Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Budowa i charakterystyka nowego bioreaktora fałdów głosowych

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51594

⸱

1 sierpnia 2014

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Program, University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

W tym artykule

Podsumowanie

Skonstruowano i scharakteryzowano nowatorski bioreaktor fałdowania głosowego, zdolny do dostarczania fizjologicznie istotnej, wibracyjnej stymulacji do hodowanych komórek. To dynamiczne urządzenie do hodowli, w połączeniu z włóknistym rusztowaniem poli(ε-kaprolaktonu), tworzy środowisko wokalno-mimetyczne, które moduluje zachowanie mezenchymalnych komórek macierzystych.

Streszczenie

Inżynieria in vitro tkanek aktywnych mechanicznie wymaga przedstawienia fizjologicznie istotnych warunków mechanicznych hodowanym komórkom. Aby naśladować dynamiczne środowisko fałdów głosowych, skonstruowano i scharakteryzowano nowatorski bioreaktor fałdów głosowych zdolny do wytwarzania stymulacji wibracyjnych przy podstawowych częstotliwościach fonacji. Urządzenie składa się z generatora funkcyjnego, wzmacniacza mocy, selektora głośników i równoległych komór wibracyjnych. Indywidualne komory wibracyjne są tworzone poprzez umieszczenie specjalnie wykonanej membrany silikonowej pomiędzy parą bloków akrylowych. Membrana silikonowa służy nie tylko jako dno komory, ale także zapewnia mechanizm zabezpieczający rusztowanie obciążone komórkami. Sygnały wibracyjne, generowane przez głośnik zamontowany pod dolnym blokiem akrylowym, są przenoszone do membrany aerodynamicznie przez oscylujące powietrze. Osiem identycznych modułów wibracyjnych, zamocowanych na dwóch nieruchomych metalowych prętach, jest umieszczonych w komorze przeciwwilgociowej do długotrwałej pracy w inkubatorze do hodowli komórkowych. Charakterystyka drgań bioreaktora fałdów głosowych jest analizowana nieniszcząco za pomocą laserowego wibrometru dopplerowskiego (LDV). Użyteczność urządzenia do hodowli dynamicznej wykazano poprzez hodowlę konstruktów komórkowych w obecności drgań sinusoidalnych 200 Hz z przemieszczeniem błony środkowej 40 μm. Mezenchymalne komórki macierzyste hodowane w bioreaktorze reagują na sygnały wibracyjne, zmieniając syntezę i degradację istotnych dla fałdów głosowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Prezentowany w niniejszym artykule nowatorski system bioreaktorów stanowi doskonałą platformę in vitro do badania mechanotransdukcji indukowanej drganiami oraz do inżynierii funkcjonalnych tkanek fałdów głosowych.

Wprowadzenie

Ludzki fałd głosowy, składający się z warstwy nabłonkowej, blaszki właściwej (LP) i mięśnia wokalnego, jest wyspecjalizowaną tkanką miękką, która przekształca przepływ powietrza z płuc w fale akustyczne do produkcji dźwięku. 1 Fałdy głosowe oscylują regularnie podczas normalnej fonacji, wykazując napięcia do 30% przy podstawowych częstotliwościach w zakresie 100-300 Hz.2 Dorosłe fałdy głosowe LP to struktura gradientowa składająca się z warstwy powierzchownej (SLP), pośredniej (ILP) i głębokiej (DLP). Dalsza klasyfikacja grupuje nabłonek i SLP jako warstwę błony śluzowej i łączy ILP i DLP w więzadło głosowe. 3 Warstwa SLP zawiera przede wszystkim amorficzną matrycę ze słabo rozproszonymi włóknami kolagenowymi, podczas gdy więzadło jest wzbogacone o dojrzałe włókna kolagenowe i elastynowe, aby zapewnić wystarczającą wytrzymałość. 4 Budowa i mechanika noworodków różnią się znacznie od ich dojrzałych odpowiedników. Chociaż mechanizmy regulujące rozwój i dojrzewanie fałdów głosowych nie są jeszcze w pełni poznane, dowody eksperymentalne wskazują na definiującą rolę stresu mechanicznego pochodzącego z wokalizacji.

Kilka schorzeń, w tym nadużywanie głosu, infekcje, chemiczne czynniki drażniące i zabiegi chirurgiczne, mogą uszkodzić fałd głosowy. Zaburzenia fałdów głosowych dotykają około 3-9% populacji USA. Obecne metody leczenia zaburzeń fałdów głosowych są ograniczone5, a podejście oparte na inżynierii tkankowej oparte na komórkach macierzystych okazało się obiecującą strategią przywracania funkcji fałdów głosowych. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są odpowiednią alternatywą dla pierwotnych fibroblastów fałdów głosowych w inżynierii tkankowej fałdów głosowych. 6-9 Specyfikacja losu komórek macierzystych i późniejszy rozwój tkanek są zapośredniczone przez specyficzną niszę, w której się znajdują, której stan mechaniczny jest istotnym czynnikiem. 10 Siły mechaniczne są niezbędnymi regulatorami morfogenezy i homeostazy tkanek, zwłaszcza w przypadku tkanek, które są rutynowo poddawane obciążeniu. 11 Z punktu widzenia inżynierii tkankowej wykazano, że narażenie na fizjologicznie istotne bodźce mechaniczne sprzyja różnicowaniu komórek macierzystych i specyficznej tkankowo przebudowie macierzy. 12-15

Bioreaktory do hodowli tkankowych są zaprojektowane tak, aby symulować pożądane środowisko fizjologiczne dla wzrostu komórek lub tkanek in vitro. W przypadku inżynierii tkankowej fałdów głosowych szczególnie ważne jest odtworzenie mechanicznego środowiska fonujących fałdów głosowych. Idealny bioreaktor fałdów głosowych powinien skutecznie dostarczać sygnały wibracyjne do komórek hodowlanych, umożliwiając łatwą kontrolę częstotliwości, amplitudy i czasu trwania wibracji. Titze i jego współpracownicy opracowali bioreaktor fałdów głosowych (bioreaktor T1)16, który łączy rozciąganie statyczne z oscylacjami o wysokiej częstotliwości (20-200 Hz) w celu stymulowania komórkowej produkcji białek macierzy. Korzystając z tego bioreaktora, Webbi jego współpracownicy badali wpływ 10-dniowych wibracji o częstotliwości 100 Hz na fibroblasty skóry hodowane w hydrożelu na bazie kwasu hialuronowego (HA). Konstrukty poddane wibracjom wykazywały podwyższoną ekspresję syntazy HA-2 (HAS2), dekoryny, fibromoduliny i metaloproteinazy macierzy-1 (MMP1) w stosunku do kontroli statycznych. Stwierdzono, że efekty stymulujące są zależne od czasu. Niedawno nasza grupa18 zmontowała bioreaktor fałdowania głosowego (bioreaktor J1) przy użyciu wzmacniacza mocy, generatora funkcyjnego, zamkniętego głośnika i zakotwiczonej obwodowo membrany silikonowej, która przenosi oscylujące powietrze do dołączonych komórek. Fibroblasty napletka noworodków hodowane w bioreaktorze J1 poddano 1 godzinnym wibracjom o częstotliwości 60, 110 lub 300 Hz, z naprężeniem w płaszczyźnie do 0,05%. Wyniki qPCR sugerowały, że ekspresja niektórych genów ECM była umiarkowanie zmieniona w odpowiedzi na różne częstotliwości i amplitudy drgań.

Te projekty bioreaktorów, choć intrygujące, mają kilka ograniczeń. Na przykład system T1 wymaga dużej liczby złączy i prętów do sprzęgania mechanicznego, co ogranicza maksymalne osiągalne częstotliwości. Ponadto komórki mogą być poddawane niepożądanym mieszaniom mechanicznym i zaburzeniom płynów, które komplikują interpretację danych. Z kolei bioreaktor J1 wykazuje stosunkowo niską sprawność konwersji energii i nie jest przyjazny dla użytkownika. Ponadto wibracje często odrywają konstrukcje wypełnione komórkami od leżącej pod spodem membrany silikonowej. Opisywany tutaj bioreaktor fałdowania głosowego J2, zaprojektowany w oparciu o tę samą zasadę, co wersja J1, jest zoptymalizowany pod kątem spójności i odtwarzalności. Drgania naśladujące fonację są generowane aerodynamicznie w indywidualnie dopasowanych komorach wibracyjnych, w których skutecznie zabezpieczone są rusztowania włókniste z poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) wypełnione przez MSC. Laserowa wibrometria dopplerowska (LDV) pozwala użytkownikowi zweryfikować profil wibracyjny zespołu membrana/rusztowanie. W naszej demonstracji MSC są narażone na drgania sinusoidalne o częstotliwości 200 Hz z wzorcem 1 godz. na 1 godz. przerwy (OF), co daje łącznie 12 godzin dziennie przez 7 dni. Reakcje komórkowe na narzucone sygnały wibracyjne są badane systematycznie. Ogólnie rzecz biorąc, fałd głosowy J2 zapewnia najbardziej przyjazne dla użytkownika funkcje, umożliwiając prowadzenie dynamicznych badań nad kulturami komórkowymi w sposób wysokowydajny i powtarzalny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zespół bioreaktora (Wideo 1)

  1. Wykonaj aluminiową formę (okrągła matryca + kołek dystansowy) o z góry ustalonych wymiarach wewnętrznych i zewnętrznych (rysunek 1).
  2. Korzystając z formy z kroku 1.1, wyprodukuj membranę silikonową (średnica: 42 mm, grubość: 1,5 mm, rysunek 1) z osadzoną tuleją (średnica: 12 mm, grubość ~0,25 mm, ukształtowana przez kołek dystansowy na rysunku 1) pośrodku, używając dostępnego na rynku zestawu elastomerów silikonowych.
  3. Wykonaj parę klocków akrylowych (Rysunek 2 (4, 5)) z okrągłym otworem (średnica: 24 mm) pośrodku, wygraweruj górne (1,8 cm grubości) i dolne (0,9 cm grubości) bloki z pasującymi grzbietami i rowkami. 10
  4. Umieść membranę silikonową między sparowanymi blokami akrylowymi. Przymocuj zespół czterema narożnymi za pomocą mikrowkrętaka dynamometrycznego ustawionego na stałą siłę (35 cN·m). W efekcie powstaje wodoszczelna komora wibracyjna o szerokości 24 mm i głębokości 18 mm (rys. 2C).
  5. Zamontuj 3-calowy minigłośnik niskotonowy o rozszerzonym zasięgu (Rysunek 2D, 8 Ω/20 W) pod komorą wibracyjną za pomocą innego zestawu narożnych na dolnym bloku akrylowym. W tym momencie montowany jest indywidualny moduł wibracyjny.
  6. Odtwórz siedem dodatkowych modułów wibracyjnych. Przymocuj cztery z nich do jednej z dwóch stacjonarnych aluminiowych listew (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), umieszczając podstawy głośników w równomiernie rozmieszczonych okrągłych otworach (średnica: 7 cm, grubość: 2 cm) wyciętych w prętach. Ustabilizuj każdy głośnik, wkładając przez bok aluminiowego pręta do każdego okrągłego otworu.
  7. Indywidualnie steruj głośnikami za pomocą selektora głośników. Podłącz poszczególne głośniki do selektora, podłączając przewody do dodatnich i ujemnych wejść na korpusie głośnika, a następnie do odpowiednich wyjść na selektorze. Przełącznik głośników umożliwia sygnał z generatora funkcyjnego, po przejściu przez wzmacniacz mocy, do wszystkich ośmiu głośników jednocześnie (rysunek 2E).
  8. Umieść dwie matryce komor, selektor głośników i powiązaną elektronikę w obudowie chroniącej przed wilgocią. Umieść cały zespół w komercyjnym inkubatorze do hodowli komórkowych.
  9. Przeprowadź główne (przez rurkę PVC klasy medycznej) łączącą moc amplifier i selektor głośników przez zespół filtra z tyłu inkubatora.

2. Wykonanie i charakterystyka rusztowań

  1. Granulki PCL rozpuścić w chloroformie w stężeniu 15% wag. Roztwór należy umieścić w strzykawce o pojemności 10 ml wypełnionej igłą o sile 21 g.
  2. Zablokować strzykawkę na programowalnej pompie strzykawkowej i ustawić natężenie przepływu na 1 ml/h.
  3. Umieść kolektor pokryty folią aluminiową naprzeciwko igły poziomo, zachowując odległość między końcówką igły a kolektorem wynoszącą ~18 cm.
  4. Zacisnąć dodatni zacisk krokodylkowy do środka igły, a zacisk krokodylkowy uziemiający do aluminiowego kolektora, a następnie ustawić napięcie na zasilaczu wysokiego napięcia na 15 kV. UWAGA: wysoka objętośćtage, zachowaj odległość od igły.
  5. Sekwencyjnie włączaj pompę strzykawkową i zasilacz; szybko oczyść/usuń resztki roztworu polimeru otaczającego końcówkę igły za pomocą suchego ręcznika papierowego, zanim uformują się stabilne strumienie włókien i stożek Taylora19.
  6. Pozwól, aby włókna zgromadziły się na kolektorze Al do grubości ~250-300 μm (~7 godzin w obecnych warunkach wirowania). Powstałe rusztowania należy przechowywać w eksykatorze próżniowym przez 1-2 dni w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika.
  7. Wyobraź sobie rusztowania, napylone złotem, za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, aby pokazać spójną morfologię włókien. 10

3. Montaż i charakterystyka bioreaktora

  1. Wybij cylindryczny krążek (średnica: 8 mm) czterema ramionami (długość: 2 mm) z maty PCL (rysunek 2A), najpierw używając stempla biopsyjnego o średnicy 12 mm, aby przeciąć zewnętrzną średnicę dysku. Następnie użyj drugiego stemple do biopsji o średnicy 8 mm, aby wykonać cztery nacięcia o długości 2 mm równomiernie rozmieszczone wokół okrągłego ostrza, aby naciąć miejsce, w którym mają zostać przecięte ramiona. Po nacięciu stemplem o średnicy 8 mm za pomocą ostrza skalpela odetnij krawędzie ramion na zewnątrz. Włóż rusztowanie w rowek membrany silikonowej za pomocą przedłużonych ramion (Wideo 1). Spłaszcz wstawione rusztowanie, delikatnie dociskając powierzchnię za pomocą pęsety z płaską główką.
  2. Przymocuj mały kawałek cienkiej folii aluminiowej (8 mm x 2 mm, kształt prostopadły, rysunek 2B) do rusztowania PCL, aby wspomóc odbicie laserowe.
  3. Zabezpiecz zmontowaną membranę silikonową/rusztowanie PCL (zgodnie z opisem w kroku 1.4) w komorze wibracyjnej. Dodaj 1,5 ml wody do komory, aby nawodnić rusztowanie PCL przed wibracjami.
  4. Za pomocą generatora funkcyjnego wprowadzić sygnały drgań (np. fale sinusoidalne 200 Hz o napięciu międzyszczytowym, Vpp, 0,1 V) do komory akrylowej typu sandwich. Użyj woltomierza, aby dokładnie zmierzyć napięcie na każdym wejściu głośnikowym. Uwaga: odczyt Vpp z generatora funkcyjnego będzie się różnił od ostatecznej objętościtage dostarczane do głośnika.
  5. Zamontuj jednopunktowy LDV i przymocuj światłowodową głowicę czujnika laserowego do statywu z głowicą obrotowo-uchylną. Ustaw głowicę czujnika pod takim kątem, aby była skierowana prostopadle do blatu. Podłącz głowicę czujnika LDV do modułu akwizycji danych za pomocą koncentrycznego, a następnie moduł do laptopa przez USB.
  6. Skoncentruj wiązkę lasera prostopadle w różnych z góry określonych punktach membrany silikonowej (Rysunek 2B i Rysunek 3).
  7. Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych, zarejestruj przemieszczenie środkowej membrany. Kliknij "Ustawienia pozyskiwania" w menu "Opcje"; następnie zmień tryb pomiaru na "FFT". Następnie kliknij "Pomiar ciągły" na głównym pasku narzędzi, a następnie kliknij szczyt, który tworzy się przy wybranej częstotliwości (Rysunek 6D), aby zarejestrować przemieszczenie.
  8. Wykreślić normalne przemieszczenie błony środkowej (w0) jako funkcję względnego położenia w poprzek podłoża. Stwórz mapę kolorów 3D profilu wibracyjnego powierzchni za pomocą oprogramowania do analizy danych Origin 8.5.

4. Wibracyjna hodowla komórkowa

  1. Podhodowla MSCs pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego w kolbach kultur tkankowych T150 przy początkowej gęstości wysiewu 4 000-5 000 komórek/cm2 w pożywce podtrzymującej MSC.
  2. Po 7-8 dniach hodowli komórkowej (do ~85% konfluencji), trypsynizuj komórki odczynnikiem dysocjacji komórek, takim jak akutaza, policz za pomocą hemocytometru, odwiruj (440 x g przez 5 min) i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce konserwacyjnej MSC o stężeniu 4,5 x 106 komórek/ml.
  3. Zanurz rusztowanie PCL w 70% etanolu O/N. Po odparowaniu rozpuszczalnika należy wystawić obie strony rusztowania na działanie bakteriobójczego światła UV (254 nm) przez 5-8 minut.
  4. Zanurzyć rusztowanie PCL w roztworze fibronektyny o stężeniu 20 μg/ml w temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Włożyć rusztowanie pokryte fibronektyną do membrany silikonowej. Zmontuj bioreaktor zgodnie z opisem w kroku 1.
  5. Rozprowadzić 40 μl zawiesiny komórek równomiernie na zabezpieczonym rusztowaniu PCL. Pozwól ogniwom przyłączyć się na 1-1,5 godziny przed dodaniem dodatkowych 1,5 ml świeżego podłoża do komory wibracyjnej.
  6. Hodować rusztowanie PCL obciążone MSC statycznie przez 3 dni i odświeżyć pożywkę po zakończeniu hodowli statycznej.
  7. Nałóż wybrane reżimy drgań na konstrukty komórkowe. Uwaga: Na przykład ogniwa są poddawane wibracjom 1 godz. na 1 godz. wyłączonym (OF) przy 200 Hz z w0 ~40 μm przez 12 godzin dziennie przez okres do 7 dni. Konstrukty poddane stymulacji wibracyjnej są oznaczone jako próbki wibracyjne, a te hodowane statycznie w identycznych komorach wibracyjnych służą jako statyczne kontrole (Stat).

5. Oceny biologiczne

  1. Zebrać 200 μl pożywki do hodowli komórkowych z każdej komory co drugi dzień (dzień 1, 3, 5 i 7) i połączyć podwielokrotności z tej samej próbki (po 800 μl każda).
  2. Określ ilościowo komórkową produkcję metaloproteinazy macierzy-1 (MMP1) i HA, używając odpowiednio zestawu rozwojowego MMP1 ELISA i zestawu konkurencyjnego testu ELISA kwasu hialuronianowego, zgodnie z procedurą producenta. W międzyczasie oznacz produkcję rozpuszczalnego prekursora elastyny zgodnie z wcześniej opisaną procedurą ELISA. 8
  3. Po zakończeniu ostatniego cyklu wibracyjnego w 7 dniu, szybko usuń konstrukty komórkowe z komór wibracyjnych za pomocą ostrej pęsety i krótko przepłucz je zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS, 4 °C).
  4. W przypadku barwienia żywych/martwych należy inkubować konstrukty z jodkiem propidyny (1:2,000 w PBS) i Syto-13 (1:1,000 w PBS) jednocześnie przez 5 minut w RT. Zobrazuj barwione konstrukty za pomocą wielofotonowego mikroskopu konfokalnego.
  5. Oddzielnie zamroź wypłukane PBS konstrukty komórkowe na suchym lodzie i wyekstrahuj całkowite komórkowe RNA zgodnie z wcześniej opisanym protokołem analizy genów. 9
  6. Sprawdzić ilość i jakość wyekstrahowanego RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Próbki RNA o proporcjach A260/A280 i A260/A230 wynoszących 1,8-2,2 są wykorzystywane do późniejszej analizy qPCR.
  7. Odwrotna transkrypcja RNA (500 ng / próbkę) na cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do odwrotnej transkrypcji.
  8. Przeprowadzić reakcję PCR w systemie wykrywania sekwencji w czasie rzeczywistym przy użyciu dostępnej na rynku głównej mieszanki PCR, postępując zgodnie z poprzednio szczegółową procedurą. 8
  9. Analizuj wyniki qPCR za pomocą komercyjnego oprogramowania do analizy danych qPCR. Aby zapewnić wiarygodność analizy danych, jako kontrole wewnętrzne stosuje się wiele genów referencyjnych (YWHAZ, TBP, PPIA) i uwzględnia się wariancję określonych wydajności starterów. 8

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rusztowania z PCL wykonane metodą elektroprzędzenia zawierają porowe przestrzenie międzywłókniste o rozmiarach mikronowych oraz losowo splątane włókna o średniej średnicy 4,7 µm (Rysunek 4A). Przy większym powiększeniu na pojedynczych włóknach widoczne są nanometrowe rowki i pory (Rysunek 4B). Pokrycie rusztowań fibronektyną poprawia hydrofilowość i ułatwia początkową adhezję oraz rozprzestrzenianie się komórek na rusztowaniu z PCL (niepublikowana obserwacja).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Skuteczna inżynieria funkcjonalnych tkanek fałdów głosowych in vitro wymaga odtworzenia mikrośrodowiska przypominającego fałd głosowy, które pośredniczyłoby w zachowaniu komórek multipotencjalnych. Ogólnie przyjmuje się, że struktury tkanek lub narządów odzwierciedlają funkcje, do których są wymagane. 22 W przypadku tkanek fałdów głosowych sugeruje się, że drgania o wysokiej częstotliwości, które występują podczas fonacji, mają istotne znaczenie dla dojrzewania tkanek. W naszym badaniu rusztowania PCL...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe.

Podziękowania

Dziękujemy doktorowi Jeffreyowi Caplanowi za jego szkolenie i porady dotyczące obrazowania konfokalnego. Dziękujemy również Laboratorium Mikroskopii Elektronowej Kecka i dr Chaoying Ni za pomoc SEM. Praca ta jest finansowana przez National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 i R01DC011377). ABZ przyjmuje do wiadomości program NSF Integrative Graduate Education & Research Traineeship (IGERT) do finansowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw elastomerów silikonowychDow CorningSylgard 184Utwardź membranę w temperaturze 100 ° C dla 2 godzin
PCLSigma Aldrich440744-500GMn ~80 kDa, rozpuść O/N
ChloroformSigma AldrichC7559-5VL
MSCs pochodzące z ludzkiego szpiku kostnegoLonzaPT-2501Otrzymany z pasażem 2
Pożywki konserwacyjne MSCLonzaPT-300110% FBS w pożywce podstawowej uzupełnione
L-glutaminą, gentamycyną i amfoterycyną
Odczynnik do dysocjacji komórek AccutaseLife TechnologiesA11105-01
EtanolSigma AldrichE7023-500ML
FibronektynaSigma AldrichF2006-1MG
MMP1 DuoSet Zestaw ELISAR& Systemy DDY901
HA Zestaw ELISAEchelon Biosciences  K-1200   
PBSLife Technologies14190-136
Jodek propidyny Technologie życioweP1304MP
Syto-13 Life TechnologiesS7575
QuantiTect Qiagen205311
SYBR Green PCR master mixLife Technologies4309155
Głośnik zamiennyDAYTON audio
(przez Parts Express)		DS90-8Stożek papierowy, pełny zakres (80-13,000 Hz), 85 dB
Wkrętak dynamometryczny Ergo MicroMountz# 020377Zakres momentu obrotowego: 20-120 cN·
m Selektor głośników stereoRadioShack40-244Maksymalna moc wyjściowa 50 W
Generator funkcyjny Agilent 33220AZakres częstotliwości 1 i mikro; Hz-20 MHz
Wzmacniacz mocy PYLE audioPylePro PT2400Pasmo przenoszenia: 10 Hz-50 kHz, dwa kanały głośnikowe
Inkubator do hodowli komórkowych Thermo Fisher Steri-Cult 3307
Pompa strzykawkowa New Era Pump SystemsNE-300
Zasilacz wysokonapięciowySpellmanCZE 1000RNapięcie wyjściowe: 0-30 kV
Skaningowy mikroskop elektronowy JEOL-USAJSM-7400F
Biurko do napylania złotegoDenton VacuumDSK00V-0013
Wibrometr laserowy Doppler PolytecPDV-100Bezkontaktowy pomiar prędkości (0-22 kHz)
System detekcji sekwencji PCR ABI7300Wielofotonowy
mikroskop konfokalnyZeiss Zeiss510Meta NLO
UV-VIS SpektrofotometrProdukty NanoDrop
za pośrednictwem oprogramowania do		ND-2000
VibSoftPolytecPasmo akwizycji do 40 MHz
Oprogramowanie do analizy danych Origin 8.5 Oprogramowanie do analizy danych OriginLab
qbasePlus qPCR BiogazelleV2.3
Stop aluminium McMaster-CarrAlloy 6061
Bloki akryloweMcMaster-Carr
Poliwęglanowa komora przeciwwilgociowaMcMaster-CarrOdporna na uderzenia  Wkręty z poliwęglanu
 McMaster-Carr
Elektroniczny / drut
Rurki PVC klasy medycznejUS Plastic Corp.Tygon S-50-HLClear, biokompatybilna
strzykawka 10 ml Becton Dickinson309604
21 G Igła z zakończeniemMałe częściNE-213PL-25o długości 1-1 / 2 "
 RadioShack270-354W pełni izolowany
dziurkacz do biopsji 8 mmSklar  Instrumenty chirurgiczne96-1152Sterylny, jednorazowy
stemple do biopsji 12 mmAcuderm (przez Fisher Scientific)NC9998681
Kolby do hodowli tkankowychHodowla komórek CorningPoddana zabiegowi
Zestaw do odwrotnej transkrypcji Zeiss 510Meta  akwizycji danych Thermo Scientific Adaptery zacisków krokodylkowych

Bibliografia

  1. Titze, I. R. Mechanical-Stress in Phonation. J. Voice. 8, 99-105 (1994).
  2. Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
  3. Gray, S. D. Cellular physiology of the vocal folds. Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).
  4. Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
  5. Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
  6. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  7. Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
  8. Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
  9. Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
  10. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
  11. Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
  12. Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
  13. Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
  14. Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
  15. Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
  16. Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
  17. Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
  18. Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
  19. Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
  20. Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
  21. Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
  22. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
  23. Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
  24. Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
  25. Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
  26. Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
  27. Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
  28. Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
  29. Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mezenchymalne komórki macierzystestymulacja wibracyjnalaserowy wibrometr dopplerowskirusztowanie PCLmembrana silikonowamacierz zewnątrzkomórkowamechanotransdukcjahodowla komórkowaanaliza wibracyjna
Budowa i charakterystyka nowego bioreaktora fałdów głosowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.