Artykuł metodologiczny

Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet

17.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51601

⸱

9 września 2014

 ,  , 
1Section of Microbiology, MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London, 2Département de Biologie du Développement et des Cellules Souches, Institut Pasteur, Unité Macrophages et Développement de l'Immunité

W tym artykule

Podsumowanie

Aby przeciwdziałać rozprzestrzenianiu się patogenów, komórki gospodarza reorganizują swój cytoszkielet, aby podzielić bakterie na grupy i wywołać autofagię. Za pomocą zakażenia Shigella komórek hodowli tkankowej identyfikowane i charakteryzowane są determinanty gospodarza i patogenu leżące u podstaw tego procesu. Korzystając z modeli zakażenia Shigella danio pręgowanego, bada się rolę odkrytych cząsteczek i mechanizmów in vivo.

Streszczenie

Shigella flexneri to wewnątrzkomórkowy patogen, który może uciec z fagosomów, aby dotrzeć do cytozolu i polimeryzować cytoszkielet aktynowy gospodarza, aby promować jego ruchliwość i rozprzestrzenianie się. Nowe prace wykazały, że białka biorące udział w ruchliwości opartej na aktynie są również powiązane z autofagią, procesem degradacji wewnątrzkomórkowej kluczowym dla autonomicznej odporności komórek. Co uderzające, komórki gospodarza mogą zapobiegać ruchliwości S. flexneri opartej na aktynie poprzez dzielenie bakterii w "klatki septynowe" i kierowanie ich do autofagii. Obserwacje te wskazują, że pełniejsze zrozumienie septyn, rodziny nitkowatych białek wiążących GTP, dostarczy nowych informacji na temat procesu autofagii. W niniejszym raporcie opisano protokoły monitorowania interakcji autofagia-cytoszkielet wywołanych przez S. flexneri in vitro przy użyciu komórek hodowli tkankowej oraz in vivo przy użyciu larw danio pręgowanego. Protokoły te umożliwiają badanie mechanizmów wewnątrzkomórkowych, które kontrolują rozprzestrzenianie się bakterii na poziomie molekularnym, komórkowym i całego organizmu.

Wprowadzenie

Shigella flexneri, Gram-ujemna inwazyjna bakteria enteropatogenna, może uciekać z fagosomów do cytozolu i polimeryzować cytoszkielet aktynowy gospodarza, aby uniknąć cytozolowych odpowiedzi immunologicznych i promować ruch wewnątrz- i międzykomórkowy1,2. Pomimo zrozumienia ruchliwości opartej na aktynie in vitro3,4, mechanizmy ograniczające rozprzestrzenianie się bakterii in vivo nie zostały w pełni zdefiniowane. Ma to kluczowe znaczenie dla pełniejszego zrozumienia odporności wrodzonej i obrony gospodarza.

Septyny, wysoce konserwatywna rodzina białek wśród metazoan, są białkami wiążącymi trifosforan guanozyny (GTP), które łączą się w heterooligomeryczne kompleksy i tworzą niepolarne włókna, które łączą się z błonami komórkowymi i cytoszkieletem5,6. Niedawne prace wykazały, że zakażone komórki gospodarza mogą zapobiegać ruchliwości opartej na aktynie Shigella poprzez dzielenie bakterii przeznaczonych do autofagii w "klatkach septynowych", ujawniając pierwszy mechanizm komórkowy, który przeciwdziała ruchliwości opartej na aktynie7,8. Szeroko otwarte pole badań leży obecnie w "biologii septyny i infekcjach". Składanie septyny, indukowane przez różne patogeny (np. Listeria monocytogenes7,9,10, Mycobacterium marinum7,8, Candida albicans11), może okazać się kluczowym problemem w obronie gospodarza5,12.

Autofagia, wysoce konserwatywny proces degradacji wewnątrzkomórkowej, jest postrzegany jako kluczowy składnik odporności autonomicznej komórki, ze względu na jej zdolność do dostarczania bakterii cytozolowych do lizosomu13,14. Jednak rola autofagii bakteryjnej in vivo w ograniczaniu lub promowaniu replikacji bakterii pozostaje słabo poznana15,16. Danio pręgowany (Danio rerio) stał się modelem kręgowców do badania infekcji, ponieważ jest optycznie dostępny w stadiach larwalnych, kiedy wrodzony układ odpornościowy jest już funkcjonalny17,18. Niedawne prace scharakteryzowały podatność larw danio pręgowanego na S. flexneri, paradygmat autofagii bakteryjnej15, i wykorzystały model infekcji Shigella-danio pręgowany do zbadania manipulacji autofagią w terapii przeciwbakteryjnej in vivo19.

Ten raport dostarcza nowych narzędzi i testów do badania interakcji S. flexneri z autofagią i cytoszkieletem. W pierwszym etapie opisano protokoły monitorowania interakcji autofagia-cytoszkielet za pomocą zakażenia Shigella ludzkiej linii komórek nabłonkowych HeLa. Aby ocenić rolę interakcji autofagia-cytoszkielet w procesie zakażenia Shigella in vitro, przedstawiono metody manipulowania składnikami autofagii i cytoszkieletu (przy użyciu siRNA lub odczynników farmakologicznych). Nowe prace wykazały, że stosując zakażenie Shigella larw danio pręgowanego, podobne testy można zastosować do badania biologii komórkowej infekcji in vivo. Szczegółowo opisano protokoły przygotowania i zakażenia larw danio pręgowanego, a w celu oceny odpowiedzi gospodarza na zakażenie Shigella in vivo przedstawiono protokoły określające przeżywalność gospodarza i obciążenie bakteryjne zakażonych larw. Omówiono również metody monitorowania rekrutacji markerów septyny i autofagii do Shigella (przy użyciu stałych lub żywych larw danio pręgowanego) oraz metody badania roli tych procesów in vivo [przy użyciu oligonukleotydów morfolinoligonukleotydów (wstrzykiwanych do zarodków w stadium 1-4 komórek) lub odczynników farmakologicznych (dodawanych bezpośrednio do wody do kąpieli danio pręgowanego)]. Oczekuje się, że ten program prac dostarczy wglądu w mechanizmy wymagane do kontroli infekcji przez cytozolowe odpowiedzi gospodarza.

Protokół

1. Monitorowanie autofagii i cytoszkieletu in vitro za pomocą komórek hodowli tkankowej

  1. Przygotować S. flexneri
    1. Płytka S. flexneri M90T (typu dzikiego) z bulionu glicerolu o temperaturze -80 °C na płytce agarowej z czerwonej kazeiny tryptycznej (TCS) Congo Red. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Ta sama płytka może być używana do kilku eksperymentów.
    2. Wybierz pojedynczą kolonię i hoduj w 8 ml pożywki TCS w wytrząsarce przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wiązanie kongijsko-czerwone wskazuje, że plazmid wirulencji został zachowany.
    3. Aby wyhodować bakterie w celu wykładniczego wzrostu, należy zaszczepić świeży TCS nocną kulturą bakteryjną w rozcieńczeniu 1/80 i hodować w wytrząsarce w temperaturze 37 °C do OD600 = 0,3-0,6.
    4. Wirować subkulturę bakteryjną przy 1 000 x g przez 5 minut. Umyć osad MEM i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut. Rozpuść osad w MEM do OD600 = 0,3-0,6.
  2. Przygotuj komórki HeLa do infekcji
    1. Hoduj komórki HeLa w "kompletnym pożywce", tj. MEM plus L-alanylo-L-glutamina uzupełniona 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM roztworu aminokwasów endogennych i 10% płodowej surowicy cielęcej.
    2. Płytka 1-1,5 x 105 komórek na płytkach 6-dołkowych 24 lub 48 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu. Płytka na szkiełku nakrywkowym w 6-dołkowych płytkach do mikroskopii lub płytka na szklanych naczyniach o dnie 35 mm w celu przygotowania do obrazowania na żywo.
      UWAGA: Aby śledzić dynamikę autofagii (np. autofagosomy ATG8 / LC3 + ve) i cytoszkieletu (np. ogony aktynowe, klatki septynowe) w czasie rzeczywistym podczas infekcji Shigella za pomocą obrazowania na żywo, komórki hodowli tkankowej mogą być przejściowo transfekowane przy użyciu konstruktów znakowanych GFP, RFP lub CFP (patrz Dyskusja).
  3. Zakażać
    1. Zakażone komórki 100:1 wielokrotność infekcji (MOI) Shigella (OD600 = 0,3 - 0,6) rozcieńczoną w MEM; bezpośrednio dodać do komórek HeLa posianych na płytkach 6-dołkowych 24 - 48 godzin przed zakażeniem (jak opisano w sekcji 1.2) w 2 ml MEM (surowica głodna).
    2. Aby zmaksymalizować przyleganie bakterii do komórek gospodarza, odwiruj bakterie i komórki przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i pozwolić na postęp infekcji.
    3. Przemyj zakażone komórki dwukrotnie świeżym MEM i inkubuj z gentamycyną zawierającą kompletną pożywkę (50 μg/ml, w celu wyeliminowania bakterii zewnątrzkomórkowych) przez 1-4 godziny, w zależności od eksperymentu.
  4. Utrwalanie i znakowanie zakażonych komórek HeLa do mikroskopii
    1. Umyj zainfekowane komórki dwukrotnie 1x PBS i utrwal przez 15 minut w 4% paraformaldehydzie w 1x PBS w temperaturze pokojowej. Aby usunąć paraformaldehyd, umyj komórki 2x 1x PBS.
    2. Inkubować utrwalone komórki w 50 mM chlorku amonu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj raz 1x PBS i przepuszczaj komórki przez 4 minuty za pomocą 0,1% kondensatu oktylofenolu tlenku etylenu w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Alternatywy dla kondensatu oktylofenolu tlenku etylenu do przepuszczalności, takie jak saponina lub metanol, mogą być stosowane do różnych zachowań struktur komórkowych20.
    3. Umyj komórki w 1x PBS i inkubuj w mokrej komorze z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko krytycznym składnikom autofagii (np. p62 / SQSTM1) lub cytoszkieletowi septyny (SEPT2, SEPT6, SEPT7, SEPT9 i SEPT11 ulegają ekspresji w komórkach HeLa) przez 30 minut (w temperaturze pokojowej) do nocy (w 4 ºC).
    4. Przemyć komórki dwukrotnie 1x PBS i inkubować w mokrej komorze z przeciwciałami drugorzędowymi i znakować nitkowatą aktynę (F-aktynę) falloidyną przez 30 minut (w temperaturze pokojowej) do nocy (w temperaturze 4 °C). Do barwienia jąder komórek gospodarza dodać 4",6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI).
    5. Umyj komórki w 1x PBS i zamontuj szklane szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą medium montażowego.
  5. Obrazowanie mikroskopowe zakażonych komórek HeLa
    1. Aby zobrazować zainfekowane komórki, użyj mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego i obiektywu 63X lub 100X, aby zidentyfikować Shigella.
      znakowane DAPI UWAGA: Jak pokazano na rysunkach 1A-1C, klatki septynowe można wizualizować jako struktury przypominające pierścienie, o średnicy ~ 0,6 μm, otaczające bakterie cytozolowe polimeryzujące aktynę i rekrutujące markery autofagii (np. p62 i LC3)7,8. Natomiast bakterie polimeryzujące ogony aktyny nie będą podzielone na przedziały przez klatki septynowe i nie będą ukierunkowane na autofagię7,8.
    2. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego i obiektywu 63X lub 100X określ ilościowo liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych w polu mikroskopowym. Określ również ilościowo liczbę bakterii uwięzionych w klatkach septynowych i ukierunkowanych na autofagię lub polimeryzację ogonów aktynowych i ucieczkę autofagii.
    3. Aby określić procent bakterii uwięzionych w klatkach septynowych lub polimeryzujących ogonach aktyny, weź serię obrazów zainfekowanych komórek ze stosu Z, przetwórz obrazy i policz co najmniej 500-1,000 bakterii na eksperyment z co najmniej 3 niezależnych eksperymentów.

2. Analiza funkcjonalna autofagii i cytoszkieletu in vitro

UWAGA: Zarówno podejście genetyczne, jak i farmakologiczne mogą być używane do zakłócania autofagii w zakażonych komórkach hodowli tkankowej, a wpływ tych zabiegów na przebieg infekcji może być monitorowany.

  1. Wyciszanie za pośrednictwem siRNA
    1. Płytka 0,8 x 105 komórek HeLa na szkiełkach nakrywkowych w płytkach 6-dołkowych w kompletnym podłożu.
    2. Transfekcja następnego dnia przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów z siRNA przeciwko markerom autofagii i/lub cytoszkieletu.
    3. Po upływie pożądanego okresu inkubacji należy zainfekować komórki preparatem Shigella w sposób opisany w punkcie 1.3.
    4. Zamocuj i oznacz komórki zgodnie z opisem w sekcji 1.4.
  2. Manipulacja farmakologiczna
    UWAGA: Cytoszkieletem można manipulować farmakologicznie, np. w celu depolimeryzacji cytoszkieletu aktynowego należy użyć cytochalazyny D lub latrunkuliny B, w celu depolimeryzacji mikrotubul stosuje się nokodazol, w celu zablokowania aktywności aktomiozyny stosuje się bbistatynę, lub w celu zakłócenia montażu septyny stosuje się forchlorofeneuron. Autofagia może być stymulowana za pomocą rapamycyny lub blokowana za pomocą bafilomycyny.
    1. Aby manipulować cytoszkieletem podczas infekcji Shigella, najpierw należy zainfekować komórki Shigella zgodnie z opisem w sekcji 1.3 i pozostawić wystarczająco dużo czasu bakteriom na wniknięcie do komórek i ucieczkę z fagosomu do cytozolu (np. >1,5 godziny po zakażeniu).
    2. Rozcieńczyć leki z roztworu podstawowego [roztwór podstawowy zawieszony w dimetylosulfotlenku (DMSO)] w MEM do końcowego stężenia 5 M (cytochalazyna D, latrunkulina B, nokodazol), 20 M (forchlorofeneuron) lub 50 M (blebbistatyna) i poddawać je działaniu komórek przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Całkowita ilość leku (objętość DMSO/mieszaniny leków) dodana na płytkę/fiolkę z komórkami wynosi 1-5 μl (w zależności od roztworu podstawowego) na 2 ml pożywki. Traktuj komórki podobną dawką DMSO rozcieńczoną w MEM jako kontrolę negatywną.
    3. Napraw i oznacz komórki zgodnie z opisem w sekcji 1.4.
      UWAGA: W celu manipulowania strumieniem autofagicznym (w zakażonych lub niezakażonych komórkach) należy przedłużyć leczenie farmakologiczne za pomocą rapamycyny (20 nM) lub bafilomycyny (160 nM) z 4 do 12 godzin.
  3. Western Blot
    UWAGA: Aktywność autofagiczną można określić ilościowo, mierząc poziom białka markerów autofagii, takich jak p62 i LC3.
    1. Po pożądanym okresie inkubacji zbierz i zmiel komórki do immunoblottingu. Uruchom ekstrakty białkowe na 8, 10 lub 14% żelach akrylowych.
    2. Strumień autofagiczny, tj. szybkość autofagii, można analizować zgodnie z opisem w 21,22.
  4. Obrazowanie mikroskopowe i oznaczanie ilościowe
    1. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego i obiektywu 63X lub 100X, wpływ leczenia siRNA lub farmakologicznego na zakażenie Shigella można ocenić za pomocą mikroskopii ilościowej (tj. zliczania autofagosomów, klatek septynowych i ogonów aktynowych), jak opisano w sekcji 1.5 i pokazano na rysunkach 2A i 2B.

3. Obrazowanie in vivo interakcji S. flexneri z autofagią i cytoszkieletem

UWAGA: Model zakażenia Shigella na danio pręgowany może być wykorzystany do zbadania klatkowości septyny i autofagii in vivo19.

  1. Przygotować S. flexneri
    1. Kultura S. flexneri zgodnie z opisem w sekcji 1.1.
    2. Przy OD600 = 0,3-0,6, wirować 8 ml subkultury bakteryjnej przy 1,000 x g przez 10 min. Przemyć osad 1x PBS i odwirować przy 1,000 x g przez 10 min.
    3. Ponownie zawiesić osad w 80 μl 0,1% czerwieni fenolowej 1x PBS, aby uzyskać ~ 2,000 bakterii / nl. Trzymaj preparat bakteryjny na lodzie, aby spowolnić wzrost.
      UWAGA: Dodanie czerwieni fenolowej pomoże uwidocznić inokulum podczas wstrzykiwania do larw.
  2. Przygotować larwy danio pręgowanego do wstrzyknięcia
    UWAGA: Danio pręgowany składa się jako jaja i jest identyfikowany jako zarodki do 72 godzin po zapłodnieniu, kiedy nazywa się je larwami.
    1. Rozmnażaj dorosłe danio pręgowane, jak opisano w Westerfield23, umieszczając 4 samce i 8 samic (zwykle w stosunku 2:1) w oddzielnym akwarium z dnem pokrytym kulkami (co zapobiegnie zjadaniu przez dorosłe osobniki ikry). Alternatywnie, umieść kosze na jajka w zbiornikach hodowlanych poprzedniego wieczoru.
      UWAGA: Jaja są zapładniane ~30 minut po zapaleniu świateł w obiekcie danio pręgowanego23 i powinny być zbierane tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec rozwojowi pleśni. Kosze do zbierania jaj służą do zbierania jaj, dzięki czemu można je łatwo zbierać, a także chronić jaja przed dorosłymi.
    2. Zebrać zarodki i oczyścić je, myjąc je w pożywce dla zarodków (E2) z 0,003% wybielaczem przez 10 minut. Usunąć E2 wybielaczem, umyć zarodki 5x w pożywce E2 i wyhodować zarodki na 10 cm szalce Petriego (100 zarodków/50 ml pożywki E2) w temperaturze 28 °C.
    3. Jeśli zarodki lub larwy będą wykorzystywane do badań mikroskopowych, po 24 godzinach od zapłodnienia dodaj 0,003% N-fenylotiomocznika do pożywki E2, aby zapobiec melanizacji. Utrzymuj zarodki w temperaturze 28 ºC dla prawidłowego rozwoju.
      UWAGA: Larwy danio pręgowanego są gotowe do infekcji po 72 godzinach od zapłodnienia.
    4. W przypadku infekcji i zabiegów mikroskopowych należy znieczulić larwy danio pręgowanego w 200 g/ml trikainy w E2.
  3. Przygotowanie larw danio pręgowanego do zakażenia dożylnego i miejscowego
    UWAGA: Aby ocenić przeżywalność danio pręgowanego podczas infekcji Shigella, należy wykonać doogonowe wstrzyknięcia dożylne. Aby zobrazować rekrutację markerów septyny i autofagii do Shigelli, należy przeprowadzić infekcję w zlokalizowanych miejscach, takich jak mięsień ogonowy.
    1. W przypadku doogonowego wstrzyknięcia dożylnego znieczulone larwy należy umieścić bokiem, stroną grzbietową skierowaną w stronę igły. Jak pokazano na rysunku 3A, umieścić końcówkę igły blisko (z tyłu) do otworu moczowo-płciowego, kierując się do żyły ogonowej, a następnie przekłuć skórę i dostarczyć pożądaną dawkę bakteryjną (objętość wstrzyknięcia 1-5 nl).
      UWAGA: Infekcja dożylna jest trudna do wykonania i zajmie kilka tygodni treningu, aby poczuć się komfortowo z tą procedurą. Wstrzyknięcie czerwieni fenolowej (bez bakterii) w celach treningowych pomoże w prawidłowej ocenie miejsca wstrzyknięcia.
      UWAGA: W przypadku Shigella eksperymenty zależne od dawki wykazały, że infekcja niską dawką (<1000 CFU) jest usuwana w ciągu 48 godzin, a infekcja wysoką dawką (>4000 CFU) prowadzi do śmiertelności gospodarza w ciągu 48 godzin19.
    2. W przypadku zakażenia mięśni ogonowych należy ustawić znieczulone larwy w sposób opisany w sekcji 3.3.1. Jak pokazano na rysunku 3A, ostrożnie umieścić igłę nad somitami mięśniowymi (tj. segmentami mięśni szkieletowych) i wstrzyknąć niewielką objętość (tj. 1 nl) preparatu bakteryjnego.
  4. Dożylne wstrzyknięcie bakterii larwom
    1. Wyciągnąć mikrokapilary ze szkła borokrzemianowego zgodnie z opisem w 24.
    2. Podłącz igłę do uchwytu trójwymiarowego zgrubnego manipulatora ręcznego i złamij końcówkę igły delikatną pęsetą.
    3. Aby załadować igłę, umieść kroplę kultury bakteryjnej na szkiełku nakrywkowym. Włączyć mikrowtryskiwacz i butlę z gazem, lekko zanurzyć końcówkę igły w kropli i napełnić igłę żądaną ilością preparatu bakteryjnego.
    4. Aby skalibrować objętość wstrzyknięcia, należy umieścić kroplę oleju mineralnego na szkiełku nakrywkowym i wstrzyknąć preparat bakteryjny. Zmierzyć średnicę kropli za pomocą mikrometru i obliczyć wstrzykniętą objętość [V= (4/3)πr3].
      UWAGA: Użycie ustawień wstrzykiwania 40 psi i 50 ms z preparatem bakteryjnym opisanym w sekcji 3.1 da ~2,000 CFU/nl.
    5. Przygotuj płytkę wtryskową za pomocą plastikowej formy, jak opisano w Westerfield23.
    6. Przenieś larwy na płytkę iniekcyjną i wyrównaj je za pomocą cienkiego pędzla. Zorientować larwy i wstrzyknąć je w sposób opisany w sekcji 3.3.1.
    7. W celu oceny przeżywalności danio pręgowanego należy przenieść zakażone larwy pojedynczo na 24-dołkowe płytki w 1 ml E2/basenik i inkubować w temperaturze 28 °C. Monitorować zakażone larwy codziennie przez następne 2-5 dni i wykreślić przeżycie w czasie (ryc. 3B).
  5. Posiewanie larw danio pręgowanego w celu ilościowego oznaczania ilości bakterii
    UWAGA: Pracuj pod sterylnym kapturem, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    1. Aby ocenić liczbę bakterii wstrzykniętych do ryb (w czasie 0 godzin po zakażeniu) i określić ilościowo bakterie w pożądanych punktach czasowych, należy poświęcić larwy danio pręgowanego za pomocą przedawkowania tricainy (200-500 mg/l). Umieścić pojedyncze larwy w 1,5 ml polipropylenowej probówce wirówkowej z 200 μl 0,1% kondensatu 0,1% oktylofenolu tlenku etylenu 1x PBS i mechanicznie homogenizować za pomocą tłuczka.
      UWAGA: Aby potwierdzić ładunek bakteryjny w objętości wstrzyknięcia, należy wpompować równą dawkę do sterylnej kropli 1x PBS i wypuścić ją na płytkę.
    2. Wykonać seryjne rozcieńczenie homogenatów larw danio pręgowanego w sterylnej wodzie i umieścić na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB). Larwy można rozsiewać naprzemiennie na płytkach Kongo Red TCS, aby odróżnić, czy Shigella zachowała zjadliwy plazmid, czy nie.
      UWAGA: Tabliczka 3 lub więcej niezakażonych ryb jako kontrola w celu sprawdzenia stanu larw danio pręgowanego wykorzystanych do infekcji.
    3. Po całonocnej inkubacji płytek w temperaturze 37 °C należy policzyć kolonie bakterii. Jak pokazano na rysunku 3C, przedstaw za pomocą skali logarytmicznej.
      UWAGA: Obciążenie bakteryjne podczas infekcji larw danio pręgowanego można również uwidocznić za pomocą znakowanej fluorescencyjnie Shigella i obrazowania mikroskopowego, jak opisano w sekcji 3.7 lub 3.8 (ryc. 3D).
  6. Barwienie immunologiczne larw danio pręgowanego
    1. W pożądanych punktach czasowych należy złożyć larwy w ofierze za pomocą przedawkowania tricainy. Zebrać ryby do probówek do mikrowirówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml (10 do 20 larw w probówce).
    2. Utrwalić larwy za pomocą 4% paraformaldehydu z 0,4% kondensatu tlenku etylenu oktylofenolu w 1x PBS i inkubować w mieszadle orbitalnym (aby uniknąć grupowania larw) przez 2 godziny (w temperaturze pokojowej) lub przez noc (w temperaturze 4 °C).
      UWAGA: Mikroskopia elektronowa może być stosowana do analiz ultrastrukturalnych zakażonych larw danio pręgowanego. W takim przypadku znieczulone zarodki powinny być utrwalone i przetworzone zgodnie z Mostowym i wsp. 19.
    3. Myć 3x w 1x PBS 0,4% oktylofenolu kondensatu tlenku etylenu przez 5 min, a następnie zablokować w roztworze blokującym (10% płodowa surowica cielęca, 1% DMSO, 0,1% monolaurynian polioksyetylenosorbitanu w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym. Dodać larwy do rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w mieszadle orbitalnym. Stosować przeciwciała pierwszorzędowe, jak opisano powyżej w punkcie 1.4.3.
    5. Przemyć larwy 4x przez 15 min w 0,1% monolaurynianu polioksyetylenoorbitolu 1x PBS w temperaturze pokojowej.
    6. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w roztworze blokującym. Dodać larwy do rozcieńczonego przeciwciała wtórnego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w mieszadle orbitalnym. Należy stosować te same przeciwciała drugorzędowe i falloidynę, jak opisano w punkcie 1.4.4.
    7. Myć 4x przez 15 min w 0,1% monolaurynianu polioksyetylenosorbitanu 1x PBS w temperaturze pokojowej. Do barwienia jąder komórek gospodarza dodać DAPI (stężenie końcowe 150 nM) podczas pierwszego z tych 15-minutowych płukań.
    8. W celu zachowania larw znakowanych fluorescencyjnie, inkubuj je stopniowo w gradiencie glicerolu 15, 30, 60 i 80% rozcieńczonym w 1x PBS i 0,1% monolaurynianu polioksyetylenoesorbitolu przez 2 godziny (w temperaturze pokojowej) do nocy (w temperaturze 4 °C).
      UWAGA: Barwione larwy mogą być przechowywane przez długi czas (np. 4 miesiące) w 80% glicerolu w temperaturze 4 °C.
  7. Obrazowanie mikroskopowe utrwalonych larw danio pręgowanego
    1. Przenieść utrwalone larwy zatopione w glicerolu do małej kropli 80% glicerolu na szalce Petriego o średnicy 35 mm (do stereomikroskopii) lub na pełnej szklanej płytce dolnej (w przypadku błędnej konfokalnej).
    2. Weź serię obrazów Z-stack zainfekowanych larw i przetwarzaj obrazy zgodnie z wymaganiami.
    3. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego oraz obiektywu 10X lub 20X do obrazowania całego organizmu. Następnie użyj mikroskopu konfokalnego i obiektywu 40X, 63X lub 100X, aby uwidocznić poszczególne komórki i rekrutację markerów autofagii i cytoszkieletu do poszczególnych bakterii in vivo19 (ryc. 4A i 4B).
      UWAGA: Zainfekuj rybę w mięśniu ogonowym i zamontuj glicerol płasko wzdłuż dna naczynia ze szklanym dnem, aby umożliwić łatwe skupienie.
  8. Obrazowanie mikroskopowe na żywo zakażonych larw danio pręgowanego
    UWAGA: Larwy są optycznie dostępne, dzięki czemu autofagosomy in vivo można uwidocznić za pomocą transgenicznej linii25 danio pręgowanego GFP-Lc3. Zakażone larwy danio pręgowanego należy zainfekować zgodnie z opisem w sekcji 3.3 i zamontować zgodnie z opisem w tym rozdziale.
    1. Przygotować niskotopliwą 1% agarozę (LMA) w E2 i pozostawić do ostygnięcia do temperatury 35-37 °C, aby uniknąć uszkodzenia/zabicia larw. Rozprowadzić krople LMA na szalce Petriego o średnicy 35 mm (do stereomikroskopii) lub w naczyniu z pełnym szklanym dnem (do mikroskopii konfokalnej).
    2. Przenieś znieczulone larwy danio pręgowanego pojedynczo (popijając jak najmniejszą ilością wody) do kropli LMA. Ustaw larwy w żądanej pozycji za pomocą pędzla i poczekaj, aż agaroza stwardnieje.
    3. Pokryć całą powierzchnię naczynia LMA i nałożyć E2 zawierającym 200 μg/ml tricainy, aby uniknąć wysychania preparatu i umożliwić rybom wymianę tlenu z wody.
    4. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego i obiektywu 10X lub 20X do obrazowania całych larw danio pręgowanego. Użyj mikroskopu konfokalnego i obiektywu 40X, 63X lub 100X, aby uwidocznić bakteryjne authopagosomy (tj. wakuole GFP-Lc3 + ve otaczające Shigella) in vivo.
    5. Weź stos Z zainfekowanych larw w czasie (np. co 2 minuty przez kilka godzin), aby uwidocznić autofagosomy i ich dynamikę w czasie rzeczywistym.

4. Analiza funkcjonalna autofagii i cytoszkieletu in vivo

UWAGA: Wpływ farmakologicznych i genetycznych zaburzeń autofagii na przebieg infekcji może być monitorowany na poziomie całego zwierzęcia oraz na poziomie pojedynczej komórki.

  1. Manipulacja autofagią przez wstrzyknięcie morfolino
    1. Rozpuść morfoligonukleotydy w sterylnej wodzie do roztworu podstawowego o stężeniu 1 mM, ogrzewając w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: iniekcje oligonukleotydów morfolino-gigankleotydowych należy wykonywać w zarodkach w stadium 1-4 komórek.
    2. Przygotować roztwór roboczy oligonukleotydów morfolino-oligonukleotydowych ze sterylną 0,1% czerwienią fenolową w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco. Obciążyć igłę zgodnie z opisem w sekcji 3.4.2., objętość iniekcji oligonukleotydu morfolinooligonukleotydu można skalibrować zgodnie z opisem w sekcji 3.4.3.
      UWAGA: Czerwień fenolowa pomoże zobrazować wstrzykniętą objętość.
    3. Przygotować komorę do pozycjonowania zarodków (tj. szkiełko mikroskopowe przyklejone cyjanoakrylanem na pokrywie płytki Petriego o średnicy 10 cm, z częściowo usuniętymi krawędziami skierowanymi w stronę igły). Przenieś 1-4 zarodki w stadium komórkowym do komory z niewielką ilością wody i wyrównaj je drobnym pędzlem.
    4. Gładko wnikaj w kosmówkę i żółtko. Po wejściu do środka naciśnij pedał, aby wstrzyknąć żądaną objętość roztworu oligonukleotydu morfoliino.
      UWAGA: Zminimalizować objętość wstrzykniętego leku do 0,5 - 2 nl; Objętości większe niż 5 NL mogą powodować wady rozwojowe i zwiększać śmiertelność jaj.
    5. Po mikroiniekcji oczyścić zarodki (poprzez wybielanie zgodnie z opisem w sekcji 3.2) i inkubować je na szalce Petriego z E2 w temperaturze 28 °C.
    6. Zakażone 72 godziny po zapłodnieniu kontrolne (tj. larwy danio pręgowanego, którym wstrzyknięto kontrolny oligonukleotyd morfoliny) lub morfanty p62 (tj. larwy danio pręgowanego, którym wstrzyknięto oligonukleotyd morfolinoolinowy p62) Shigella, jak opisano w punkcie 3.4. Należy ocenić przeżywalność i obciążenie bakteryjne przez następne 2-5 dni, jak opisano w punkcie 3.5. Obraz utrwalonych larw danio pręgowanego, jak opisano w sekcji 3.7 i wyróżniony na rysunku 4C, lub obraz żywych larw danio pręgowanego, jak opisano w sekcji 3.8.
      UWAGA: Efektywną dawkę oligonukleotydu morfolinooligonukleotydu można ocenić na podstawie jego skuteczności w hamowaniu splicingu transkryptów lub translacji białek (patrz Dyskusja).

Wyniki

Po zakażeniu komórek hodowli tkankowych in vitro, S. flexneri mogą uciec z fagosomu i wniknąć do cytozolu. W cytozolu komórki gospodarza mogą hamować motywność Shigella opartą na aktynie poprzez zamykanie bakterii w klatkach z septyn (Ryc. 1A). Bakterie uwięzione w klatkach z septyn mogą być również znakowane markerami autofagii p62 (Ryc. 1B) i LC3 (Ryc. 1C). Obserwacje te wskazują na nowy mechanizm obrony gospodarza, który ogranicza rozprzestrzenianie się inwazyjnych patogenów, a także ujawniają nowe powiązania między autofagią a cytoszkieletem. Co uderzające, deplecja markerów autofagii znacząco redukuje zamykanie bakterii w klatkach z septyn (Ryc. 2A), a badania wykazały również, że brak klatek z septyn znacząco ogranicza rekrutację markerów autofagii8. Zatem, przynajmniej w przypadku Shigella, montaż klatek z septyn i formowanie autofagosom można uznać za procesy współzależne. Inne wymagania komórkowe dla kompartymentalizacji Shigella przez klatki z septyn obejmują polimeryzację aktyny oraz aktywność aktynomiozyny (Ryc. 2B).

Nie istnieje naturalny mysi model shigellozy, a badanie patogenezy Shigella, biologii septyn oraz bakteryjnej autofagii in vivo może przynieść korzyści dzięki nowemu modelowi zwierzęcemu infekcji – larwom danio pręgowanego19. Możliwe jest zakażenie larw danio pręgowanego poprzez wstrzykiwanie bakterii w różne miejsca anatomiczne, takie jak wstrzyknięcia dożylne w ogonie w eksperymentach dotyczących przeżywalności oraz wstrzyknięcia do mięśni ogona w celu przeprowadzenia mikroskopii in vivo (Rycina 3A). W zależności od dawki, S. flexneri wstrzyknięte larwom danio pręgowanego mogą zostać usunięte z organizmu w ciągu 48 h po zakażeniu lub mogą doprowadzić do postępującej i ostatecznie śmiertelnej infekcji (Ryciny 3B-3D). Czynniki wirulencji Shigella są eksprymowane w temperaturze 28 °C, która jest optymalną temperaturą wzrostu danio pręgowanego, a infekcja danio pręgowanego przez Shigella jest ściśle zależna od jego systemu sekrecji typu III (T3SS)19, będącego kluczowym determinantem wirulencji w chorobie u ludzi. Podsumowując, spostrzeżenia te wskazują, że larva danio pręgowanego stanowi cenny nowy model gospodarza do analizy in vivo infekcji Shigella.

Przezroczystość optyczna larw danio pręgowanego umożliwia wizualizację tworzenia klatek septynowych in vivo (Rysunek 4A), co jest osiągnięciem, którego nigdy wcześniej nie udało się zrealizować z wykorzystaniem modeli gospodarzy ssaków. Aby uzupełnić dowody wskazujące na to, że klatki septyn więżą bakterie skierowane do autofagii in vivomożna zainfekować transgeniczne larwy danio pręgowanego wykazujące ekspresję GFP-Lc3 i obserwować rekrutację markerów autofagii do Shigella (Rysunek 4B). Do analizy ultrastrukturalnej Shigella autofagosomy in vivomikroskopia elektronowa może zostać wykorzystana do wyraźnego wykazania sekwestracji bakterii w cytozolu w obrębie wakuol o podwójnej błonie19Autofagia jest uważana za kluczowy element odporności autonomicznej komórki oraz za istotny mechanizm obronny przeciwko bakteriom wewnątrzcytozolowym.14-16W celu scharakteryzowania funkcji autofagii in vivo, można wykorzystać larwy zebrafish traktowane morfolino p62. W przeciwieństwie do podstawowego mechanizmu autofagii [np.., 36 białek związanych z autofagią (ATG)26], p62 nie jest niezbędne dla rozwoju kręgowców27 i w ten sposób larwy danio pręgowanego mogą rozwijać się prawidłowo przed zakażeniem. Co uderzające, larwy z wyczerpaniem p62, którym podano S. flexneri prowadzą do znacznie zwiększonej śmiertelności oraz zwiększonego obciążenia bakteryjnego19Zgodnie z in vitro praca wykazująca, że montaż klatki septyn jest współzależny od formowania się autofagosomów7,8, rekrutacja septyn do Shigella jest wyraźnie zmniejszone w larwach z wyczerpaniem p62 (Rysunek 4C). Dane te wykazują, że przeżywalność danio pręgowanych zależy od autofagii mediowanej przez p62 w celu kontrolowania wewnątrzkomórkowej infekcji bakteryjnej.

Mikroskopia fluorescencyjna komponentów komórkowych: DAPI, F-aktyna, SEPT9, p62, GFP-LC3; analiza nałożenia obrazów.
Rycina 1. Klatka septyn in vitro. (A) Komórki HeLa zainfekowano S. flexneri przez 4 h 40 min, utrwalono, oznakowano przeciwciałami przeciwko SEPT9 oraz faloidyną i obrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali, 1 µm. (B) Komórki HeLa zainfekowano S. flexneri przez 4 h 40 min, utrwalono, oznakowano przeciwciałami przeciwko p62 i SEPT2 i obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pasek skali, 1 µm. (C) Komórki HeLa przetransfekowano GFP-ATG8/LC3, zainfekowano S. flexneri przez 4 h 40 min, utrwalono, oznakowano przeciwciałami przeciwko SEPT2 i obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pasek skali, 1 µm. Ryciny zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Mostowy et al7.

Ekspresja białek, dane procentowe dotyczące Shigella w wyciszeniu siRNA, wykresy słupkowe, analiza Western blot.
Rycina 2. Wymagania komórkowe dla tworzenia klatek septyn wokół Shigella. (A) Komórki HeLa poddano działaniu kontrolnego (CTRL) siRNA, siRNA przeciwko p62, ATG5, ATG6 lub ATG7. Lizaty całych komórek traktowanych siRNA poddano immunoblottingowi na obecność GAPDH, p62, ATG5, ATG6 lub ATG7, aby wykazać wydajność deplecji siRNA (góra). Komórki traktowane siRNA zainfekowano S. flexneri na 4 h 40 min, utrwalono i znakowano do mikroskopii ilościowej. Wykresy (dół) przedstawiają średni % ± SEM Shigella wewnątrz klatek SEPT2 z n ≥3 eksperymentów na każdą grupę traktowania. (B) Komórki HeLa zainfekowano S. flexneri, traktowano DMSO, cytochalazyną D (CytD), latrunkuliną B (LatB), nocodazolem (Noco) lub blebbistatyną (Bleb), a po 4 h 40 min utrwalono i znakowano do mikroskopii ilościowej. Wykresy przedstawiają średni % ± SEM Shigella wewnątrz klatek SEPT2 z dwóch niezależnych eksperymentów na każdą grupę traktowania. Ryciny zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Mostowy et al7.

Eksperyment z infekcją danio pręgowanego; wykresy przedstawiają przeżywalność w czasie; poziomy fluorescencji wskazują na infekcję.
Rysunek 3. Model infekcji Shigella u danio pręgowanego. (A) Obrazy ilustrujące orientację larwy danio pręgowanego pod stereomikroskopem. (Panel lewy) Larwy danio pręgowanego 72 h po zapłodnieniu zostały ułożone bocznie na płytce do iniekcji, stroną grzbietową skierowaną w stronę igły do iniekcji. (Panel środkowy) Infekcję krwiobiegu przeprowadzono poprzez wstrzyknięcie bakterii (czerwony roztwór) do żyły ogonowej, za otworem urogenitalnym. (Panel prawy) Infekcję mięśnia ogonowego przeprowadzono poprzez wstrzyknięcie bakterii (czerwony roztwór) nad somitem. (B) Krzywe przeżywalności larw 72 h po zapłodnieniu, którym wstrzyknięto różne dawki S. flexneri i inkubowano w 28 °C przez 48 h po infekcji. Skuteczne inokulum sklasyfikowano jako niskie (<103 CFU, otwarte koła), średnie (~4 x 103 CFU, otwarte trójkąty) lub wysokie (~104 CFU, otwarte kwadraty). Średni % ± SEM (poziome paski) z n ≥3 eksperymentów na klasę inokulum. (C) Liczenie żywych bakterii w homogenatach z poszczególnych larw w różnych odstępach czasu po infekcji, mierzone poprzez wysiew na LB. Należy zauważyć, że do analizy liczbowej włączono tylko larwy, które przeżyły infekcję. Przedstawiono również średnią ± SEM (poziome paski). (D) Rozkład GFP-Shigella określony za pomocą obrazowania na żywo przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu w różnych odstępach czasu po infekcji z użyciem niskiej, średniej lub wysokiej dawki inokulum (iniekcje dożylne ogonowe). Nałożenie obrazu transmisyjnego (szary) i fluorescencji GFP (zielony). (B)-(D) Rysunki te zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Mostowy et al19.

Fluorescence microscopy, GFP-tagged Shigella, SEPT7, protein colocalization, overlay analysis.
Rysunek 4. Biologia komórki Shigella zakażenie in vivo. (A) Larwy danio pręgowanego zostały zainfekowane w mięśniu ogonowym GFP-Shigella (niska dawka) przez 24 h, utrwalone, znakowane przeciwciałami przeciwko SEPT7 (czerwony) oraz GFP (zielony) i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali, 5 µm. (B) Larwy danio pręgowanego GFP-Lc3 zainfekowano mCherry-Shigella (dawka średnia) przez 4 h, utrwalone, znakowane przeciwciałami przeciwko mCherry (czerwony) i GFP (zielony) oraz obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali, 1.5 µm. (C) Larwy danio pręgowanego traktowane morfolinami kontrolnymi (CTRL; obraz po lewej) lub p62 (obraz po prawej) zostały zainfekowane GFP-Shigella przez 4 h (dawka średnia), utrwalone, znakowane przeciwciałami przeciwko SEPT7 (czerwony) oraz GFP (zielony) i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Strzałki wskazują niektóre przykłady Shigella uwięzione w klatkach septynowych (CTRL) lub nie (deplecja p62) 4 godziny po infekcji. Pasek skali, 5 µmRysunki te zostały zmodyfikowane na podstawie opracowania Mostowy i wsp.19.

Dyskusja

Podczas monitorowania autofagii i cytoszkieletu in vitro przy użyciu komórek hodowli tkankowej, protokoły opisane w sekcjach 1 i 2 można zastosować do szerokiej gamy typów komórek hodowli tkankowej. Ponadto, aby śledzić dynamikę autofagii (np. autofagosomów ATG8 / LC3 + ve) i cytoszkieletu (np. ogony aktynowe, klatki septynowe) w czasie rzeczywistym podczas infekcji Shigella za pomocą obrazowania na żywo, komórki hodowli tkankowej mogą być przejściowo transfekowane przy użyciu konstruktów znakowanych GFP, RFP lub CFP, jak opisano wcześniej7,8. Aby zwiększyć odsetek komórek zakażonych Shigella (tj. ogólnie pożądane do analizy w czasie rzeczywistym, biorąc pod uwagę, że Shigella może zaatakować 5-30% komórek HeLa przy 100:1 MOI), bezpośrednio dodaj 400 μl Shigella (OD600 = 0,3-0,6) do komórek w 2 ml MEM (surowica) i odczekaj co najmniej 1,5 godziny po zakażeniu, aby uzyskać wystarczające wejście bakterii, ucieczka z fagosomu, replikacja, rozpoznawanie autofagii i klatka septynowa. Alternatywnie można użyć szczepu Shigella M90T AfaI, który wyraża adhezynę AfaE i ma znacznie wyższe zdolności inwazji w komórkach nabłonka w porównaniu ze szczepem M90T28. Warto zauważyć, że szczep M90T AfaI nie został jeszcze przetestowany in vivo na danio pręgowanym. Płytki z koloniami Shigella można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni i wykorzystać do kilku eksperymentów. Jednak z biegiem czasu kolonie Shigella , które utraciły plazmid wirulencji, mogą również wchłonąć czerwień Kongo i wydaje się, że zachowały swój plazmid wirulencji. Z tego powodu zalecamy stosowanie świeżych wywarów bakteryjnych, jeśli to możliwe.

Podczas monitorowania biologii komórkowej zakażenia in vivo, w protokołach opisanych w sekcjach 3 i 4 wykorzystuje się danio pręgowanego z linii AB typu dzikiego. Do monitorowania interakcji Shigella-leukocyty można wykorzystać transgeniczne linie danio pręgowanego, np. mpx:GFP lub lyz:D sRed do wizualizacji neutrofili19,29,30 lub mpeg1:mcherry do wizualizacji makrofagów19,31. Do wizualizacji autofagii in vivo można użyć transgenicznej linii19,24 zebry pręgowanego GFP-Lc3, jak opisano w sekcji 3.8.

Aby zakłócić autofagię in vivo, skuteczna dawka oligonukleotydu morfolino musi zostać oceniona doświadczalnie na podstawie jej skuteczności w hamowaniu splicingu transkryptu lub translacji białek. Wskazane jest przeprowadzenie eksperymentu miareczkowania i potwierdzenie zubożenia za pomocą RT-PCR (dla oligonukleotydu morfolinowego splicingowego) lub SDS-PAGE (dla translacyjnego oligonukleotydu morfolino-oligonukleotydowego)32. Izolację RNA z zarodków lub larw danio pręgowanego można przeprowadzić za pomocą ekstrakcji tiocyjanianianem guanidyny, fenolem i chloroformem. Aby wyekstrahować białko z larw danio pręgowanego (8 do 15 larw na probówkę), należy przeprowadzić mechaniczną homogenizację za pomocą tłuczka w 200 μl buforu do lizy (1 M Tris, 5 M NaCl, 0,5 M EDTA, 0,01% oktylofenolu, kondensatu tlenku etylenu i inhibitor proteazy). Odwirować probówki o stężeniu 19 000 x g w temperaturze 4 ° C przez 15 minut i przenieść supernatant do nowej probówki. Dodać bufor Laemmli i podgrzewać próbkę w temperaturze 95 ° C przez 15 minut. Lizaty można przechowywać w temperaturze -80 ° C do czasu ich potrzebowania i można je ocenić za pomocą Western blot, jak opisano w sekcji 2.3.

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do stosowania leków in vivo . Analiza z użyciem oligonukleotydów morfolino może być uzupełniona o uznane leki do manipulowania autofagią (np. rapamycynę i bafilomycynę). Niezakażone i/lub zakażone larwy można leczyć rapamycyną (1,5 μM) lub bafilomycyną (80 nM) rozcieńczonymi w E2, a strumień autofagiczny można ocenić za pomocą Western blot, jak opisano w 25,33. Wpływ manipulacji autofagią na wynik zakażenia i przeżywalność zakażonych larw można ocenić w sposób opisany w punkcie 3.5.

Oprócz badania determinantów komórek gospodarza, protokoły in vitro i in vivo mogą być stosowane do oceny determinantów bakteryjnych wymaganych do rozpoznawania autofagii, przy użyciu zmutowanych szczepów bakteryjnych, które są różnie rozpoznawane przez autofagię, np. ShigellaΔicsA (białko Shigella IcsA rekrutuje N-WASP, a następnie Arp2/3 do tworzenia ogona aktynowego i klatki septyny; w przypadku jego braku nie może być ogonów aktynowych, brak klatek septynowych) i ShigellaΔicsB (Shigella unika odpowiedzi autofagicznej poprzez bakteryjne białko efektorowe IcsB, co zapobiega rekrutacji maszynerii autofagicznej do IcsA; W przypadku jego braku może być więcej klatek septynowych, więcej autofagii)7,8.

Shigella nie jest naturalnym patogenem danio pręgowanego i rośnie optymalnie w temperaturze 37 °C. Prace wykazały jednak, że czynniki wirulencji niezbędne do inwazji Shigella , ucieczki z wakuoli fagocytarnej i replikacji w cytozolu mogą ulegać ekspresji i są funkcjonalne w larwach danio pręgowanego w temperaturze 28 °C19. 28 °C jest najczęściej stosowaną temperaturą w hodowli danio pręgowanego i standardową temperaturą zapewniającą prawidłowy rozwój danio pręgowanego23. Uderzające jest to, że główne zdarzenia chorobotwórcze, które prowadzą do shigellozy u ludzi (tj. śmierć komórek makrofagów, inwazja i namnażanie w komórkach nabłonka, rozprzestrzenianie się z komórki na komórkę, zapalne zniszczenie nabłonka gospodarza) są wiernie odtworzone w modelu zakażenia Shigella u danio pręgowanego19.

Geny autofagii i cytoszkieletu są wszechobecne i mają szeroki zakres funkcji biologicznych. Badania na myszach wykazały, że nokaut niezbędnych genów autofagii26 lub septyny5 jest śmiertelny dla embrionów i jest prawdopodobne, że niektóre z tych genów będą również niezbędne do rozwoju danio pręgowanego (chociaż problem ten może być zmniejszony przez fakt, że danio pręgowany ma wiele genów paralogicznych33). Jeśli tak, istnieje kilka alternatyw dla rozwiązania tego problemu, w tym (i) stosowanie odczynników farmakologicznych do regulacji autofagii i cytoszkieletu, (ii) morfoliny mogą być miareczkowane, (iii) nokaut genów może być zaprojektowany tylko dla określonych typów komórek i/lub (iv) geny zaangażowane w rozpoznawanie autofagiczne, które nie są niezbędne do rozwoju zwierząt (np. P62) mogą być celem ataku.

Podczas gdy danio pręgowany jest idealnym systemem modelowym do badania autofagii i cytoszkieletu podczas infekcji Shigella , obecnie brakuje narzędzi molekularnych. Naukowcy muszą wygenerować nowe narzędzia i stymulować specyficzną dla komórek ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania. Aby obniżyć ekspresję genów autofagii/cytoszkieletu, potrzebne są nowe sekwencje morfolino, a także można zastosować nowe metody inżynierii genomu (np. TALEN, CRISPR/Cas9). W międzyczasie kilka narzędzi opracowanych wcześniej na potrzeby badań na ludziach lub myszach może równie dobrze działać w przypadku danio pręgowanego.

Wewnątrzkomórkowa bakteria S. flexneri stała się wyjątkowym organizmem modelowym, który zajmuje się kluczowymi kwestiami w biologii, w tym zdolnością bakterii do rozpoznawania przez układ odpornościowy1,2. Komórka gospodarza wykorzystuje septyny w celu ograniczenia ruchliwości S. flexneri i skierowania ich do autofagii, krytycznego składnika autonomicznej odporności komórki7,8. Obserwacje te sugerują nowe ramy molekularne do badania autofagii i jej zdolności do degradacji bakterii cytozolowych. Głównym problemem jest obecnie pełne rozszyfrowanie leżących u ich podstaw zdarzeń molekularnych i komórkowych oraz walidacja tych zdarzeń analizowanych in vitro podczas infekcji bakteryjnej in vivo przy użyciu odpowiednich modeli zwierzęcych. W tym celu danio pręgowany został uznany za cennego nowego żywiciela do analizy infekcji S. flexneri 19. Interakcje między bakteriami a komórkami gospodarza można obrazować w wysokiej rozdzielczości, a model danio pręgowanego powinien okazać się przydatny do zrozumienia biologii komórkowej zakażenia Shigella in vivo. Larwy danio pręgowanego można wykorzystać do zbadania roli autofagii bakteryjnej w obronie gospodarza, a prace wykazały, że zaburzenia autofagii mogą niekorzystnie wpływać na przeżycie gospodarza w odpowiedzi na zakażenie Shigella 19.

Obserwacje uzyskane podczas badań nad Shigella, klatkami septynowymi i autofagią in vitro przy użyciu komórek hodowli tkankowej oraz in vivo przy użyciu larw danio pręgowanego mogą dostarczyć fundamentalnych postępów w zrozumieniu obrony gospodarza. Mogą również zasugerować opracowanie nowych strategii mających na celu zwalczanie chorób zakaźnych.

Kluczowym celem tego raportu jest zrozumienie zdarzeń molekularnych i komórkowych analizowanych in vitro (tj. autofagia, ogony aktynowe, klatki septynowe) podczas infekcji bakteryjnej in vivo w kontekście całego organizmu, z wykorzystaniem larw danio pręgowanego. Jeśli nie jesteś zaznajomiony z biologią danio pręgowanego i obchodzeniem się z nim, możesz zapoznać się ze szczegółowymi protokołami prawidłowej hodowli danio pręgowanego23 oraz analizą in vivo infekcji danio pręgowanego19,35.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Praca w laboratorium SM jest wspierana przez Wellcome Trust Research Career Development Fellowship [WT097411MA].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bafilomycyna A1Sigma-AldrichB1793 
BlebbistatinSigma-AldrichB0560
Mikrokapilary ze szkła borokrzemianowego Harvard Apparatus30038
Zgrubny manipulator ręczny NarishigeM-152
Cytochalazyna DSigma-AldrichC6762
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Sondy molekularneD1306
Drobna pęseta Dumont #5Fine Science Tools11254-20
Forchlorfeneuron Sigma-Aldrich32974
Sondy molekularneprzeciwko mysim przeciwciałom IgG (H+L) przeciwko kozomN/A 
Przeciwciało IgG (H + L) przeciwko kozi mrówkomSondy molekularneNie dotyczy
Odczynnik do transfekcji JetPEITransfekcja Polyplus Transfekcja101-01N
Latrunkulina BSigma-AldrichL5288
Przeciwciało LC3Novus BiologicalsNB100-2220
Niskotopliwa agarozaPromegaV2111
MatTek naczynie ze szklanym dnemMatTek corporationP35G-1.0-14
MEM plus L-alanylo-L-glutamina GIBCO41090028
MEM roztwór aminokwasów endogennychGIBCO11140-035
Mikrowtryskiwacz NarishigeIM-300
 Sutter Instrument Co., Novato,P-87 
Olej mineralnySigma-AldrichP35G-1.0-14
Monoklonalna antytubulina, przeciwciało acetylowane Sigma-AldrichT6793
NokodazolSigma-AldrichM1404
N-fenylotiomocznik Sigma-AldrichP7629
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Falloidyna Sondy molekularneA12379
Roztwór czerwieni fenolowejSigma-AldrichP0290
Koktajl inhibitorów proteazyPrzeciwciało Roche4693116001
p62 / SQSTM1ClinisciencePM045
RapamycynaSigma-AldrichR8781
Pirogronian soduGIBCO11360039
Odczynnik do transfekcjiLife Technologies12252-011
Twarde podłoże montażowe Vectashield zawierające DAPI Laboratoria WektoroweH-1500 
królikom Ściągacz do mikropipet

Bibliografia

  1. Ashida, H., et al. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).
  2. Phalipon, A., Sansonetti, P. J. Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival. Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).
  3. Welch, M. D., Way, M. Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse. Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).
  4. Haglund, C. M., Welch, M. D. Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton. J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).
  5. Mostowy, S., Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).
  6. Saarikangas, J., Barral, Y. The emerging functions of septins in metazoans. EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).
  7. Mostowy, S., et al. Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures. Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).
  8. Mostowy, S., et al. p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways. J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).
  9. Mostowy, S., et al. Septins regulate bacterial entry into host cells. PLoS One. 4 (15), (2009).
  10. Mostowy, S., et al. Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria. J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).
  11. Phan, Q. T., et al. Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans. mBio. 4 (e00542-13), (2013).
  12. Mostowy, S., Cossart, P. Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection. Biol Chem. 392, 831-835 (2011).
  13. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469, 323-335 (2011).
  14. Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340, 701-706 (2013).
  15. Mostowy, S. Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture. Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).
  16. Mostowy, S., Cossart, P. Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication. Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).
  17. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).
  18. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).
  19. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. Plos Path. 9, e1003588(2013).
  20. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Fixation and permeabilization of cells and tissues. Cold Spring Harb Protoc. , (2008).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-544 (2012).
  22. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  23. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. , 4-5.2, (2000).
  24. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).
  25. He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos. Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).
  26. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  27. Komatsu, M., et al. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell. 131, 1149-1163 (2007).
  28. Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).
  29. Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).
  30. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  31. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 2010-2010 (2011).
  32. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (9), (2009).
  33. He, C., Klionsky, D. J. Analyzing autophagy in zebrafish. Autophagy. 6, 642-644 (2010).
  34. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).
  35. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Klatki septynowepolimeryzacja aktynyinfekcja danio pręgowanegokomórki hodowlanemikroskopia konfokalnapatogen wewnątrzkomórkowycytoszkielet gospodarzamarkery autofagii
Zastosowanie Shigella flexneri do badania interakcji autofagia-cytoszkielet
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.