Artykuł metodologiczny

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

28.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51604

⸱

17 lipca 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

W tym artykule

Podsumowanie

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Streszczenie

Zarodek danio pręgowanego jest teraz powszechnie używany do badań podstawowych i biomedycznych w celu zbadania genetycznej kontroli procesów rozwojowych i modelowania wad wrodzonych. W ciągu pierwszego dnia życia zarodek danio pręgowanego przechodzi przez wiele etapów rozwoju, w tym zapłodnienie, rozszczepienie, gastrulację, segmentację i organogenezę struktur takich jak nerki, serce i ośrodkowy układ nerwowy. Anatomia młodego zarodka danio pręgowanego stanowi kilka wyzwań dla wizualizacji i analizy tkanek zaangażowanych w wiele z tych zdarzeń, ponieważ zarodek rozwija się w połączeniu z okrągłą masą żółtka. Tak więc, w celu dokładnej analizy i obrazowania eksperymentalnych fenotypów w utrwalonych próbkach embrionalnych między zawiązkiem ogonowym a etapem 20 somitów (odpowiednio 10 i 19 godzin po zapłodnieniu (hpf), takich jak te barwione przy użyciu hybrydyzacji in situ (WISH), często pożądane jest usunięcie zarodka z kulki żółtkowej i umieszczenie go płasko na szkiełku podstawowym. Jednak wykonanie procedury montażu płaskiego może być żmudne. W związku z tym skuteczne i wydajne przygotowanie do montażu płaskiego jest znacznie ułatwione dzięki wizualnej demonstracji techniki preparacji, a także dzięki zastosowaniu odczynników, które pomagają w optymalnym obchodzeniu się z tkankami. W tym miejscu przedstawiamy nasz protokół WISH do jedno- lub dwukolorowego wykrywania ekspresji genów w zarodku danio pręgowanego i pokazujemy, w jaki sposób można przeprowadzić procedurę płaskiego montażu na tym przykładzie barwionej utrwalonej próbki. Ten płaski protokół montażu ma szerokie zastosowanie w badaniu wielu struktur embrionalnych, które pojawiają się podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego i może być stosowany w połączeniu z innymi metodami barwienia wykonywanymi na utrwalonych próbkach zarodków.

Wprowadzenie

Danio rerio ryba pręgowany, stał się powszechnie używanym organizmem w badaniach nad biologią rozwojową. Danio pręgowany to tropikalny, słodkowodny gatunek kręgowców należący do rodziny karpiowatych (Cyprinidae). Danio pręgowany był pierwotnie wykorzystywany do badań środowiskowych w celu uzyskania informacji na temat zagrożeń związanych z potencjalnymi zanieczyszczeniami wody, ponieważ był łatwo dostępny, niedrogi i łatwy w utrzymaniu1. W ciągu ostatnich trzydziestu lat danio pręgowany stał się uznawany za genetycznie podatny system modelowy kręgowców z wielu powodów. Danio pręgowany wykazuje wysoki poziom ochrony anatomicznej i fizjologicznej z wyższymi kręgowcami, w tym ssakami2,3. Niedawna adnotacja sekwencji genomu ujawniła, że około 70% ludzkich genów ma co najmniej jeden odpowiednik danio pręgowanego4. Na przykład wiele genów ortologicznych, które odgrywają ważną rolę podczas rozwoju nerek, zostało zidentyfikowanych między tymi gatunkami5-7. Ten ogromny stopień ochrony w odniesieniu do biologii komórkowej i molekularnej umożliwił naukowcom stworzenie modeli dla szerokiego zakresu chorób człowieka u danio pręgowanego8, a danio pręgowany stał się cennym narzędziem do identyfikacji potencjalnych terapii lekowych przy użyciu chemicznych badań genetycznych9.

Ponadto, model danio pręgowanego nie tylko jest w stanie podsumować różnorodne złożone procesy rozwojowe i stany chorobowe, które są obserwowane u ludzi, ale kilka dodatkowych atrybutów również zwiększa jego atrakcyjność jako organizmu modelowego do badań embriologicznych. Danio pręgowany jest jajorodny i rozmnaża się poprzez tarło rozsiewane, co zapewnia naukowcom łatwy dostęp do zarodków od początku zapłodnienia10. Inne zalety to wielkość zarodka, przezroczystość i szybki, zewnętrzny rozwój10. Ponadto dorosłe rybki danio pręgowanego mają wysoką płodność i zazwyczaj wytwarzają stosunkowo duże rozmiary lęgów, które mogą wynosić od 200 do 500 tygodniowo, co ostatecznie umożliwia naukowcom łatwe przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, takich jak badania chemiczne oparte na fenotypie9.

Mimo to, pomimo mnóstwa zalet, które wykazuje model danio pręgowanego, istnieją wyzwania związane z analizą i komunikacją wyników eksperymentalnych uzyskanych z wczesnych etapów rozwoju. W niektórych przypadkach wrodzona anatomia zarodka danio pręgowanego może przesłonić wizualizację danych. Po zapłodnieniu początkowa komórka ulega wielu zdarzeniom rozszczepienia w miarę postępu rozwoju11. Po gastrulacji oś embrionalna wyłania się na etapie pąka ogonowego (10 hpf) tak, że jest owinięta wokół żółtka11. W miarę dalszego rozwoju w okresie segmentacji, pień będzie rósł w masę, a także wydłużał się przez wydłużenie osiowe, tak że ogon wraz z częścią samego woreczka żółtkowego wystaje z centralnej masy żółtka11. Pomiędzy stadium pączka ogonowego a stadium 20 somitów (19 hpf), próby zaobserwowania określonych cech rozwojowych po zastosowaniu różnych protokołów barwienia, takich jak WISH, mogą być trudne zarówno do wizualizacji, jak i sfotografowania ze względu na geometrię zarodka i zmętnienie woreczka żółtkowego. Jednym ze sposobów na wyeliminowanie tych wyzwań jest usunięcie żółtka, a następnie spłaszczenie zarodka do dwuwymiarowej próbki, którą można analizować w prostszy sposób.

Poniższy protokół i zasoby wideo dostarczają przewodnika, jak skutecznie usunąć żółtko i płasko zaszczepić zarodek po utrwaleniu i barwieniu, korzystając z przykładu jedno- lub dwukolorowego barwienia WISH. WISH jest szeroko stosowaną techniką, która umożliwia wykrywanie określonych kwasów nukleinowych w zachowanych próbkach, a tym samym pozwala na wykrycie miejsca (miejsc) ekspresji genów w tkankach. Techniki WISH zostały obszernie opisane i mogą być wykonywane z różnymi kolorowymi podłożami, a także z fluorescencyjnymi systemami detekcji12-20. W tym miejscu przedstawiamy nasz zmodyfikowany protokół WISH stosowany w przypadku zarodków danio pręgowanego między etapem rozwoju zawiązka ogonowego a segmentacją. Alternatywne protokoły WISH są jednak kompatybilne z opisaną tutaj procedurą montażu płaskiego, jak wspomniano na początku poniższego protokołu. Ponadto, montaż płaski może być wykorzystany w połączeniu z dowolną liczbą istniejących technik wizualizacji, takich jak immunohistochemia całej góry lub etykiety śledzenia linii komórkowych, które nie są opisane w tym protokole. Ogólnie rzecz biorąc, technika płaskiego montażu może lepiej umożliwić lepszą analizę i prezentację danych uzyskanych z eksperymentów z najwcześniejszymi etapami rozwoju embrionalnego u danio pręgowanego.

Protokół

Procedury pracy z embrionami danio pręgowanego opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame. Uwaga: Procedury opisane w częściach 1-5 zostały wykorzystane do wygenerowania obrazów zarodków przedstawionych tutaj w reprezentatywnych wynikach. Procedury opisane w częściach 1-5 można zastąpić w razie potrzeby alternatywnymi procedurami WISH12-16 lub innymi technikami wizualizacji, takimi jak znakowanie immunohistochemiczne określonych białek przy użyciu określonych przeciwciał. Podczas wykonywania płaskich mocowań na zarodkach danio pręgowanego WISH zgodnie z protokołem opisanym w częściach 1-5, początkowe utrwalanie zarodka i końcowe etapy barwienia są głównymi manipulacjami, które wpływają na zdolność do usuwania granulek żółtka z próbki w celu montażu płaskiego. Najlepsze wyniki montażu płaskiego uzyskuje się, gdy początkowe utrwalenie wykonuje się za pomocą świeżo rozmrożonego, lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA)/1x PBS, a utrwalenie końcowej reakcji barwienia WISH za pomocą lodowatego 4% PFA/1x PBS (który nie musi być świeżo rozmrożony), i zaleca się, aby czytelnicy wzięli to pod uwagę przy zastępowaniu alternatywnych metod barwienia w połączeniu z częściami 6-8.

1. Pobieranie, utrwalanie i przechowywanie zarodków

  1. Przygotować klatki godowe, umieszczając dorosłe samce i samice danio pręgowanego w komorach z wodą systemową, tak aby były oddzielone przegrodą na noc.
  2. Usuń przegrody między dorosłymi osobnikami i zbierz zapłodnione jaja za pomocą sitka do herbaty z drobnej siatki drucianej w ciągu ~ 15-30 minut od krycia, aby zebrać lęgi, które mają równoważne stadia embrionalne.
  3. Odwróć sitko do góry nogami i spłucz powierzchnię drobnym strumieniem E3 dozowanym z butelki ze spryskiwaczem, aby przenieść zarodki do naczyń inkubacyjnych zawierających około 25 ml roztworu E3.
  4. Po zebraniu lęgów podziel je na kilka szalek tak, aby około 50-60 zarodków inkubowało się w każdym naczyniu zawierającym 25 ml roztworu E3. Uwaga: Przepełnienie zarodków może prowadzić do dramatycznej asynchroniczności rozwojowej w obrębie lęgu i należy zachować ostrożność, aby tego uniknąć, aby umożliwić terminowe pobranie pożądanego stadium (stadiów).
  5. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C, aby umożliwić ocenę rozwoju zgodnie ze standardową serią oceny stopnia zaawansowania danio pręgowanego11.
  6. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby delikatnie umieścić żądaną liczbę zarodków w wybranym punkcie czasowym, do etapu 20 somitów (19 hpf), w probówce do mikrowirówki z płaskim dnem. Uwaga: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z młodymi zarodkami, ponieważ są one delikatne i mogą zostać łatwo uszkodzone przez zgniatanie lub agresywne obchodzenie się z pipetami transferowymi. Alternatywnie, szklane fiolki mogą być używane do utrwalania i przetwarzania zarodków. Do wszystkich kolejnych myć protokołem można stosować plastikowe pipety transferowe, z wyjątkiem dodawania i usuwania rybosondy (kroki 3.11, 3.14).
  7. Zastąp E3 lodowatym 4% PFA/1x PBS i utrwal zarodki w ich kosmówkach w 4% PFA/1x PBS przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub w 4 °C przez noc. Uwaga ostrzegawcza: PFA jest toksyczny, a roztwory PFA należy obchodzić się z kapturem chemicznym, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i fartuch laboratoryjny. Ponadto z proszkiem PFA należy obchodzić się z wyjątkową ostrożnością podczas przygotowywania roztworu podstawowego, ponieważ nawet granulowany PFA może mieć tendencję do rozpraszania się przez ładunek statyczny. Zazwyczaj PFA przygotowuje się przez podgrzanie 1x PBS do wrzenia w celu rozpuszczenia proszku PFA, a następnie roztwór jest przechowywany w porcjach w temperaturze -20 °C. Jeśli po schłodzeniu roztworu w 4% PFA/1x PBS znajdują się drobne osady, przefiltruj schłodzony roztwór przed podaniem do zamrożenia, przepuszczając go przez system filtrów 0,45 μm. Tylko świeżo przygotowany lub świeżo rozmrożony PFA jest używany do tego początkowego (tj. pierwotnego) utrwalenia zarodka.
  8. Usuń poprawkę i umyj zarodki dwukrotnie 1x PBST, a następnie przenieś do naczynia inkubacyjnego.
  9. Obejrzyj zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby usunąć kosmówkę otaczającą zarodki, tak aby jedna para była używana do delikatnego dźwigania zarodka, podczas gdy druga para była używana do rozerwania kosmówki.

2. Permeablacja zarodków

  1. Przenieś zdekorionowane zarodki z powrotem do probówki mikrowirówkowej lub szklanej fiolki, a następnie przepłucz dwukrotnie 1x PBST, aby usunąć wszelkie pozostałe resztki kosmówki.
  2. Usuń 1x PBST i umyj zarodki dwukrotnie 100% metanolem (MeOH).
  3. Umieścić zarodki w temperaturze -20 °C przez co najmniej 20 minut. Uwaga: Zarodki można przechowywać w temperaturze -20 °C w MeOH przez rok lub dłużej. Metanol sprawia, że kosmówka jest lepka, dlatego nie należy przechodzić do tego etapu, dopóki kosmówka nie została usunięta.
  4. Nawodnij zarodki, usuwając 100% MeOH i myj je w temperaturze pokojowej przez 5 minut każdy w 50% MeOH / 1x PBST, 30% MeOH / 1x PBST, a następnie dwukrotnie 1x PBST.
  5. Przygotować świeży roztwór roboczy proteinazy K (5 μg/ml), dodając 25 μl świeżo rozmrożonej proteinazy K (10 mg/ml) do 50 ml 1x PBST.
  6. Usuń 1x PBST z zarodków, a następnie zastąp roztworem roboczym proteinazy K i inkubuj w oparciu o stadium embrionalne: < = 5 somitów przez 1 min; 10-12 somitów przez 1,5 min; 15 somitów przez 2 min i 20 somitów przez 3 min.
  7. Usuń roztwór roboczy proteinazy K i umyj zarodki dwukrotnie 1x PBST.
  8. Usuń 1x PBST i zastąp lodowatym 4% PFA/1x PBS na co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.

3. Synteza rybosondy, prehybrydyzacja, hybrydyzacja i usuwanie sondy

  1. Zmontować antysensowną rybosondę w reakcji transkrypcji in vitro w temperaturze pokojowej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, utrzymując enzymy na lodzie, łącząc matrycę DNA zawierającą sekwencję odpowiadającą interesującemu genowi (albo 100-200 ng produktu PCR, albo 1,5 μg linearyzowanego plazmidu DNA, przygotowanego zgodnie z opisem12,13), 2 μl rybonukleotydów znakowanych digoksygeniną lub fluoresceiną, 2 μl odpowiedniej polimerazy RNA (SP6, T3, T7 w zależności od tego, która sekwencja jest włączona do produktu PCR lub obecna na plazmidzie DNA), 2 μl 10x buforu transkrypcyjnego, 0,5 μl inhibitora RNazy i doprowadzić do całkowitej objętości 20 ul wodą destylowaną o czystości cząsteczkowej (DNaza, Nie zawiera RNazy). Uwaga: 10-krotny bufor transkrypcyjny należy wstępnie podgrzać, umieszczając probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10-20 minut, a następnie przemieszać, aby upewnić się, że wszystkie składniki są w roztworze. Jeśli obecne są białe płatki, inkubuj probówkę przez kolejne 5-10 minut i ponownie wiruj. Reakcje transkrypcyjne mogą zakończyć się niepowodzeniem lub mieć niską wydajność, jeśli bufor transkrypcyjny nie zostanie całkowicie rozpuszczony i dokładnie wymieszany.
  2. Wymieszać składniki i inkubować każdą reakcję w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w łaźni wodnej.
  3. Wyjąć probówkę (probówki) reakcyjną z łaźni wodnej i zniszczyć matrycę DNA w każdej próbce, dodając 5 μl 10x buforu DNazy I, 2 μl enzymu DNazy I i 23 μl wody destylowanej o czystości cząsteczkowej, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 μl, a następnie inkubować każdą probówkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut w łaźni wodnej.
  4. Przeprowadzić wytrącanie etanolu w każdej probówce mikrowirówki, dodając 5 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 110 μl lodowatego 100% etanolu, a następnie 1 μl glikogenu, aby ułatwić wizualizację osadu RNA w kolejnych krokach, a następnie inkubować probówkę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
  5. Odwirować każdą probówkę do mikrowirówki z maksymalną prędkością 4 °C przez 20 minut, następnie usunąć 100% supernatant etanolu i zastąpić 100 μl 70% lodowatego etanolu.
  6. Odwirować każdą probówkę do mikrowirówek w temperaturze 4 °C przez 5 minut, następnie usunąć 70% supernatant etanolu i wysuszyć granulkę na powietrzu przez 5 minut, a następnie dodać 100 μl wody destylowanej o czystości cząsteczkowej w celu ponownego zawieszenia osadu i ilościowego określenia stężenia rybosondy za pomocą spektrofotometru nanokroplowego. Uwaga: Gdy osad znajdzie się w roztworze, wywar rybosondy powinien być przechowywany na lodzie i przechowywany w temperaturze -20 °C.
  7. Aby przygotować utrwalone zarodki do procesu prehybrydyzacji, należy usunąć 4% PFA/1x PBS z każdej próbki i umyć zarodki dwukrotnie 1x PBST.
  8. Przenieś od 25 do 40 zarodków w 1x PBST do każdej pojedynczej probówki do mikrowirówki z płaskim dnem. Uwaga: Przepełnienie zarodków doprowadzi do nierównomiernego barwienia w późniejszym czasie i należy zachować ostrożność, aby ograniczyć wielkość próbki w każdej probówce do około 40 zarodków.
  9. Zastąp 1x PBST w każdej probówce na 500-1,000 μl HYB+.
  10. Umieścić probówkę (probówki) z zarodkami w piecu ustawionym na 70 °C i inkubować je w tej temperaturze przez 4 godziny w celu przeprowadzenia prehybrydyzacji.
  11. Przygotować roztwór rybosondy/HYB+, dodając 100-500 ng rybosondy (digoksygeniny i/lub znakowanej fluoresceiną) do 500 μl świeżego HYB+, a następnie inkubować ten roztwór w temperaturze 70 °C przez co najmniej 20 minut przed krokiem 3.11 w celu jego wstępnego ogrzania. Uwaga: Aby wykryć wiele transkryptów genów, przy użyciu pojedynczego i/lub podwójnego znakowania kolorymetrycznego, każda z rybosond odpowiadających tym genom musi zostać połączona w jeden koktajl rybosondy/HYB+.
  12. Usuń prehybrydyzację HYB+ z każdej probówki zarodków i zastąp ją wystarczającą ilością rybosondy/HYB+, aby pokryć zarodki. Uwaga: Zazwyczaj potrzeba 200-250 μl rybosondy/HYB+, aby pokryć zarodki w jednej probówce do mikrowirówki z płaskim dnem. Dodawanie i usuwanie rybosondy/HYB+ jest zwykle wykonywane za pomocą pipety i końcówek barierowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między próbkami.
  13. Inkubować zarodki w temperaturze 70 °C przez noc za pomocą sondy rybrosondowej/HYB+.
  14. Przygotuj następujący zestaw roztworów myjących i podgrzej je przez noc w temperaturze 70 °C: 50% formamidu/2x SSCT, 2x SSCT i 0,2x SSCT. Uwaga: Wygodnie jest przygotować 50 ml porcji każdego roztworu do mycia, ponieważ nadmiar można przechowywać w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie podgrzać do wykorzystania w przyszłości.
  15. Usunąć rybosondę/HYB+ za pomocą pipety i końcówek barierowych i przechowywać w temperaturze -20 °C. Uwaga: Zazwyczaj każda mieszanina rybosondy/HYB+ może być użyta kilka razy (np. 3 lub więcej) bez osłabiania sygnału. Chociaż ponownie wykorzystana rybosonda/HYB+ wiąże się z niższym tłem, należy jednak pamiętać, że ponownie wykorzystane mieszaniny rybosondy mogą ulegać degradacji.
  16. Umyć zarodki dwukrotnie 50% formamidem/2x SSCT przez 30 minut w temperaturze 70 °C.
  17. Płukać zarodki raz za pomocą 2x SSCT przez 15 minut w temperaturze 70 °C.
  18. Płukać zarodki dwukrotnie 0,2x SSCT przez 30 minut w temperaturze 70 °C.
  19. Usunąć 0,2x SSCT i dwukrotnie przemyć zarodki MABT w temperaturze pokojowej.

4. Inkubacja i wykrywanie przeciwciał anty-digoksygenowych

  1. Przygotuj świeży roztwór blokowy.
  2. Usuń MABT i zastąp go roztworem blokowym.
  3. Inkubować zarodki w roztworze blokowym przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej. Uwaga: Dłuższe inkubacje blokowe zapewniają optymalne wyniki w stadiach zarodków młodego danio pręgowanego (<15 somitów). Aby przeprowadzić długotrwałą procedurę blokową, należy przeprowadzić inkubację blokową przez 8-12 godzin w temperaturze pokojowej lub kombinację temperatury pokojowej plus (do ~8 godzin) późniejszą inkubację w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Przygotować roztwór przeciwciała anty-digoksygeninowego, wykonując 5000-krotne rozcieńczenie w świeżym roztworze blokowym (np. 1 μl na 5 ml bloku).
  5. Usunąć blok i dodać roztwór przeciwciała/bloku.
  6. Przykryć próbkę folią i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
  7. Usunąć blok anty-digoksygeniny i umyć zarodki co najmniej 10 razy za pomocą MABT. Uwaga: Przenieś zarodki do 12-dołkowych naczyń w celu przepłukania MABT. Zwiększa to szybkość, z jaką zarodki mogą być myte, co jest przydatne przy przetwarzaniu dużych ilości próbek i ułatwia monitorowanie postępu reakcji barwienia (krok 4.11) pod mikroskopem stereoskopowym. Uwaga: Na tym etapie zarodki można "przemyć" poprzez inkubację przez noc w MABT w temperaturze 4 °C przed przejściem do etapu 4.8, co jest użytecznym sposobem leczenia w przypadku sond, które mają tendencję do dawania wysokiego tła lub plam, które wymagają długiego monitorowania w ciągu dnia pracy.
  8. Przygotuj bufor do wstępnego barwienia i żądany roztwór barwiący (fioletowe lub czerwone podłoże).
  9. Usunąć MABT i umyć zarodki w buforze do wstępnego barwienia przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Usuń bufor do wstępnego barwienia i dodaj roztwór barwiący.
  11. Monitoruj postęp reakcji barwienia w temperaturze pokojowej co 15-30 minut, sprawdzając wygląd zarodków pod mikroskopem stereoskopowym. Uwaga: Szybkość reakcji barwienia można spowolnić, przenosząc próbki do temperatury 4 °C, jeśli konieczne jest zapewnienie więcej czasu na zakończenie barwienia. Jednak po schłodzeniu do 4 °C reakcji nie można przyspieszyć przez podgrzanie do temperatury pokojowej.
  12. Po zakończeniu reakcji barwienia usuń roztwór barwiący i zastąp go 1x PBST.
  13. Przemyć dwukrotnie 1x PBST przez 5 minut. Uwaga: Jeśli nie wykryjesz innych genów z innym substratem, utrwal próbki w lodowatym roztworze 4% PFA/1x PBS przez co najmniej 20 minut i przejdź do kroku 6.1. W przeciwnym razie przejdź do kroku 5.1.

5. Inkubacja i wykrywanie przeciwciał antyfluoresceinowych

  1. Usuń 1x PBST i umyj zarodki dwukrotnie 0,1 M glicyną o pH 2,2 przez 15 minut każdy w temperaturze pokojowej. Uwaga: Czas płukania glicyną jest niezbędny do całkowitego dezaktywacji pierwszej reakcji barwienia.
  2. Usunąć 0,1 M glicyny i dwukrotnie przemyć zarodki MABT przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować roztwór przeciwciała antyfluoresceinowego, rozcieńczając go 5 000 razy w świeżym roztworze blokowym (np. 1 μl na 5 ml bloku).
  4. Usunąć MABT i dodać roztwór przeciwciała/bloku. Wykonaj kroki 4.6-4.13, aby przeprowadzić detekcję rybosondy znakowanej fluoresceiną. Uwaga: Po zakończeniu końcowej reakcji barwienia ważne jest, aby ostatnie utrwalenie próbki zostało wykonane w lodowatym 4% PFA/1X PBS. Utrwalanie cieplejszymi roztworami PFA zwykle wiąże się z lepkim żółtkiem, które jest trudne do usunięcia z zarodka podczas sekcji i odżółkowywania w przypadku procedury płaskiego mocowania.

6. Sekcja zarodka i wstępne odżółkowanie zarodka

  1. Wybierz stały, wybarwiony zarodek do montażu płaskiego.
  2. Za pomocą pipety transferowej umieść wybraną próbkę zarodka na plastikowej lub szklanej szalce Petriego zawierającej 1x PBST.
  3. Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym i zwiń zarodek za pomocą cienkich kleszczy lub narzędzia do rzęs, aby uzyskać widok boczny i uwidocznić końce głowy i ogona.
  4. Użyj jednej pary cienkich kleszczy, aby wykonać nacięcie w żółtku w miejscu znajdującym się centralnie między głową a ogonem zarodka, a w międzyczasie użyj drugiej pary cienkich kleszczy do przytrzymania zarodka, aby zapewnić dźwignię do nacięcia żółtka. Uwaga: Alternatywnie wykonaj dwa duże nacięcia w żółtku, jedno blisko głowy, a drugie blisko ogona zarodka.
  5. Użyj cienkich kleszczyków i/lub narzędzia do rzęs, aby zgarnąć żółtko z jamy żółtka.
  6. Delikatnie opłucz zarodek 1x PBST, aby usunąć zabłąkane żółtko.

7. Drobne żółtkowanie zarodka

  1. Przenieś zarodek na płaskie szkiełko z 1-2 kroplami 1x PBST.
  2. Użyj narzędzia do rzęs i cienkich kleszczyków, aby delikatnie ustawić zarodek brzuszną stroną (żółtkiem) skierowaną do góry na szklanym szkiełku.
  3. Przeciągnij zarodek do krawędzi roztworu 1x PBST za pomocą narzędzia do rzęs, tak aby zarodek pozostał w płaskiej pozycji na szkiełku
    4. podstawowym.
  4. Delikatnie zeskrobać brzuszną powierzchnię zarodka za pomocą narzędzia do rzęs, aby usunąć granulki żółtka bez rozrywania zarodka. Jednocześnie użyj pary cienkich kleszczy, aby zakotwiczyć zarodek podczas skrobania narzędziem do rzęs. Uwaga: Usunięcie granulek żółtka może wymagać wielokrotnego skrobania przez 5-10 minut.
  5. Jeśli roztwór PBST zostanie zaśmiecony nadmiarem żółtka lub zacznie parować, dodaj 1-2 świeże krople 1x PBST do szkiełka za pomocą plastikowej lub szklanej pipety transferowej, a następnie przeciągnij zarodek do obszaru z czystym roztworem w celu dalszego usuwania granulek żółtka.
  6. Gdy żółtko zostanie usunięte w zadowalający sposób, należy użyć pipety do przenoszenia, aby delikatnie przenieść zarodek z powrotem do plastikowej lub szklanej szalki Petriego zawierającej 1x PBST w celu ostatecznego płukania w celu usunięcia zabłąkanych granulek żółtka.
  7. Przenieść ożółkowany zarodek za pomocą plastikowej lub szklanej pipety transferowej na plastikową lub szklaną szalkę Petriego zawierającą 100% glicerolu.
  8. Inkubuj zarodek w 100% glicerolu przez ~5 minut, aby zaaklimatyzować zarodek.

8. Montaż na szkiełku

  1. Przenieś odżółkowany zarodek na czyste szklane szkiełko w 1-2 kroplach 100% glicerolu.
  2. Umieść zarodek brzuszną stroną (żółtkową) skierowaną w stronę szkiełka stałego.
  3. Za pomocą narzędzia do rzęs przeciągnij zarodek do krawędzi kropli glicerolu tak, aby zarodek pozostał w płaskiej pozycji na szkiełku podstawowym. Jeśli oś zarodka jest zakrzywiona, użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie wykonać bardzo małe nacięcia w pozostałej błonie komórkowej żółtka, aby zmniejszyć napięcie, tak aby zarodek można było ułożyć płasko na szkiełku z prostą osią.
  4. Umieść małe wgłębienia z plasteliny na czterech rogach szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm. Uwaga: Alternatywnie małe krople smaru próżniowego15 można zastąpić plasteliną.
  5. Powoli umieszczać szkiełko nakrywkowe na zarodku, ustawiając szkiełko nakrywkowe pod kątem, aby zminimalizować wytwarzanie się pęcherzyków powietrza w glicerolu wokół próbki.
  6. Dodaj dodatkową kroplę 100% glicerolu z boku szklanego szkiełka nakrywkowego, aby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym.
  7. Powoli i ostrożnie dociśnij cztery rogi szkiełka nakrywkowego, aby mocno ustawić zarodek między szkłem i wyeliminować dryfowanie. Uwaga: Uważaj, aby nie zmiażdżyć zarodka.
  8. Jeśli zarodek nie jest umieszczony zgodnie z oczekiwaniami, użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć szkiełko nakrywkowe. Użyj narzędzia do rzęs, aby zmienić położenie zarodka i/lub cienkich kleszczy, aby wykonać dodatkowe nacięcia, aby można było zmienić położenie zarodka. Powtórz kroki 8.4-8.7.
  9. Obserwuj i/lub zobrazuj próbkę za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub złożonego.
  10. Preparat do montażu płaskiego należy przechowywać płasko z tekturowym uchwytem na szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni lub tymczasowo w temperaturze pokojowej. Uwaga: Plama WISH będzie z czasem stopniowo blaknąć, szczególnie w reakcjach z czerwonym substratem, i nie może być konserwowana w glicerolu w nieskończoność. Fioletowe plamy również łatwiej blakną, jeśli są przechowywane w glicerolu w porównaniu z PFA (patrz krok 8.11). Co ciekawe, opublikowano, że umieszczanie zarodków w permount, a nie w glicerolu, może umożliwić przechowywanie w nieskończoność w temperaturze pokojowej15.
  11. W celu długotrwałego przechowywania próbek barwionych na purpurowym podłożu, usuń szklane szkiełko nakrywkowe i opłucz zarodek dwukrotnie przepłukany w 1x PBST, a następnie przenieś do probówki mikrowirówkowej z 4% PFA/1x PBS w celu długotrwałego przechowywania. Uwaga: Alternatywnie, zarodki w 1x PBST mogą być przetwarzane do dodatkowych analiz, takich jak izolacja DNA w celu genotypowania.

Wyniki

Procedura protokołu przygotowania preparatu płaskiego polega na przekształceniu zarodka danio pręgowanego z jego naturalnej anatomii, w której oś ciała jest owinięta wokół centralnie położonego żółtka, w preparat dwuwymiarowy (Rysunek 1A). Obrazowanie całego zarodka młodego danio pręgowanego jest ograniczone przez sposób, w jaki oś embrionalna owija się wokół żółtka. W rezultacie widoki boczne lub grzbietowe okazów zarodków barwionych metodą whole mount mogą uchwycić jedynie fragment osi lub przesłonić konkretne tkanki (Rysunek 1B). W porównaniu z tym, usunięcie żółtka i spłaszczenie zarodka umożliwia jednoczesną wizualizację całej osi embrionalnej (Rysunek 1B). Ograniczenia te zademonstrowano, badając zarodek barwiony metodą WISH, w którym zastosowano przeciwsensowne sondy ryboprobowe do wykrycia irx3b (kolor fioletowy), znakującego podzbiór progenitorów nerkowych zlokalizowanych sąsiadująco z somytami od 7 do 13, oraz myod1 (kolor czerwony), który znakuje somyty (Rysunek 1B). Pole progenitorów nerkowych irx3b+ jest przesłonięte w bocznym widoku całego preparatu, ponieważ transkrypty irx3b są liczne w ośrodkowym układzie nerwowym, co sprawia, że wizualizacja pola nerkowego pod kątem bocznym jest praktycznie niemożliwa; ponadto pole progenitorów nerkowych irx3b+ jest widoczne tylko częściowo, gdy zarodek zostanie obrócony do widoku grzbietowego, ponieważ pole to jest owinięte wokół żółtka (Rysunek 1B). Jednakże widok grzbietowy tego samego zarodka po przygotowaniu preparatu płaskiego umożliwia prostą analizę całego pola progenitorów nerkowych irx3b+ w relacji do somytów wzdłuż tułowia i innych struktur embrionalnych (Rysunek 1B). W ten sposób skomplikowane domeny przestrzenne mogą zostać idealnie udokumentowane za pomocą tej metody.

Pomyślne przeprowadzenie procedury preparatów płaskich (flat mount) składa się z kilku kluczowych etapów. Aby zastosować tę technikę, w pierwszej kolejności należy oddzielić worek żółtkowy od właściwego zarodka (Rysunek 2A), co można osiągnąć za pomocą precyzyjnych narzędzi, takich jak pęseta anatomiczna, podczas obserwacji zarodka pod stereomikroskopem. Po wstępnym usunięciu worka żółtkowego wykorzystuje się cienkie narzędzie z rzęsy, aby zeskrobać ziarna żółtka, które pozostały przyczepione do zarodka (Rysunek 2B). Usunięcie pozostałych ziaren żółtka ułatwia wizualizację tkanek zarodkowych. Na koniec zarodek pozbawiony żółtka jest manipulowany w celu stabilnego umieszczenia go na szkiełku przedmiotowym (Rysunek 2C), co umożliwia obserwację i pomaga w dokumentacji próbki przy użyciu oprogramowania do obrazowania oraz kamery przymocowanej do mikroskopu. Narzędzia z rzęs są urządzeniami domowej roboty, które można wykonać, przyklejając odpowiednią rzęsę do końcówki pipety za pomocą superglue; w razie potrzeby można je zamontować na uchwycie (Rysunek 3A, tabela z materiałami). Można pozyskać różne rodzaje rzęs, aby stworzyć narzędzia o nieco innych charakterystykach pod kątem długości i zwężenia (Rysunek 3B), zależnie od preferencji użytkownika, które pojawią się podczas eksperymentowania z procedurą preparatów płaskich. Przykłady próbek rzęs obejmują naturalnie wypadłe ludzkie rzęsy, naturalnie wypadłe sztywne włosy lub wibrysy zwierzęce, a także syntetyczne rodzaje rzęs dostępnych w handlu w działach kosmetycznych.

Obszar lokalny otaczający i zawierający próbkę(i) umieszczone na szkiełku przedmiotowym (Rysunek 4A) może zostać zobrazowany w celu przeprowadzenia analizy o wysokiej rozdzielczości. Wykorzystano kombinację sond do znakowania rozwijających się progenitorów nerkowych, z których powstaje nerka w zarodku typu dzikiego we wczesnych stadiach rozwoju, za pomocą dwukolorowego WISH, a następnie wykonano preparaty typu flat mount w celu obejrzenia próbek (Rysunek 4B, 4C). Podczas wczesnych stadiów somytowych progenitorzy nerkowi są wyznaczeni w kształcie litery U przez ekspresję transkryptytów pax2a (fioletowy), otaczających mezodermę paraksjalną, która jednocześnie wykazuje ekspresję delta C (dlc) (czerwony) (lewa kolumna, Rysunek 4B)6,7. W porównaniu, gdy transkrypty dlc wykryto przy użyciu fioletowego substratu i znakowano w połączeniu z markerem tylnego mózgu krox20 (czerwony), zwizualizowano rostralny poddomenę progenitorów nerkowych wykazującą ekspresję dlc (prawa kolumna, Rysunek 4B), co odnotowano wcześniej6,7. Preparaty typu flat mount mogą być analogicznie wykorzystywane do badania późniejszych stadiów somitogenezy. W stadium 14 somytów przeanalizowano ekspresję markerów nerkowych pax2a, slc4a4 i slc12a3 (fioletowy) wraz z smyhc1 (czerwony), który znakuje somity (Rysunek 4C). Kombinacje te umożliwiają mapowanie całej domeny progenitorów nerkowych za pomocą pax2a, wykazując jednocześnie, że podzbiór komórek w rostralnej poddomenie wykazuje ekspresję slc4a4a i jest odróżniony od niepokrywającej się z nim kaudalnej poddomeny progenitorów nerkowych wykazującej ekspresję slc12a3.

Dwukolorowy WISH oraz przygotowanie preparatu w płaskiej montażu są również cenne w badaniu domen komórkowych podczas organogenezy u danio pręgowanych z mutacjami genetycznymi lub innymi zaburzeniami wynikającymi z ekspozycji środowiskowej na małe cząsteczki6,7 (Rycina 5). Mutanty nls i lib danio pręgowanego posiadają mutacje w genie dehydrogenazy aldehydowej 1a2 (aldh1a2, wcześniej znanym jako raldh2), który koduje enzym niezbędny do biosyntezy kwasu retinowego (RA). RA jest kluczowy dla prawidłowego rozwoju wielu typów komórek nerkowych, w tym dla tworzenia podocytów, które budują filtr krwi w embrionalnej nerce, znanym jako kłębuszek6,7. WISH przeprowadzono w celu oznakowania progenitorów podocytów za pomocą wt1a równolegle z wyznaczeniem rozwijających się somytów za pomocą smyhc1 oraz tylnego mózgu za pomocą krox20 w embrionach typu dzikiego, embrionach mutantów nls, embrionach mutantów lib oraz embrionach traktowanych chemicznym inhibitorem enzymu aldh, DEAB (Rycina 5). Embriony z niedoborem ekspresji aldh1a2 wykazały zredukowaną ekspresję wt1a w porównaniu z embrionami typu dzikiego, natomiast embriony traktowane DEAB wykazały zniesienie transkrypcji wt1a (Rycina 5, prawa kolumna). Podsumowując, te reprezentatywne wyniki pokazują, jak technika płaskiego montażu może być wykorzystana do precyzyjnej analizy i dokumentowania różnic anatomicznych we wczesnym embrionie, a tym samym wdrażana w wartościowych badaniach rozwojowych.

Proces usuwania żółtka z zarodka; widok boczny całego preparatu oraz widok grzbietowy preparatu płaskiego; schemat stadiów somitycznych.
Rycina 1. Przegląd przygotowania preparatu płaskiego dla zarodków ryb zebrafish. A) Procedura przygotowania preparatu płaskiego umożliwia jednoczesny wgląd w tkanki wzdłuż osi embrionalnej, ponieważ centralna masa żółtka zostaje usunięta, a zarodek stabilnie ułożony na płaskiej powierzchni. B) Obrazy zarodka barwionego metodą WISH w widoku bocznym i grzbietowym, a następnie po wykonaniu preparacji płaskiej. Zarodek został zabarwiony sondami antysensownymi w celu wykrycia transkryptów genów kodujących irx3b (fioletowy) oraz myod1 (czerwony).

Schematyka preparowania zarodka Drosophila; precyzyjna pęseta, narzędzie do rzęs, modelina na szkiełku przedmiotowym.
Rysunek 2. Schemat procedury przygotowania preparatu płaskiego dla zarodków danio pręgowanego. A) W pierwszej kolejności z zarodka usuwa się główną masę żółtka, następnie (B) z powierzchni brzusznej precyzyjnie usuwa się pozostałe granulki żółtka, a po przemyciu zarodek zostaje (C) zamocowany stroną grzbietową do góry na szkiełku przedmiotowym w celu analizy wizualnej i/lub dokumentacji fotograficznej.

Narzędzia mikrochirurgiczne do precyzyjnej dyssekcji ze skalą pomiarową; szczegółowy widok końcówek igieł.
Rysunek 3. Zdjęcia przykładowych narzędzi z rzęs w porównaniu z precyzyjną pęsetą. A) Własnoręcznie wykonane narzędzia z rzęs zostały sfotografowane obok standardowej pary precyzyjnej pęsety, umieszczonych sąsiadująco z linijką metryczną w celu zapewnienia punktu odniesienia. B) Powiększony widok narzędzi z rzęs obok precyzyjnej pęsety, z milimetrową skalą odniesienia widoczną u góry obrazu. Pokazano dwa różne narzędzia z rzęs; pojedyncza gwiazdka (*) oznacza rzęsę uzyskaną z naturalnie wypadłej ludzkiej rzęsy, a podwójna gwiazdka (**) oznacza rzęsę uzyskaną z naturalnie wypadłego wąsa kota, przyciętą w celu uzyskania nieco tępego końca. W każdym przypadku rzęsa została przełożona przez końcówkę pipety i przymocowana kilkoma warstwami superkleju, aby stopniowo stworzyć trwałe uszczelnienie stabilizujące/zakotwiczające rzęsę w pipecie przymocowanej do urządzenia manipulacyjnego.

Rozwój zarodka danio pręgowanego; analiza ekspresji genów; schemat histologiczny; markery pax2a/dlc.
Rysunek 4. Charakterystyka zmian rozwojowych w polu progenitorów nerkowych w zarodku danio pręgowanego typu dzikiego. A) Schemat preparatu wskazujący obszar obrazowany w celu analizy w (B, C). B) Zarodki typu dzikiego na etapie 1, 3 i 5 somytów zostały poddane dwukolorowej hybrydyzacji in situ (WISH), aby ocenić skład pola progenitorów nerkowych, z których powstaje nerka embrionalna, czylipronefros. (Lewa kolumna) Transkrypty kodujące czynnik transkrypcyjny pax2a (zbarwione na fioletowo) wyznaczają kilka populacji w zarodku, w tym pole progenitorów nerkowych wyłaniające się z mezodermy pośredniej. Transkrypty kodujące ligand Notch dlc wyznaczają somyty powstające z mezodermy paraksjalnej (zbarwione na czerwono). (Prawa kolumna) Podczas badania ekspresji transkryptów dlc (zbarwione na fioletowo) oraz markera rombomerów tylnego mózgu krox20 (zbarwione na czerwono) w tych samych zarodkach, ekspresję dlc można zaobserwować w rostralnej poddomenie progenitorów nerkowych położonej sąsiadująco z somytami 1-5, która była przesłonięta podczas wspólnego barwienia dlc z pax2a. C) Zarodki typu dzikiego na etapie 14 somytów zostały poddane podwójnemu lub potrójnemu barwieniu z kombinacją markera nerkowego (fioletowy), markera somytów smyhc1 (czerwony) oraz markera rombomerów tylnego mózgu krox20 (również czerwony). (Górny panel) Na tym etapie transkrypty pax2a nadal wyznaczają progenitorów nerkowych. (Środkowy i dolny panel) W obrębie terytorium progenitorów nerkowych rostralna poddomena jest wyznaczona przez slc4a4, a transkrypty kodujące slc12a3 wyznaczają poddomenę kaudalną.

Schemat zarodka rybki zebrafish, porównanie ekspresji genów: wt1a, smyhc1, krox20 w typie dzikim i mutantach.
Rysunek 5. Wykorzystanie preparatów rozplanowanych (flat mounted) do charakterystyki fenotypów wywołanych mutacjami genetycznymi lub chemicznymi perturbacjami genetycznymi modulującymi biosyntezę kwasu retinowego.Wzorzec ekspresji WISH na etapie 15 somitów dla wt1a (fioletowy) i smyhc1/krox20 (czerwony) porównano pomiędzy typami dzikimi a zarodkami z niedoborami produkcji kwasu retinowego (RA) wynikającymi z defektów dehydrogenazy aldehydowej 1a2 (mutacje nls i lib) lub chemicznej inhibicji aktywności dehydrogenazy retinaldehydowej za pomocą diethylaminobenzaldehydu (DEAB). Redukcja produkcji RA w mutancie lib jest nieco silniejsza niż w nls, tak że zarodki lib wykazują nieco słabsze barwienie transkryptów wt1a niż zarodki mutanty nls na podobnym etapie rozwoju, podczas gdy traktowanie typów dzikich DEAB wiąże się z całkowitym zniesieniem ekspresji wt1a.

Dyskusja

W ostatnich latach danio pręgowany okazał się niezwykle cennym organizmem modelowym w całej społeczności naukowej. Danio pręgowany wykazuje znaczny stopień ochrony genetycznej w porównaniu z wyższymi kręgowcami, a zalety związane z ich anatomią, hodowlą i cyklem życiowym sprawiają, że gatunek ten jest bardzo podatny na analizy eksperymentalne. Co więcej, postęp w technikach molekularnych mających zastosowanie do danio pręgowanego jeszcze bardziej przyczynił się do wykorzystania tego organizmu modelowego w badaniach naukowych. Na przykład, stworzono wiele różnych transgenicznych linii danio pręgowanego, aby zbadać postęp choroby i odpowiedzieć na wiele podstawowych pytań, które leżą u podstaw kluczowych mechanizmów rozwoju, w tym organogenezy.

W związku z tym, w oparciu o dynamiczne wykorzystanie danio pręgowanego zarówno w badaniach nad chorobami, jak i rozwojem, metodologie znakowania komórek i kwantyfikacja sygnałów są kluczowym aspektem analiz danych. Podczas gdy metody wykorzystujące przeciwciała fluorescencyjne mogą być stosowane do wykrywania ekspresji białek u transgenicznego danio pręgowanego, naukowcy zazwyczaj polegają na standardowych procedurach, takich jak WISH12-16, aby zbadać czasoprzestrzenną lokalizację transkryptów genów w stałej, nietransgenicznej próbce danio pręgowanego. W rzeczywistości WISH jest jedną z najczęściej stosowanych technik w biologii i jest istotnym narzędziem używanym do charakteryzowania fenotypu mutacji genetycznych i chemicznych zaburzeń genetycznych. Niemniej jednak WISH wiąże się z wieloma potencjalnymi pułapkami i wyzwaniami. Aby potwierdzić swoistość antysensownej rybosondy, rybosondy sensacyjne mogą być używane jako kontrola do oceny swoistości wzorców barwienia antysensownej rybosondy. Podczas gdy sekcje 4 i 5 są przedstawione w kolejności etykietowania i wykrywania sondy znakowanej digoksygeniną, a następnie sondy znakowanej fluoresceiną, kolejność tę można odwrócić. Zazwyczaj słabsze sygnały (geny o niższych poziomach ekspresji) są najlepiej wykrywane za pomocą sond znakowanych digoksygeniną, a to barwienie rozwija się najpierw za pomocą fioletowego substratu, a następnie wykrywania i barwienia silniejszego sygnału (genu o większej ekspresji) za pomocą czerwonego substratu. Jeśli jednak mają być przeprowadzone reakcje dwukolorowe, zaleca się przetestowanie różnych kombinacji etykiet i substratów w celu znalezienia procedury, która jest najbardziej odpowiednia do zbierania i analizy danych. Ponadto czasy przewidziane na blokowanie, inkubację przeciwciał i płukanie podane w sekcjach 4-5 są dostosowane do zarodków młodszych niż 24 godziny po zapłodnieniu; Długie odstępy między tymi samymi krokami ze starszymi zarodkami mogą prowadzić do gromadzenia się soli na próbce. Obszerne wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów ze standardowym zarodkiem danio pręgowanego WISH zostały już udokumentowane w literaturze12-16. Prawdopodobnie najczęstszym dylematem jest wysokie tło. Zalecamy zwiększenie liczby prań MABT w kroku 4.7 do 15-20 prań w razie potrzeby, chociaż z naszego doświadczenia wynika, że dodanie "super-prania" MABT na noc daje znakomite rezultaty, gdy jest używane w połączeniu z 10 lub więcej krótkimi praniami MABT przed przejściem do kroku 4.8. Innym przykładem dylematu jest słaba infiltracja sondy, która może wystąpić w przypadku długich rybosond. Ścinanie rybosondy zgodnie z krokiem 3.6 poprzez hydrolizę alkaliczną może temu przeciwdziałać. Z naszego doświadczenia z młodymi próbkami wynika, że ścinanie sondą zazwyczaj nie jest wymagane. Należy jednak pamiętać, że parametry takie jak ten mogą być czynnikami przyczyniającymi się do wyniku eksperymentu WISH i sugerujemy zapoznanie się z tymi przydatnymi instrukcjami rozwiązywania problemów, które są już publicznie dostępne w społeczności, w razie potrzeby, aby udoskonalić parametry eksperymentalne dla WISH wewłasnych badaniach.

Oprócz tradycyjnych technik WISH12-16, stale pojawiają się postępy w metodologiach WISH i alternatywnych protokołach, które zostały sformułowane. Należą do nich nowe sposoby detekcji sygnałów, takie jak wykorzystanie fluorescencji17-19, po metody umożliwiające lokalizację mikroRNA20. Mimo to, pomimo wielu ulepszeń, które zostały wprowadzone do obecnych metod znakowania komórek, skuteczność tych procedur jest negowana, jeśli barwienia nie mogą być łatwo zobrazowane w próbce zainteresowania w pożądanym punkcie czasowym. To ograniczenie jest problematyczne dla badaczy, zwłaszcza gdy dotyczy wczesnych etapów embrionalnych ontogenezy danio pręgowanego, co może potencjalnie prowadzić do luk w naszym zrozumieniu różnych procesów rozwojowych, które pojawiają się w tym czasie. Podczas normalnego rozwoju danio pręgowanego woreczek żółtkowy będzie się stopniowo zmniejszał w miarę osiągania wieku11 lat. Dlatego w tych późniejszych stadiach rozwoju (>24 godziny po zapłodnieniu) barwienie WISH jest dość proste do analizy, ponieważ zarodek jest większy w porównaniu z przylegającym do niego woreczkiem żółtkowym. Nie dzieje się tak jednak od etapu pąka ogonowego do wczesnej somitogenezy (kiedy masa embrionalna jest umieszczona wokół żółtka), gdzie nieprzezroczysty woreczek żółtkowy może czasami zasłaniać wizualizację plamy. W związku z tym metoda płaskiego montażu została opracowana, aby pomóc złagodzić problemy związane z obrazowaniem i analizą danych związane z charakteryzacją wczesnych próbek zarodków danio pręgowanego (schematyzowane na rysunku 1 i rysunku 2) i jest szeroko stosowana od czasu systematycznego fenotypowania mutacji genetycznych wyizolowanych z pierwszych badań genetycznych na dużą skalę21.

Od czasu pojawienia się techniki montażu płaskiego analiza wczesnych etapów rozwojowych została znacznie ulepszona. Po usunięciu żółtka z zarodka możliwe jest ułożenie zarodka płasko na szkiełku podstawowym w pożądanej orientacji do obrazowania. Ta dwuwymiarowa pozycja umożliwia oglądanie całego zarodka jednocześnie, co eliminuje konieczność obracania próbki. Liczne tkanki znajdują się w szerokich domenach zarodka, takich jak prekursory tworzące krew i nerki. Ponadto może być konieczne porównanie kilku różnych rozwijających się tkanek w tym samym czasie. Płaskie mocowanie umożliwia badaczowi jednoczesne oglądanie całej domeny takich grup komórek, a tym samym może znacznie pomóc w kwantyfikacji, takiej jak pomiar powierzchni tkanki lub liczby komórek. Technika ta ostatecznie pomogła doprowadzić do wielu odkryć dotyczących wielu ważnych mechanizmów rozwojowych leżących u podstaw hematopoezy, neurogenezy i organogenezy. Tak więc, po opanowaniu, zastosowania tej prostej techniki dla badaczy są dość znaczące.

Na przykład w badaniu oceniającym wybór linii podczas hematopoezy, preparaty flat mount zarodków danio pręgowanego w 14 i 18 stadiach somitowych (ss) zastosowano w celu zilustrowania zmian, które zaszły we wzorcu ekspresji czynnika transkrypcyjnego palca cynkowego pu.1 między zarodkami typu dzikiego i zarodkami z wstrzykniętym morfolinem GATA1 22. Metoda ta umożliwiła wykrycie rozszerzonej domeny pu.1 w 18 ss, co wskazuje, że gata1 najprawdopodobniej reguluje ekspresję pu.1 w pośredniej masie komórkowej (ICM) w tym punkcie czasowym. Dodatkowe płasko osadzone zarodki barwione pod kątem różnych genów erytroidalnych, w tym gtpbp1 i epsiny, wykazały utratę ekspresji tych genów w mutantach vlt, które były gata1-/-. Dalsze analizy nie wykazały żadnych zmian w ekspresji genów erytoidowych, takich jak biklf i testhymin, o których wiadomo, że są niezależne od aktywności GATA. W związku z tym, w połączeniu z innymi wynikami eksperymentalnymi, ujawniono, że gata1 jest niezbędny w regulacji różnicowania komórek w linii mielo-erytroidalnej. W badaniu rozwoju grzebienia nerwowego, płaskie mocowania wykorzystano do zbadania ekspresji grzebienia w mutantach Mont Blanc (mobm610) w badaniu badającym role funkcji genu Mont Blanc i tfap2a 23. Po 10 i 20 ss ekspresja grzebienia została całkowicie zniesiona w głowie i zmniejszyła się w obszarze tułowia mutantów mob m610 w porównaniu z normalną ekspresją typu dzikiego, co ostatecznie pomogło tej grupie wyciągnąć wnioski na temat znaczenia regulacji Mont Blanc i TFAP2A podczas tworzenia grzebienia nerwowego. Dodatkowo, jeśli chodzi o organogenezę, płaskie mocowania umożliwiły odkrycie obecności odrębnych domen we wczesnym polu progenitorowym nerki podczas rozwoju zarodka nerki danio pręgowanego, znanej jako przednercze. Zarodek danio pręgowanego zapewnia konserwatywny, a jednocześnie anatomicznie prosty system do badania, w jaki sposób progenitorzy nerek dają początek jednostkom funkcjonalnym nefronów, które składają się na przednercze, proces znany jako nefrogeneza6,7 (ryc. 4). Analiza płaskiego montażu była przydatna do dokumentowania domen komórek progenitorowych nerek i analizowania wyników zmian w sygnalizacji RZS podczas wzorca przednercza6,7 (Figura 5), co było wcześniej nieznane. Podsumowując, przykłady te sugerują, że istnieje wiele szerokich zastosowań tego płaskiego protokołu montażu w badaniu różnych procesów, które zachodzą podczas normalnego rozwoju i stanów chorobowych.

Koncepcyjnie ta procedura montażu płaskiego jest ogólnie dość prosta. Jednak manipulacje i stopień finezji wymagany do opanowania tej metody mogą być dość trudne do opanowania przy braku wizualnej demonstracji. W związku z tym protokół ten został opracowany, aby umożliwić naukowcom, zwłaszcza tym, którzy są nowicjuszami w modelu danio pręgowanego, lepsze zrozumienie, jak wykonać tę technikę i podzielenie się naszymi poradami na temat odczynników, które mogą zoptymalizować postępowanie z tkankami. Mamy nadzieję, że ten protokół ostatecznie pozwoli innym członkom społeczności na udoskonalenie najbardziej idealnych warunków próbkowania, które zostaną wykorzystane do obrazowania premium, analizy danych i komunikowania swoich wyników w publikacjach. Ostatecznie powinno to umożliwić naukowcom pokonanie anatomicznych przeszkód u danio pręgowanego na wczesnym etapie embriogenezy, które mogą zaciemniać prezentację wyników eksperymentalnych, i rozwiązanie ich problemów dzięki zastosowaniu tej prostej, ale znaczącej techniki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze dla RAW z każdego z następujących: NIH przyznaje DK083512 K01, OD008470 DP2 i R01 DK100237; Nagroda grantowa March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar #5-FY12-75; pozyskanie funduszy z University of Notre Dame College of Science i Wydziału Nauk Biologicznych. Chcielibyśmy szczególnie podziękować Elizabeth i Michaelowi Gallagherom, a także całej rodzinie Gallagherów, która przekazała hojny dar na rzecz Uniwersytetu Notre Dame w celu wspierania badań nad komórkami macierzystymi. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych za ich wsparcie oraz Centrum Badań nad Danio Pręgowanym w Notre Dame za ich wyjątkowe poświęcenie w opiece i dobrostanie naszej kolonii danio pręgowanego. Na koniec dziękujemy członkom naszego laboratorium badawczego za ich komentarze, dyskusje i spostrzeżenia na temat tej pracy, a także Marigold (Maripooka) i Zinnia Wingert za dostarczenie naturalnie zrzucanych kocich wąsów, aby stworzyć najdoskonalsze narzędzia do rzęs do naszych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50 X E3250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 w wodzie destylowanej. Uzupełnij błękitem metylenowym (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) w celu zahamowania zanieczyszczeń.
1 X E3Rozcieńczyć 50 X E3 w wodzie destylowanej.
Sitko siatkowe do herbatyEnglish Tea StoreSKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Naczynie do inkubacji zarodkówFalcon35-1005
Pipeta transferowaSamco202, 204
Probówka do mikrowirówek z płaskim dnemVWR87003-300; 87003-298
Fiolka szklanaWheaton225012
1x PBST0,1% detergent Tween-20 w 1x PBS, wytwarzany przez rozcieńczenie 10x PBS w wodzie destylowanej.
Tween-20 stockAmerican BioanalyticalAB02038
10x PBSAmerican BioanalyticalAB11072
ParaformaldehydeElectron Microscopy Services19210
4% PFA/1X PBSRozpuścić 4% PFA (w/v) w 1x PBS, doprowadzić do wrzenia na gorącej płycie w dygestorium. Schłodzić i zamrozić porcje do przechowywania w temperaturze -20 °C. Rozmrozić tuż przed użyciem i nie zamrażać ponownie zapasów.
Jednostka do sterylizacji filtrówCorning430516System filtracyjny 1 L, 0,45 μ m
CA MeOHSigma34860-4L
Proteinaza KRoche03-115-879-001Rozpuścić w wodzie destylowanej, aby uzyskać zapas proteinazy K (10 mg / ml) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 & stopni C.
HYB+50% formamid, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/ml RNA toruli drożdżowej, 50 μ g/μ l
Rybosonda znakowana heparyną DIG/FLU in vitro odczynniki reakcji transkrypcyjnejRoche11175025910; 11685619910Zapoznaj się z instrukcjami producenta.
Polimeraza RNA SP6 PolimerazaRoche11487671001
Polimeraza RNA T7 Polimeraza10881775001
Polimeraza RNA T3Inhibitor Roche11031171001
RNazy 1Inhibitor3335399001
DNazy 1, 10x bufor DNazy 1Roche4716728001
GlycogenRoche10901393001
Etanol (EtOH)SigmaE7023Podwielokrotność 50 ml podwielokrotności 100% EtOH i 70% EtOH (rozcieńczone wodą o czystości cząsteczkowej) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Woda destylowana klasy molekularnejMediatech25-055-CM
WaterbathThermo51221073Model 2831
NanodropThermoND-2000c
FormamidAmerykański AB00600 bioanalitycznyPrzechowywać w temperaturze -20 stopni C.
20x SSCAmerican BioanalyticalAB13156
MAB2 L formuła: W 1,5 l wody destylowanej wymieszaj 23,2 g kwasu maleinowego, 17,5 g NaCl, 55,0 g zasady Trisma, następnie dodaj 8 ml 1M Tris-HCl pH 9,5, a następnie napełnij do 2 L. Autoklaw.
MABTMAB + 0,1% (v/v) Tween-20
RoztwórRobimy w 50 ml świeże porcje: 10 ml BSA (z 10% bulionu laboratoryjnego), 5 ml FCS (z bulionu) i 35 ml MABT. Zapisz nieużywany blok na 4 & stopni; C do stosowania jako roztwór przeciwciał. Uwaga: Rozmrozić zapasy BSA i FCS na poziomie 37 & deg; C– Jeśli rozmrozisz je w wyższej temperaturze, staną się gęstym żelem (nie używaj).
FCS (płodowa surowica cielęca)Invitrogen16140089porcji Aliquot w porcjach po 5 lub 10 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
AmerykańskiAB00448BioanalitycznyPrzygotować 10% bulion rozcieńczony w MAB przez rozpuszczenie płatków BSA w temperaturze pokojowej z szybkim mieszaniem, a następnie przechowywać 10 ml podwielokrotności w temperaturze -20 stopni C. Nierozpuszczone płatki BSA przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Przeciwciało anty-digoksygeninoweRoche11-093-274-910Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Przeciwciało antyfluoresceinoweRoche11-426-338-910Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
12-dołkowe naczynie barwiąceBD-Falcon35-3225
do wstępnego barwienia100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20. Zawsze rób świeże: wytrąci się w ciągu kilku dni.
Roztwór barwiący-fioletowyNa każde potrzebne 10 ml: dodać 45 μ l z NBT i 35 μ BCIP do świeżego buforu do wstępnego barwienia (niestosowanego w próbkach zarodków).
Roztwór barwiący - czerwonyNa każde potrzebne 10 ml: dodać 31,5 μ l z INT i 35 μ BCIP do świeżego buforu do wstępnego barwienia (niestosowanego w próbkach zarodków).
Zapas NBTSigmaN6876Przechowywany w temperaturze -20 ° C; proszek rozcieńczony 50 mg/ml w 70% DMF, 30% wodzie.
INT zapasSigmaI8377Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C; proszek rozcieńczony 55 mg/ml w 70% DMF, 35% wodzie.
Kolba BCIPSigmaB8503Przechowywana w temperaturze -20 & deg; C; proszek rozcieńczony 50 mg/ml w 100% DMF.
DMF (dimetyloformaldehyd)AB00450Bioanalityczny
GlicynaSigmaG88980,1 M glicyna, pH 2,2
Mała plastikowa szalka PetriegoCorning430589, 430588
GlicerolSigmaG7893
Drobne kleszczeRobozRS-1050Dumont Pęseta Wzór #55
NarzędzieZbudowany poprzez przymocowanie odpowiedniej rzęsy do końcówki pipety (można użyć rozmiarów od P10 do P1000) za pomocą kleju superglue. Używamy naturalnie wypadającej ludzkiej rzęsy, naturalnie zrzucanych zwierzęcych wąsów lub żylastych włosów futrzanych lub rzęs naturalnych lub syntetycznych zakupionych w dziale kosmetycznym w sklepie farmaceutycznym lub detalicznym (bardzo długie rzęsy są najbardziej podatne na stabilne osadzenie na końcówce pipety). Końcówka pipety jest przymocowana do prostego pręta (o długości 8-10 cm), takiego jak uchwyt na igłę (np. , Fisher 08-965-A) w celu łatwej obsługi. Zobacz Rysunek 3 aby zobaczyć zdjęcia tych domowych narzędzi.
Szkiełko szklaneThermo-Fisher4445White Frost
Szkiełko nakrywkoweThermo-Fisher12-540A18 x 18 mm
ModelinaHasbroPlaydohMożna zastąpić inne produkty z plasteliny rzemieślniczej.
Uchwyt na prowadniceThermo-Fisher12-587-10Taca kartonowa do przechowywania szkiełek na płasko.
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ645, SMZ1000
Mikroskop złożonyNikon80i, 90i
Roche Roche blokowy Bufor Amerykański do rzęs

Bibliografia

  1. Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
  2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  4. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  5. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  6. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
  7. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  9. Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
  10. Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  11. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
  13. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
  14. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
  15. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
  16. Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
  17. Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
  18. Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
  19. Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
  20. Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
  21. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  22. Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
  23. Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Usuwanie żółtkasekcja embrionumontowanie w glicerolustereomikroskopiadwukolorowa hybrydyzacja in situ (WISH)progenitorzy nerkowePAX2A
Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.