ostrożnie obchodź się z oocytami, aby ograniczyć ilość uszkodzonych lub martwych oocytów i utrzymuj je w pojedynczych małych grupach w 12-dołkowych studzienkach wypełnionych roztworem do kąpieli przez dwa dni po wstrzyknięciu cRNA.

OR2	82,5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, dostosowane do pH 7,4 z NaOH
ND96	96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, dostosowane do pH 7,4 za pomocą Tris
ND9	9 mM NaCl, 87 mM NMDG-Cl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, dostosowane do pH 7,4 za pomocą Tris
bufor biotynylacyjny	10 mM trietanoloamina, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, dostosowany do pH 9,5 za pomocą HCl
bufor wygaszania	192 mM glicyna, 25 mM Tris-Cl, dostosowana do pH 7,5 z HCl
lizy	500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-Cl, dostosowane do pH 7,4 z HCl

Tabela 1. Rozwiązania

2. Przeprowadzanie eksperymentów z dwuelektrodowymi zaciskami napięcia

1. Zmierz oocyty dwa dni po wstrzyknięciu.
2. Napełnić jedną strzykawkę grawitacyjnego systemu perfuzyjnego roztworem ND96, a drugą strzykawkę roztworem ND96 zawierającym amiloryd (2 μM). Zamontuj strzykawki 50 cm nad komorą kąpieli oocytów. UWAGA: Stężenie amilorydu inhibitora ENaC zostało wybrane tak, aby było 20 razy wyższe niż jego IC₅₀ (100 nM).
3. Włącz halogenowe źródło zimnego światła o mocy 150 W i ustaw je na wysokości 10 cm nad komorą kąpieli oocytów, umożliwiając dobrą wizualizację za pomocą mikroskopu dwuokularowego. Następnie włącz ssanie i wyreguluj rurkę ssącą na końcu komory kąpieli oocytów. Umieść rurkę ssącą naprzeciwko adaptera rurek do zgrzewania wchodzącego do kąpieli oocytów. UWAGA: Moc ssania musi być wystarczająca, aby utrzymać ciągły przepływ roztworu powodującego fuzję oocytu.
4. Dostosuj prędkość superfuzji każdego roztworu do 3-5 ml/min za pomocą urządzenia do kontroli przepływu dożylnego. Podłącz rurki do zgrzewania z adapterem do komory kąpieli oocytów.
5. Pociągnij szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać średnicę końcówki <1 μm. Następnie napełnij kapilary do ~1/4 3 M KCl. UWAGA: Upewnij się, że chlorowana część srebrnego drutu uchwytu elektrody jest zanurzona w roztworze KCl. Sprawdź, czy w końcówce kapilary nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza pogarszają pomiar poprzez zwiększenie pojemności błądzącej rezystancji.
6. Włóż kapilary do uchwytów elektrod prądu i elektrody napięciowej i umieść je w roztworze ND96 zawierającym amiloryd (2 μM) za pomocą mikromanipulatorów.

3. Pomiar prądów całych komórek wrażliwych na amiloryd

1. Wyzeruj potencjał elektrody napięciowej (V_m) i elektrody prądowej (V_e), regulując_przyciski przesunięcia V_m i V_e.UWAGA: Rezystancja powinna wynosić 1-2 MΩ dla elektrody do pomiaru V_m i 0,5-1 MΩ dla elektrody do wstrzykiwania prądu.
2. Umieść oocyt w komorze kąpieli w bliskiej odległości od elektrody wykrywającej napięcie. UWAGA: Nie uszkadzaj oocytu podczas żadnego z tych etapów transferu. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść oocyt. Aby uniknąć uszkodzenia oocytu, krawędzie pipety powinny być stępione przez płomieniowanie.
3. Delikatnie przebij oocyty obiema mikroelektrodami.
4. Ustaw potencjał podtrzymania na amplifier na -60 mV i włącz rejestrator wykresów. Włączyć roztwór zawierający amiloryd (2 μM). UWAGA: Prąd powinien wynosić około 0 ± 0,5 μA. Większe prądy upływowe wskazują na nieszczelne przebicie. Dlatego te oocyty należy odrzucić. Ponadto prądy upływowe mierzone w obecności amilorydu (2 μM) powinny być podobne w oocytach wykazujących ekspresję αβγ-WT do tych mierzonych w oocytach wykazujących ekspresję αβγ-mutanta ENaC. Oznacza to, że mutacje nie wpływają na wrażliwość kanału na amilorydy.
5. Rozpocznij nagrywanie. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienie.
6. Gdy mierzony prąd osiągnie stabilny plateau, zmień na roztwór wolny od amiloridów. UWAGA: Odchylenia prądu w dół w ścieżkach prądowych odpowiadają prądom wewnętrznym, czyli przemieszczaniu się ładunku dodatniego (Na⁺) od strony zewnątrzkomórkowej do ogniwa.
7. Po osiągnięciu plateau prądu (po ~60 sekundach) przełącz superfuzję z powrotem na roztwór zawierający amilorydy. Gdy prąd oocytu osiągnie początkowy prąd podstawowy, wyłącz cęgi napięciowe i delikatnie wyjmij elektrody.
8. Aby umożliwić ponowne uszczelnienie błony plazmatycznej w miejscach przebicia, umieść oocyt w jednym dołku 96-dołkowej płytki zawierającej 100-150 μl roztworu ND96 wolnego od proteazy.
9. Po 5 minutach przenieść oocyt do roztworu zawierającego proteazę lub do roztworu kontrolnego bez proteazy na czas inkubacji 30 minut. UWAGA: Czas inkubacji zależy od proteazy i badanego kanału.
10. Po etapie inkubacji powtórzyć bieżący pomiar (patrz 3.2 i następne). UWAGA: Możliwe jest zmierzenie >90% oocytów po inkubacji w roztworze proteazy.

4. Test biotynylacji

1. Wybierz i odrzuć wadliwe oocyty pod mikroskopem dwuokularowym. UWAGA: Do bieżących pomiarów i eksperymentów z biotynylacją należy używać wstrzykniętych oocytów z tej samej partii.
2. Trzymaj biotynę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut przed jej użyciem w eksperymencie.
3. Przygotować roztwory: ND96 i ND96 zawierające odpowiednią proteazę. Przygotuj pipety Pasteura, oznaczając je etykietami i krótko podpalając ich końcówki, aby uniknąć uszkodzenia oocytów. UWAGA: W tym przypadku stosuje się proteazę chymotrypsynę 2 μg/ml w ND96. Każdą grupę należy traktować oddzielną pipetą, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego roztworów.
4. Wypełnić każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 2,5 ml kontrolnego ND96 lub ND96 zawierającego proteazę w temperaturze pokojowej. Następnie umieść 30 oocytów w dołku i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: W przypadku kolejnych procedur ważne jest, aby próbki były zawsze trzymane na lodzie. Wszystkie etapy wirowania odbywają się w temperaturze 4 °C.
5. Napełnij każdą studzienkę nowej płytki 6-dołkowej 2,5 ml ND96 (każda grupa potrzebuje 3 dołków na etapy mycia) i zważ biotynę. UWAGA: Wymagane jest 2,5 mg biotyny na studzienkę (1 mg / ml). Rozpuścić biotynę w buforze do biotynylacji (tj. 25 mg biotyny (dla 10 grup) w 25 ml buforu do biotynylacji (przepis w tabeli 1).
6. Przenieś każdą grupę oocytów do studzienki wypełnionej 2,5 ml ND96. Przenieś oocyty sekwencyjnie do dwóch dodatkowych studzienek z ND96, aby zmyć pozostałą proteazę. Inkubować oocyty przez 5 minut w ND96.
7. Przenieść oocyty do studzienki zawierającej 2,5 ml roztworu biotyny i inkubować je z delikatnym mieszaniem ("wytrząsaczem") przez 15 minut. UWAGA: Zminimalizuj przenoszony ND96 za pomocą pipety, aby uniknąć rozcieńczenia roztworu biotyny.
8. Przenieść każdą grupę oocytów do studzienki zawierającej 2,5 ml buforu wygaszającego (przepis w Tabeli 1) w celu zatrzymania reakcji biotynylacji. Następnie przenieś każdą grupę oocytów do drugiego dołka, również zawierającego 2,5 ml buforu hartującego i inkubuj przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.
9. Usuń uszkodzone lub martwe oocyty. UWAGA: Wybierz taką samą liczbę oocytów na grupę do poniższej procedury.
10. Przenieś każdą grupę oocytów do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. UWAGA: Zminimalizuj ilość przenoszonego bufora wygaszającego.
11. Następnie poddać lizie oocyty, przepuszczając je przez igłę 27 G w 1 ml buforu do lizy (przepis patrz tabela 1) uzupełnionego inhibitorami proteazy.
12. Odwirowywać lizaty przez 10 minut przy 1 500 x g.
13. Odessać supernatant i przenieść go do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,5% Triton-X-100 i 0,5% NP40. Wyrzuć pozostały granulek. UWAGA: Supernatant zawiera biotynylowane białka błony komórkowej i niebiotynylowane białka wewnątrzkomórkowe.
14. Inkubować probówki do mikrowirówek przez 20 minut na lodzie. W tym okresie wielokrotnie wiruj probówki, aby całkowicie rozpuścić białka w NP40 i Triton-X-100.
15. Odwirować 100 μl kulek agarozy na grupę oocytów przez 3 minuty przy 1 500 x g. Po odwirowaniu usunąć supernatant z roztworu kulek i przemyć trzykrotnie buforem do lizy w celu zrównoważenia kulek z buforem.
16. Odpipetować 100 μl przemytych kulek do każdej probówki do mikrowirówki zawierającej roztwór białkowo-detergentowy przygotowany w 4.13, aby umożliwić związanie biotynylowanych białek z kulkami.
17. Inkubować probówki do mikrowirówek z obrotem O/N nad głową w temperaturze 4 °C.
18. Odwirować probówki do mikrowirówek przez 3 minuty przy 1 500 x g. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki. UWAGA: Białka wewnątrzkomórkowe nie są znakowane biotyną. Supernatant może być przechowywany w temperaturze -20 °C. Nie zasysaj koralików.

5. Wykrywanie fragmentów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki za pomocą analizy Western Blot

1. Przemyć kulki trzykrotnie buforem do lizy i dodać 100 μl 2x buforu do próbek SDS-PAGE. UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub natychmiast przygotowane do analizy western blot.
2. Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie umieścić probówki na lodzie.
3. Odwirować próbki przez 3 minuty przy 20 000 x g i odpipetować supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. UWAGA: Ten supernatant zawiera biotynylowane białka błony plazmatycznej z powierzchni komórki oocytu.
4. Przeanalizuj 30 μl tego supernatantu za pomocą western blot, aby zbadać fragmenty rozszczepienia na powierzchni komórki.
5. Oddzielić biotynylowane białka za pomocą SDS-PAGE (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu) za pomocą odpowiedniego żelu (8%, 10%, 12% w zależności od masy cząsteczkowej badanych fragmentów rozszczepienia).
6. Przenieść białka do membran z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą półsuchego blottingu.
7. Zbadaj błonę specyficznym przeciwciałem przeciwko ludzkiemu γENaC skierowanemu przeciwko epitopowi na końcu C (patrz ryc. 3 i ¹³).
8. Użyj koziego przeciwciała anty-króliczego znakowanego peroksydazą chrzanową jako przeciwciała drugorzędowego.
9. Wykrywanie sygnałów chemiluminescencyjnych.

Wyniki

Aby zbadać, czy serynowa proteaza plazmina może aktywować prądy pośredniczone przez ENaC, wyznaczono ΔI_ami poszczególnych oocytów wykazujących ekspresję ENaC przed i po 30 min inkubacji oocytów w roztworze wolnym od proteaz (kontrola) (Rycina 2A) lub w roztworze zawierającym plazminę (Rycina 2B), stosując technikę dwuelektrodowego zacisku napięciowego (voltage-clamp) (patrz Rycina 1). Ekspozycja na plazminę zwiększyła ΔI_ami w każdym zmierzonym oocycie. W przeciwieństwie do tego, w eksperymentach kontrolnych 30 min inkubacji oocytów wykazujących ekspresję ENaC w roztworze wolnym od proteaz miała pomijalny wpływ (Rycina 2 C,D). Zatem, stosując tę metodę, można wykryć stymulację prądu pośredniczonego przez ENaC przez plazminę.

Aby zbadać wpływ mutacji domniemanych miejsc cięcia na aktywację prądów zależnych od ENaC, a także na cięcie kanału, porównano efekt działania chymotrypsyny na WT-ENaC z efektem na zmutowany ENaC z zmutowanymi miejscami cięcia dla prostazyny i plazminy (γ_{RKRK178AAAA;K189A}). Przebieg czasowy aktywacji kanału przez chymotrypsynę, a także pojawienie się produktów cięcia ENaC na powierzchni komórki, zbadano przy użyciu różnych czasów inkubacji z proteazą (Ryc. 4A). Wykazano, że zmutowany kanał opóźnia i redukuje aktywację prądu zależnego od ENaC przez chymotrypsynę. Towarzyszy temu opóźnione pojawienie się fragmentu cięcia γENaC o niższej masie cząsteczkowej 67 kDa, odpowiadającego całkowicie rozszczepionej podjednostce. Fragmenty cięcia wykryto za pomocą przeciwciała przeciwko γENaC skierowanego przeciwko epitopowi w C-końcu (Ryc. 3). To podejście metodologiczne dowodzi, że przebieg czasowy proteolitycznej aktywacji prądów zależnych od ENaC koreluje z pojawieniem się produktu cięcia γENaC o masie 67 kDa na powierzchni komórki (Ryc. 4 B,C). Wspiera to koncepcję związku przyczynowo-skutkowego między proteolitycznym cięciem kanału a jego aktywacją¹³. Ponadto, łącząc pomiary prądu z detekcją fragmentów γENaC na powierzchni komórki, wykazano, że zmutowane miejsca cięcia są istotne funkcjonalnie dla proteolitycznej aktywacji kanału.

Rycina 1. Procedura oznaczania efektu stymulującego proteazy na ENaC heterologicznie ekspresowany w oocytach Xenopus laevis. Aktywność ENaC szacuje się poprzez pomiar komponenty prądu całokomórkowego wrażliwej na amiloryd ΔI_ami.

Rysunek 2. Plazmina stymuluje prądy zależne od ENaC w oocytach wykazujących ekspresję ENaC. (A-D) Oocyty wykazujące ekspresję ludzkiego ENaC inkubowano przez 30 min w roztworze wolnym od proteaz (kontrola) lub w roztworze zawierającym plazminę (10 μg/ml). Aby wyznaczyć ΔI_ami przed (-) i po (+) inkubacji, oocyty utrzymywano przy potencjale trzymania -60 mV. (A,B) Cztery reprezentatywne zapisy prądów całokomórkowych z jednej partii oocytów. Amiloryd (ami) znajdował się w roztworze kąpieli w celu specyficznego zahamowania ENaC, co zaznaczono czarnymi paskami. (C) Punkty danych uzyskane z pojedynczego oocytu są połączone linią. (D) Podsumowanie podobnych eksperymentów, jak pokazano w C. Kolumny przedstawiają względny efekt stymulujący na ΔI_ami, obliczony jako stosunek ΔI_ami zmierzonego po 30 min inkubacji (ΔI_ami 30 min) do początkowego ΔI_ami (ΔI_ami initial) zmierzonego przed inkubacją. Liczby wewnątrz kolumn oznaczają liczbę zmierzonych pojedynczych oocytów. N oznacza liczbę różnych partii oocytów. (Rysunek zmodyfikowany na podstawie [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:10.1085/jgp.201110763])

Rycina 3. Model podjednostki γENaC przedstawiający miejsca cięcia dla aktywacji proteolitycznej oraz miejsce wiązania użytego przeciwciała. Cięcie proteolityczne przez konwertazę furynę związaną z aparatem Golgiego jest istotne dla dojrzewania ENaC w szlaku biosyntetycznym, zanim kanał dotrze do błony plazmatycznej. Po cięciu przez furynę na powierzchni komórki można wykryć fragment o masie 76 kDa, stosując metodę biotinylacji i przeciwciało przeciwko epitopowi w C-końcu podjednostki γ. Kluczowy ostatni etap proteolitycznej aktywacji ENaC zachodzi prawdopodobnie w błonie plazmatycznej, gdzie γENaC jest cięty przez proteazy zewnątrzkomórkowe (np. plazminę lub chymotrypsynę) w regionie dystalnym względem miejsca cięcia furyny, co skutkuje powstaniem fragmentu o masie 67 kDa. (Rycina została zmodyfikowana na podstawie [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:10.1085/jgp.201110763])

Rycina 4: Mutacja zarówno miejsca cięcia plazminy (K189), jak i prostazyny (RKRK178) opóźnia aktywację prądów pośredniczonych przez ENaC oraz pojawienie się produktu cięcia o masie 67 kDa podjednostki γ kanału. Oocyty wykazujące ekspresję kanału WT (otwarte symbole) oraz mutanta γ_{RKRK178AAAA;K189A}ENaC (zamknięte symbole) inkubowano przez 30 min w roztworze wolnym od proteaz (kontrola) lub przez 5, 30 bądź 60 min w roztworze zawierającym chymotrypsynę (2 μg/ml). (A) Aby określić ΔI_ami przed i po inkubacji, oocyty utrwalono przy potencjale trzymania -60 mV. Okręgi reprezentują stosunek ΔI_ami zmierzonego po 5, 30 lub 60 min inkubacji (ΔI_ami min) do początkowego ΔI_ami (ΔI_ami initial) zmierzonego przed inkubacją. Każdy punkt danych reprezentuje średnią wartość ΔI_ami zmierzoną w 22-24 pojedynczych oocytach z czterech różnych serii. (B-D) Równolegle do wykrywania ΔI_ami, ekspresję biotynylowanej γENaC na powierzchni komórki analizowano za pomocą SDS-PAGE. γENaC wykryto za pomocą przeciwciała przeciwko epitopowi w C-końcu ludzkiej γENaC. Przedstawiono reprezentatywne wyniki western blot z jednej serii oocytów. (C-E) Analiza densytometryczna trzech wyników western blot podobnych do tych pokazanych w B lub D. Dla każdej ścieżki określono sygnały wykryte w obszarach 76 kD (otwarte kolumny) i 67 kD (szare kolumny), a następnie znormalizowano je do sumy całkowitego wykrytego sygnału. N oznacza liczbę różnych serii oocytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

W pracy opisano podejście metodologiczne, które z powodzeniem zastosowano do badania mechanizmów leżących u podstaw aktywacji ENaC przez proteazy^8,13. Do funkcjonalnej ekspresji ENaC wykorzystano dobrze znany system ekspresji oocytów Xenopus laevis . Funkcję ENaC oceniano za pomocą konwencjonalnej techniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego. Zastosowano mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w celu zidentyfikowania funkcjonalnie istotnych miejsc rozszczepienia proteazy. Eksperymenty biotynylacyjne prowadzone równolegle z pomiarami elektrofizjologicznymi pozwoliły na skorelowanie pojawiania się produktów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki z aktywacją prądu proteolitycznego. Korelacja między przebiegiem w czasie aktywacji prądu a pojawieniem się fragmentów rozszczepienia proteolitycznego na powierzchni komórki potwierdza koncepcję aktywacji kanałów proteolitycznych.

Dwuelektrodowe zapisy napięciowe wymagają nabicia oocytu za pomocą dwóch mikroelektrod. Zabieg ten jest zwykle wykonywany tylko raz w pojedynczym oocycie. Możliwe było jednak usunięcie mikroelektrod po początkowym zarejestrowaniu prądu całego ogniwa bez widocznego uszkodzenia oocytu. Rzeczywiście, błona plazmatyczna w miejscach wbicia na pal wydaje się ponownie uszczelniać w ciągu kilku minut. Tak więc, po zakończeniu pierwszego dwuelektrodowego pomiaru napięcia cęgowego, możliwe jest przeniesienie oocytu z eksperymentalnej komory przepływowej dwuelektrodowego zestawu zacisków napięciowych do probówki mikrofuge lub studzienki z 96-dołkową płytką wypełnioną niewielką objętością roztworu testowego lub kontrolnego. Następnie ten sam oocyt może zostać przeniesiony z powrotem do komory przepływowej i może być ponownie nabity w celu wykonania drugiego pomiaru napięcia dwuelektrodowego. Co ciekawe, prądy, w których pośredniczy ENaC, nie różniły się zbytnio między pierwszym a drugim pomiarem, gdy oocyt był utrzymywany w roztworze kontrolnym. W przeciwieństwie do tego, inkubacja oocytu w roztworze zawierającym proteazę po pierwszym pomiarze spowodowała wzrost prądu za pośrednictwem ENaC w drugim pomiarze (ryc. 2). To odkrycie wskazuje na aktywację kanałów proteolitycznych.

Wykonanie dwóch oddzielnych pomiarów prądu w jednym oocycie ma tę zaletę, że oocyt może być wystawiony na działanie proteaz lub innych środków farmakologicznych między tymi dwoma pomiarami przez różny czas w małej objętości roztworu testowego. Jest to istotne w przypadku stosowania środków drogich i/lub niedostępnych w dużych ilościach, np. oczyszczonych preparatów proteazowych. Ograniczona dostępność środków może uniemożliwić (lub uniemożliwić ich stosowanie) w ciągłych dwuelektrodowych zapisach napięcia cęgowego ze względu na duże objętości roztworu testowego wymaganego do ciągłego superfuzji oocytów z natężeniem przepływu kilku mililitrów na minutę. Co więcej, ciągłe dwuelektrodowe pomiary napięcia cęgowego są ograniczone przez dobrze znane zjawisko spontanicznego spływu kanałów, opisane również dla ENaC ¹⁵. W przeciwieństwie do tego, wystawienie oocytów na działanie roztworów testowych między dwoma oddzielnymi pomiarami przez okres do godziny lub dłużej na ogół nie stanowi problemu (patrz ryc. 4A). Wreszcie, dwa sekwencyjne pomiary wykonane w tym samym oocycie pozwalają na sparowane obserwacje działania leku. Ma to przewagę nad niesparowanymi pomiarami z dwóch oddzielnych grup oocytów (traktowanych proteazą i traktowanych nośnikiem), ponieważ zmniejsza problem dużej zmienności między oocytami, zwykle obserwowanej w ekspresji kanałów jonowych. Dzięki sparowanym obserwacjom i możliwości normalizacji danych do pierwszego pomiaru, potrzeba mniej oocytów na grupę eksperymentalną, aby wykazać znaczące działanie środka farmakologicznego. Normalizacja danych ułatwia również podsumowanie danych z różnych partii oocytów o różnych poziomach ekspresji kanałów jonowych, a tym samym różnych prądach podstawowych (ryc. 2D). Oczywiście, eksperymenty kontrolne są niezbędne dla tego podejścia, aby wykazać, że aktywność kanału jonowego, która jest przedmiotem zainteresowania, pozostaje stabilna w oocytach kontrolnych traktowanych nośnikiem od pierwszego do drugiego pomiaru (patrz rysunek 2).

Aby wykazać, że aktywacja prądem proteolitycznym koreluje z pojawieniem się produktów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki, zastosowano podejście biotynylacyjne pierwotnie opisane przez Harrisa i wsp.⁹ może być użyte. Procedura ta (opisana szczegółowo w sekcji protokołu i pokazana na rysunku 4) została dostosowana w celu wykazania, że ekspozycja kanałów na proteazy i późniejsza aktywacja prądów za pośrednictwem ENaC jest równoległa do zależnego od czasu pojawiania się fragmentów rozszczepienia. Metoda biotynylacji pozwala również na analizę ogólnego wzrostu lub spadku białek błonowych na powierzchni komórki. W związku z tym metoda ta jest odpowiednia do badania wpływu proteaz i innych środków farmakologicznych na wprowadzenie kanału do błony plazmatycznej lub po pobraniu kanału. Co więcej, analiza western blot biotynylowanych białek błony plazmatycznej pozwala na wykrycie fragmentów białek (np. proteolitycznych fragmentów ENaC) lub zmian we wzorcu glikozylacji, które mogą być funkcjonalnie istotne.

Podsumowując, połączenie metod stosowanych do badania stymulującego wpływu proteaz na prądy całokomórkowe za pośrednictwem ENaC oraz do wykazania korelacji z występowaniem produktów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki może być przydatne w szerokim zakresie zastosowań. W szczególności metody te mogą być odpowiednie do odpowiedzi na podobne pytania dotyczące regulacji innych kanałów jonowych, transporterów lub receptorów transbłonowych (np. receptorów aktywowanych proteazą).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wyposażenie
Zacisk kąpielowy headstage do OC-725C-V	Warner Instrument Corporation
Źródło zimnego światła - Schott KL 1500 LCD	Schott	#SCOC150200EU	jasność 4; otwór mechaniczny: D; temperatura barwowa: 3 000 K
E Uchwyt elektrody serii (Str, Vent, Ag Wire, 1,2 mm)	ADinstruments	#ESW-F10v
Lewy mikromanipulator; MM-33L	Warner Instrument Corporation	#64-0055
LIH 1600 - interfejs komputerowy	HEKA System zaworów
magnetycznych (ALA BPS-8) w połączeniu z interfejsem TIB14 (HEKA)	ALA Scientific Instruments, wzmacniacz HEKA
OC-725C do dwuelektrodowych napięć cęgowych	Warner Instrument Corporation
P-97 FLAMING/BROWN Ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments		ciepło = 550; prędkość = 22; czas = 200
Prawy mikromanipulator; MM-33R	Warner Instrument Corporation	#64-0056
Uchwyt elektrody serii (45°, Odpowietrznik, Uchwyt, Drut Ag, 1.2 mm)	ADinstruments	#E45w-f10vh
Regulator przepływu grawitacyjnego STAT 2 IV	Conmed	#P-S2V-60
Generator podciśnienia SEG - do odsysania w celu usunięcia roztworu do kąpieli	Schmalz
INFUJECT 60 ml strzykawki z pompką do roztworów	Braun	#22050
Rurka borokrzemianowa o standardowych ściankach z włóknem	Sutter Instruments	#BF150-86-10	średnica zewnętrzna: 1,5 mm; średnica wewnętrzna: 0,86 mm; długość: 10 cm
Kompletne, Mini, wolne od EDTA tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy	Roche Applied Science	#11836170001
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotyna	Thermo Scientific	#21217
Wtórne przeciwciało przeciw królikowi znakowane peroksydazą chrzanową Santa	Cruz Biotechnology	#sc-2004
NeutrAvidin Agaroza	Thermo Scientific	#29200	Koraliki agarozowe znakowane neutrawidyną
NP40 (Nonidet P-40)	Sigma-Aldrich	#I8896
Roti-Load 1 (próbka 2x SDS-PAGE bufor)	Carl Roth	#K929.2
SuperSignal West Femto Chemiluminescencyjne podłoże do detekcji sygnałów chemiluminescencyjnych	Thermo Scientific	#34095
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	#T8787