Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Podsumowanie

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Streszczenie

Zarodek danio pręgowanego jest teraz powszechnie używany do badań podstawowych i biomedycznych w celu zbadania genetycznej kontroli procesów rozwojowych i modelowania wad wrodzonych. W ciągu pierwszego dnia życia zarodek danio pręgowanego przechodzi przez wiele etapów rozwoju, w tym zapłodnienie, rozszczepienie, gastrulację, segmentację i organogenezę struktur takich jak nerki, serce i ośrodkowy układ nerwowy. Anatomia młodego zarodka danio pręgowanego stanowi kilka wyzwań dla wizualizacji i analizy tkanek zaangażowanych w wiele z tych zdarzeń, ponieważ zarodek rozwija się w połączeniu z okrągłą masą żółtka. Tak więc, w celu dokładnej analizy i obrazowania eksperymentalnych fenotypów w utrwalonych próbkach embrionalnych między zawiązkiem ogonowym a etapem 20 somitów (odpowiednio 10 i 19 godzin po zapłodnieniu (hpf), takich jak te barwione przy użyciu hybrydyzacji in situ (WISH), często pożądane jest usunięcie zarodka z kulki żółtkowej i umieszczenie go płasko na szkiełku podstawowym. Jednak wykonanie procedury montażu płaskiego może być żmudne. W związku z tym skuteczne i wydajne przygotowanie do montażu płaskiego jest znacznie ułatwione dzięki wizualnej demonstracji techniki preparacji, a także dzięki zastosowaniu odczynników, które pomagają w optymalnym obchodzeniu się z tkankami. W tym miejscu przedstawiamy nasz protokół WISH do jedno- lub dwukolorowego wykrywania ekspresji genów w zarodku danio pręgowanego i pokazujemy, w jaki sposób można przeprowadzić procedurę płaskiego montażu na tym przykładzie barwionej utrwalonej próbki. Ten płaski protokół montażu ma szerokie zastosowanie w badaniu wielu struktur embrionalnych, które pojawiają się podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego i może być stosowany w połączeniu z innymi metodami barwienia wykonywanymi na utrwalonych próbkach zarodków.

Wprowadzenie

Danio rerio ryba pręgowany, stał się powszechnie używanym organizmem w badaniach nad biologią rozwojową. Danio pręgowany to tropikalny, słodkowodny gatunek kręgowców należący do rodziny karpiowatych (Cyprinidae). Danio pręgowany był pierwotnie wykorzystywany do badań środowiskowych w celu uzyskania informacji na temat zagrożeń związanych z potencjalnymi zanieczyszczeniami wody, ponieważ był łatwo dostępny, niedrogi i łatwy w utrzymaniu¹. W ciągu ostatnich trzydziestu lat danio pręgowany stał się uznawany za genetycznie podatny system modelowy kręgowców z wielu powodów. Danio pręgowany wykazuje wysoki poziom ochrony anatomicznej i fizjologicznej z wyższymi kręgowcami, w tym ssakami^2,3. Niedawna adnotacja sekwencji genomu ujawniła, że około 70% ludzkich genów ma co najmniej jeden odpowiednik danio pręgowanego⁴. Na przykład wiele genów ortologicznych, które odgrywają ważną rolę podczas rozwoju nerek, zostało zidentyfikowanych między tymi gatunkami^5-7. Ten ogromny stopień ochrony w odniesieniu do biologii komórkowej i molekularnej umożliwił naukowcom stworzenie modeli dla szerokiego zakresu chorób człowieka u danio pręgowanego⁸, a danio pręgowany stał się cennym narzędziem do identyfikacji potencjalnych terapii lekowych przy użyciu chemicznych badań genetycznych⁹.

Ponadto, model danio pręgowanego nie tylko jest w stanie podsumować różnorodne złożone procesy rozwojowe i stany chorobowe, które są obserwowane u ludzi, ale kilka dodatkowych atrybutów również zwiększa jego atrakcyjność jako organizmu modelowego do badań embriologicznych. Danio pręgowany jest jajorodny i rozmnaża się poprzez tarło rozsiewane, co zapewnia naukowcom łatwy dostęp do zarodków od początku zapłodnienia¹⁰. Inne zalety to wielkość zarodka, przezroczystość i szybki, zewnętrzny rozwój¹⁰. Ponadto dorosłe rybki danio pręgowanego mają wysoką płodność i zazwyczaj wytwarzają stosunkowo duże rozmiary lęgów, które mogą wynosić od 200 do 500 tygodniowo, co ostatecznie umożliwia naukowcom łatwe przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, takich jak badania chemiczne oparte na fenotypie⁹.

Mimo to, pomimo mnóstwa zalet, które wykazuje model danio pręgowanego, istnieją wyzwania związane z analizą i komunikacją wyników eksperymentalnych uzyskanych z wczesnych etapów rozwoju. W niektórych przypadkach wrodzona anatomia zarodka danio pręgowanego może przesłonić wizualizację danych. Po zapłodnieniu początkowa komórka ulega wielu zdarzeniom rozszczepienia w miarę postępu rozwoju¹¹. Po gastrulacji oś embrionalna wyłania się na etapie pąka ogonowego (10 hpf) tak, że jest owinięta wokół żółtka¹¹. W miarę dalszego rozwoju w okresie segmentacji, pień będzie rósł w masę, a także wydłużał się przez wydłużenie osiowe, tak że ogon wraz z częścią samego woreczka żółtkowego wystaje z centralnej masy żółtka¹¹. Pomiędzy stadium pączka ogonowego a stadium 20 somitów (19 hpf), próby zaobserwowania określonych cech rozwojowych po zastosowaniu różnych protokołów barwienia, takich jak WISH, mogą być trudne zarówno do wizualizacji, jak i sfotografowania ze względu na geometrię zarodka i zmętnienie woreczka żółtkowego. Jednym ze sposobów na wyeliminowanie tych wyzwań jest usunięcie żółtka, a następnie spłaszczenie zarodka do dwuwymiarowej próbki, którą można analizować w prostszy sposób.

Poniższy protokół i zasoby wideo dostarczają przewodnika, jak skutecznie usunąć żółtko i płasko zaszczepić zarodek po utrwaleniu i barwieniu, korzystając z przykładu jedno- lub dwukolorowego barwienia WISH. WISH jest szeroko stosowaną techniką, która umożliwia wykrywanie określonych kwasów nukleinowych w zachowanych próbkach, a tym samym pozwala na wykrycie miejsca (miejsc) ekspresji genów w tkankach. Techniki WISH zostały obszernie opisane i mogą być wykonywane z różnymi kolorowymi podłożami, a także z fluorescencyjnymi systemami detekcji^12-20. W tym miejscu przedstawiamy nasz zmodyfikowany protokół WISH stosowany w przypadku zarodków danio pręgowanego między etapem rozwoju zawiązka ogonowego a segmentacją. Alternatywne protokoły WISH są jednak kompatybilne z opisaną tutaj procedurą montażu płaskiego, jak wspomniano na początku poniższego protokołu. Ponadto, montaż płaski może być wykorzystany w połączeniu z dowolną liczbą istniejących technik wizualizacji, takich jak immunohistochemia całej góry lub etykiety śledzenia linii komórkowych, które nie są opisane w tym protokole. Ogólnie rzecz biorąc, technika płaskiego montażu może lepiej umożliwić lepszą analizę i prezentację danych uzyskanych z eksperymentów z najwcześniejszymi etapami rozwoju embrionalnego u danio pręgowanego.

Protokół

Procedury pracy z embrionami danio pręgowanego opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame. Uwaga: Procedury opisane w częściach 1-5 zostały wykorzystane do wygenerowania obrazów zarodków przedstawionych tutaj w reprezentatywnych wynikach. Procedury opisane w częściach 1-5 można zastąpić w razie potrzeby alternatywnymi procedurami WISH^12-16 lub innymi technikami wizualizacji, takimi jak znakowanie immunohistochemiczne określonych białek przy użyciu określonych przeciwciał. Podczas wykonywania płaskich mocowań na zarodkach danio pręgowanego WISH zgodnie z protokołem opisanym w częściach 1-5, początkowe utrwalanie zarodka i końcowe etapy barwienia są głównymi manipulacjami, które wpływają na zdolność do usuwania granulek żółtka z próbki w celu montażu płaskiego. Najlepsze wyniki montażu płaskiego uzyskuje się, gdy początkowe utrwalenie wykonuje się za pomocą świeżo rozmrożonego, lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA)/1x PBS, a utrwalenie końcowej reakcji barwienia WISH za pomocą lodowatego 4% PFA/1x PBS (który nie musi być świeżo rozmrożony), i zaleca się, aby czytelnicy wzięli to pod uwagę przy zastępowaniu alternatywnych metod barwienia w połączeniu z częściami 6-8.

1. Pobieranie, utrwalanie i przechowywanie zarodków

1. Przygotować klatki godowe, umieszczając dorosłe samce i samice danio pręgowanego w komorach z wodą systemową, tak aby były oddzielone przegrodą na noc.
2. Usuń przegrody między dorosłymi osobnikami i zbierz zapłodnione jaja za pomocą sitka do herbaty z drobnej siatki drucianej w ciągu ~ 15-30 minut od krycia, aby zebrać lęgi, które mają równoważne stadia embrionalne.
3. Odwróć sitko do góry nogami i spłucz powierzchnię drobnym strumieniem E3 dozowanym z butelki ze spryskiwaczem, aby przenieść zarodki do naczyń inkubacyjnych zawierających około 25 ml roztworu E3.
4. Po zebraniu lęgów podziel je na kilka szalek tak, aby około 50-60 zarodków inkubowało się w każdym naczyniu zawierającym 25 ml roztworu E3. Uwaga: Przepełnienie zarodków może prowadzić do dramatycznej asynchroniczności rozwojowej w obrębie lęgu i należy zachować ostrożność, aby tego uniknąć, aby umożliwić terminowe pobranie pożądanego stadium (stadiów).
5. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C, aby umożliwić ocenę rozwoju zgodnie ze standardową serią oceny stopnia zaawansowania danio pręgowanego¹¹.
6. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby delikatnie umieścić żądaną liczbę zarodków w wybranym punkcie czasowym, do etapu 20 somitów (19 hpf), w probówce do mikrowirówki z płaskim dnem. Uwaga: Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z młodymi zarodkami, ponieważ są one delikatne i mogą zostać łatwo uszkodzone przez zgniatanie lub agresywne obchodzenie się z pipetami transferowymi. Alternatywnie, szklane fiolki mogą być używane do utrwalania i przetwarzania zarodków. Do wszystkich kolejnych myć protokołem można stosować plastikowe pipety transferowe, z wyjątkiem dodawania i usuwania rybosondy (kroki 3.11, 3.14).
7. Zastąp E3 lodowatym 4% PFA/1x PBS i utrwal zarodki w ich kosmówkach w 4% PFA/1x PBS przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub w 4 °C przez noc. Uwaga ostrzegawcza: PFA jest toksyczny, a roztwory PFA należy obchodzić się z kapturem chemicznym, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i fartuch laboratoryjny. Ponadto z proszkiem PFA należy obchodzić się z wyjątkową ostrożnością podczas przygotowywania roztworu podstawowego, ponieważ nawet granulowany PFA może mieć tendencję do rozpraszania się przez ładunek statyczny. Zazwyczaj PFA przygotowuje się przez podgrzanie 1x PBS do wrzenia w celu rozpuszczenia proszku PFA, a następnie roztwór jest przechowywany w porcjach w temperaturze -20 °C. Jeśli po schłodzeniu roztworu w 4% PFA/1x PBS znajdują się drobne osady, przefiltruj schłodzony roztwór przed podaniem do zamrożenia, przepuszczając go przez system filtrów 0,45 μm. Tylko świeżo przygotowany lub świeżo rozmrożony PFA jest używany do tego początkowego (tj. pierwotnego) utrwalenia zarodka.
8. Usuń poprawkę i umyj zarodki dwukrotnie 1x PBST, a następnie przenieś do naczynia inkubacyjnego.
9. Obejrzyj zarodki pod mikroskopem stereoskopowym i użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby usunąć kosmówkę otaczającą zarodki, tak aby jedna para była używana do delikatnego dźwigania zarodka, podczas gdy druga para była używana do rozerwania kosmówki.

2. Permeablacja zarodków

1. Przenieś zdekorionowane zarodki z powrotem do probówki mikrowirówkowej lub szklanej fiolki, a następnie przepłucz dwukrotnie 1x PBST, aby usunąć wszelkie pozostałe resztki kosmówki.
2. Usuń 1x PBST i umyj zarodki dwukrotnie 100% metanolem (MeOH).
3. Umieścić zarodki w temperaturze -20 °C przez co najmniej 20 minut. Uwaga: Zarodki można przechowywać w temperaturze -20 °C w MeOH przez rok lub dłużej. Metanol sprawia, że kosmówka jest lepka, dlatego nie należy przechodzić do tego etapu, dopóki kosmówka nie została usunięta.
4. Nawodnij zarodki, usuwając 100% MeOH i myj je w temperaturze pokojowej przez 5 minut każdy w 50% MeOH / 1x PBST, 30% MeOH / 1x PBST, a następnie dwukrotnie 1x PBST.
5. Przygotować świeży roztwór roboczy proteinazy K (5 μg/ml), dodając 25 μl świeżo rozmrożonej proteinazy K (10 mg/ml) do 50 ml 1x PBST.
6. Usuń 1x PBST z zarodków, a następnie zastąp roztworem roboczym proteinazy K i inkubuj w oparciu o stadium embrionalne: < = 5 somitów przez 1 min; 10-12 somitów przez 1,5 min; 15 somitów przez 2 min i 20 somitów przez 3 min.
7. Usuń roztwór roboczy proteinazy K i umyj zarodki dwukrotnie 1x PBST.
8. Usuń 1x PBST i zastąp lodowatym 4% PFA/1x PBS na co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.

3. Synteza rybosondy, prehybrydyzacja, hybrydyzacja i usuwanie sondy

1. Zmontować antysensowną rybosondę w reakcji transkrypcji in vitro w temperaturze pokojowej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, utrzymując enzymy na lodzie, łącząc matrycę DNA zawierającą sekwencję odpowiadającą interesującemu genowi (albo 100-200 ng produktu PCR, albo 1,5 μg linearyzowanego plazmidu DNA, przygotowanego zgodnie z opisem^12,13), 2 μl rybonukleotydów znakowanych digoksygeniną lub fluoresceiną, 2 μl odpowiedniej polimerazy RNA (SP6, T3, T7 w zależności od tego, która sekwencja jest włączona do produktu PCR lub obecna na plazmidzie DNA), 2 μl 10x buforu transkrypcyjnego, 0,5 μl inhibitora RNazy i doprowadzić do całkowitej objętości 20 ul wodą destylowaną o czystości cząsteczkowej (DNaza, Nie zawiera RNazy). Uwaga: 10-krotny bufor transkrypcyjny należy wstępnie podgrzać, umieszczając probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10-20 minut, a następnie przemieszać, aby upewnić się, że wszystkie składniki są w roztworze. Jeśli obecne są białe płatki, inkubuj probówkę przez kolejne 5-10 minut i ponownie wiruj. Reakcje transkrypcyjne mogą zakończyć się niepowodzeniem lub mieć niską wydajność, jeśli bufor transkrypcyjny nie zostanie całkowicie rozpuszczony i dokładnie wymieszany.
2. Wymieszać składniki i inkubować każdą reakcję w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w łaźni wodnej.
3. Wyjąć probówkę (probówki) reakcyjną z łaźni wodnej i zniszczyć matrycę DNA w każdej próbce, dodając 5 μl 10x buforu DNazy I, 2 μl enzymu DNazy I i 23 μl wody destylowanej o czystości cząsteczkowej, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 μl, a następnie inkubować każdą probówkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut w łaźni wodnej.
4. Przeprowadzić wytrącanie etanolu w każdej probówce mikrowirówki, dodając 5 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 110 μl lodowatego 100% etanolu, a następnie 1 μl glikogenu, aby ułatwić wizualizację osadu RNA w kolejnych krokach, a następnie inkubować probówkę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
5. Odwirować każdą probówkę do mikrowirówki z maksymalną prędkością 4 °C przez 20 minut, następnie usunąć 100% supernatant etanolu i zastąpić 100 μl 70% lodowatego etanolu.
6. Odwirować każdą probówkę do mikrowirówek w temperaturze 4 °C przez 5 minut, następnie usunąć 70% supernatant etanolu i wysuszyć granulkę na powietrzu przez 5 minut, a następnie dodać 100 μl wody destylowanej o czystości cząsteczkowej w celu ponownego zawieszenia osadu i ilościowego określenia stężenia rybosondy za pomocą spektrofotometru nanokroplowego. Uwaga: Gdy osad znajdzie się w roztworze, wywar rybosondy powinien być przechowywany na lodzie i przechowywany w temperaturze -20 °C.
7. Aby przygotować utrwalone zarodki do procesu prehybrydyzacji, należy usunąć 4% PFA/1x PBS z każdej próbki i umyć zarodki dwukrotnie 1x PBST.
8. Przenieś od 25 do 40 zarodków w 1x PBST do każdej pojedynczej probówki do mikrowirówki z płaskim dnem. Uwaga: Przepełnienie zarodków doprowadzi do nierównomiernego barwienia w późniejszym czasie i należy zachować ostrożność, aby ograniczyć wielkość próbki w każdej probówce do około 40 zarodków.
9. Zastąp 1x PBST w każdej probówce na 500-1,000 μl HYB+.
10. Umieścić probówkę (probówki) z zarodkami w piecu ustawionym na 70 °C i inkubować je w tej temperaturze przez 4 godziny w celu przeprowadzenia prehybrydyzacji.
11. Przygotować roztwór rybosondy/HYB+, dodając 100-500 ng rybosondy (digoksygeniny i/lub znakowanej fluoresceiną) do 500 μl świeżego HYB+, a następnie inkubować ten roztwór w temperaturze 70 °C przez co najmniej 20 minut przed krokiem 3.11 w celu jego wstępnego ogrzania. Uwaga: Aby wykryć wiele transkryptów genów, przy użyciu pojedynczego i/lub podwójnego znakowania kolorymetrycznego, każda z rybosond odpowiadających tym genom musi zostać połączona w jeden koktajl rybosondy/HYB+.
12. Usuń prehybrydyzację HYB+ z każdej probówki zarodków i zastąp ją wystarczającą ilością rybosondy/HYB+, aby pokryć zarodki. Uwaga: Zazwyczaj potrzeba 200-250 μl rybosondy/HYB+, aby pokryć zarodki w jednej probówce do mikrowirówki z płaskim dnem. Dodawanie i usuwanie rybosondy/HYB+ jest zwykle wykonywane za pomocą pipety i końcówek barierowych, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między próbkami.
13. Inkubować zarodki w temperaturze 70 °C przez noc za pomocą sondy rybrosondowej/HYB+.
14. Przygotuj następujący zestaw roztworów myjących i podgrzej je przez noc w temperaturze 70 °C: 50% formamidu/2x SSCT, 2x SSCT i 0,2x SSCT. Uwaga: Wygodnie jest przygotować 50 ml porcji każdego roztworu do mycia, ponieważ nadmiar można przechowywać w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie podgrzać do wykorzystania w przyszłości.
15. Usunąć rybosondę/HYB+ za pomocą pipety i końcówek barierowych i przechowywać w temperaturze -20 °C. Uwaga: Zazwyczaj każda mieszanina rybosondy/HYB+ może być użyta kilka razy (np. 3 lub więcej) bez osłabiania sygnału. Chociaż ponownie wykorzystana rybosonda/HYB+ wiąże się z niższym tłem, należy jednak pamiętać, że ponownie wykorzystane mieszaniny rybosondy mogą ulegać degradacji.
16. Umyć zarodki dwukrotnie 50% formamidem/2x SSCT przez 30 minut w temperaturze 70 °C.
17. Płukać zarodki raz za pomocą 2x SSCT przez 15 minut w temperaturze 70 °C.
18. Płukać zarodki dwukrotnie 0,2x SSCT przez 30 minut w temperaturze 70 °C.
19. Usunąć 0,2x SSCT i dwukrotnie przemyć zarodki MABT w temperaturze pokojowej.

4. Inkubacja i wykrywanie przeciwciał anty-digoksygenowych

1. Przygotuj świeży roztwór blokowy.
2. Usuń MABT i zastąp go roztworem blokowym.
3. Inkubować zarodki w roztworze blokowym przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej. Uwaga: Dłuższe inkubacje blokowe zapewniają optymalne wyniki w stadiach zarodków młodego danio pręgowanego (<15 somitów). Aby przeprowadzić długotrwałą procedurę blokową, należy przeprowadzić inkubację blokową przez 8-12 godzin w temperaturze pokojowej lub kombinację temperatury pokojowej plus (do ~8 godzin) późniejszą inkubację w temperaturze 4 °C przez noc.
4. Przygotować roztwór przeciwciała anty-digoksygeninowego, wykonując 5000-krotne rozcieńczenie w świeżym roztworze blokowym (np. 1 μl na 5 ml bloku).
5. Usunąć blok i dodać roztwór przeciwciała/bloku.
6. Przykryć próbkę folią i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
7. Usunąć blok anty-digoksygeniny i umyć zarodki co najmniej 10 razy za pomocą MABT. Uwaga: Przenieś zarodki do 12-dołkowych naczyń w celu przepłukania MABT. Zwiększa to szybkość, z jaką zarodki mogą być myte, co jest przydatne przy przetwarzaniu dużych ilości próbek i ułatwia monitorowanie postępu reakcji barwienia (krok 4.11) pod mikroskopem stereoskopowym. Uwaga: Na tym etapie zarodki można "przemyć" poprzez inkubację przez noc w MABT w temperaturze 4 °C przed przejściem do etapu 4.8, co jest użytecznym sposobem leczenia w przypadku sond, które mają tendencję do dawania wysokiego tła lub plam, które wymagają długiego monitorowania w ciągu dnia pracy.
8. Przygotuj bufor do wstępnego barwienia i żądany roztwór barwiący (fioletowe lub czerwone podłoże).
9. Usunąć MABT i umyć zarodki w buforze do wstępnego barwienia przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Usuń bufor do wstępnego barwienia i dodaj roztwór barwiący.
11. Monitoruj postęp reakcji barwienia w temperaturze pokojowej co 15-30 minut, sprawdzając wygląd zarodków pod mikroskopem stereoskopowym. Uwaga: Szybkość reakcji barwienia można spowolnić, przenosząc próbki do temperatury 4 °C, jeśli konieczne jest zapewnienie więcej czasu na zakończenie barwienia. Jednak po schłodzeniu do 4 °C reakcji nie można przyspieszyć przez podgrzanie do temperatury pokojowej.
12. Po zakończeniu reakcji barwienia usuń roztwór barwiący i zastąp go 1x PBST.
13. Przemyć dwukrotnie 1x PBST przez 5 minut. Uwaga: Jeśli nie wykryjesz innych genów z innym substratem, utrwal próbki w lodowatym roztworze 4% PFA/1x PBS przez co najmniej 20 minut i przejdź do kroku 6.1. W przeciwnym razie przejdź do kroku 5.1.

5. Inkubacja i wykrywanie przeciwciał antyfluoresceinowych

1. Usuń 1x PBST i umyj zarodki dwukrotnie 0,1 M glicyną o pH 2,2 przez 15 minut każdy w temperaturze pokojowej. Uwaga: Czas płukania glicyną jest niezbędny do całkowitego dezaktywacji pierwszej reakcji barwienia.
2. Usunąć 0,1 M glicyny i dwukrotnie przemyć zarodki MABT przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Przygotować roztwór przeciwciała antyfluoresceinowego, rozcieńczając go 5 000 razy w świeżym roztworze blokowym (np. 1 μl na 5 ml bloku).
4. Usunąć MABT i dodać roztwór przeciwciała/bloku. Wykonaj kroki 4.6-4.13, aby przeprowadzić detekcję rybosondy znakowanej fluoresceiną. Uwaga: Po zakończeniu końcowej reakcji barwienia ważne jest, aby ostatnie utrwalenie próbki zostało wykonane w lodowatym 4% PFA/1X PBS. Utrwalanie cieplejszymi roztworami PFA zwykle wiąże się z lepkim żółtkiem, które jest trudne do usunięcia z zarodka podczas sekcji i odżółkowywania w przypadku procedury płaskiego mocowania.

6. Sekcja zarodka i wstępne odżółkowanie zarodka

1. Wybierz stały, wybarwiony zarodek do montażu płaskiego.
2. Za pomocą pipety transferowej umieść wybraną próbkę zarodka na plastikowej lub szklanej szalce Petriego zawierającej 1x PBST.
3. Umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym i zwiń zarodek za pomocą cienkich kleszczy lub narzędzia do rzęs, aby uzyskać widok boczny i uwidocznić końce głowy i ogona.
4. Użyj jednej pary cienkich kleszczy, aby wykonać nacięcie w żółtku w miejscu znajdującym się centralnie między głową a ogonem zarodka, a w międzyczasie użyj drugiej pary cienkich kleszczy do przytrzymania zarodka, aby zapewnić dźwignię do nacięcia żółtka. Uwaga: Alternatywnie wykonaj dwa duże nacięcia w żółtku, jedno blisko głowy, a drugie blisko ogona zarodka.
5. Użyj cienkich kleszczyków i/lub narzędzia do rzęs, aby zgarnąć żółtko z jamy żółtka.
6. Delikatnie opłucz zarodek 1x PBST, aby usunąć zabłąkane żółtko.

7. Drobne żółtkowanie zarodka

1. Przenieś zarodek na płaskie szkiełko z 1-2 kroplami 1x PBST.
2. Użyj narzędzia do rzęs i cienkich kleszczyków, aby delikatnie ustawić zarodek brzuszną stroną (żółtkiem) skierowaną do góry na szklanym szkiełku.
3. Przeciągnij zarodek do krawędzi roztworu 1x PBST za pomocą narzędzia do rzęs, tak aby zarodek pozostał w płaskiej pozycji na szkiełku
podstawowym.
4. Delikatnie zeskrobać brzuszną powierzchnię zarodka za pomocą narzędzia do rzęs, aby usunąć granulki żółtka bez rozrywania zarodka. Jednocześnie użyj pary cienkich kleszczy, aby zakotwiczyć zarodek podczas skrobania narzędziem do rzęs. Uwaga: Usunięcie granulek żółtka może wymagać wielokrotnego skrobania przez 5-10 minut.
5. Jeśli roztwór PBST zostanie zaśmiecony nadmiarem żółtka lub zacznie parować, dodaj 1-2 świeże krople 1x PBST do szkiełka za pomocą plastikowej lub szklanej pipety transferowej, a następnie przeciągnij zarodek do obszaru z czystym roztworem w celu dalszego usuwania granulek żółtka.
6. Gdy żółtko zostanie usunięte w zadowalający sposób, należy użyć pipety do przenoszenia, aby delikatnie przenieść zarodek z powrotem do plastikowej lub szklanej szalki Petriego zawierającej 1x PBST w celu ostatecznego płukania w celu usunięcia zabłąkanych granulek żółtka.
7. Przenieść ożółkowany zarodek za pomocą plastikowej lub szklanej pipety transferowej na plastikową lub szklaną szalkę Petriego zawierającą 100% glicerolu.
8. Inkubuj zarodek w 100% glicerolu przez ~5 minut, aby zaaklimatyzować zarodek.

8. Montaż na szkiełku

1. Przenieś odżółkowany zarodek na czyste szklane szkiełko w 1-2 kroplach 100% glicerolu.
2. Umieść zarodek brzuszną stroną (żółtkową) skierowaną w stronę szkiełka stałego.
3. Za pomocą narzędzia do rzęs przeciągnij zarodek do krawędzi kropli glicerolu tak, aby zarodek pozostał w płaskiej pozycji na szkiełku podstawowym. Jeśli oś zarodka jest zakrzywiona, użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie wykonać bardzo małe nacięcia w pozostałej błonie komórkowej żółtka, aby zmniejszyć napięcie, tak aby zarodek można było ułożyć płasko na szkiełku z prostą osią.
4. Umieść małe wgłębienia z plasteliny na czterech rogach szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm. Uwaga: Alternatywnie małe krople smaru próżniowego¹⁵ można zastąpić plasteliną.
5. Powoli umieszczać szkiełko nakrywkowe na zarodku, ustawiając szkiełko nakrywkowe pod kątem, aby zminimalizować wytwarzanie się pęcherzyków powietrza w glicerolu wokół próbki.
6. Dodaj dodatkową kroplę 100% glicerolu z boku szklanego szkiełka nakrywkowego, aby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym.
7. Powoli i ostrożnie dociśnij cztery rogi szkiełka nakrywkowego, aby mocno ustawić zarodek między szkłem i wyeliminować dryfowanie. Uwaga: Uważaj, aby nie zmiażdżyć zarodka.
8. Jeśli zarodek nie jest umieszczony zgodnie z oczekiwaniami, użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć szkiełko nakrywkowe. Użyj narzędzia do rzęs, aby zmienić położenie zarodka i/lub cienkich kleszczy, aby wykonać dodatkowe nacięcia, aby można było zmienić położenie zarodka. Powtórz kroki 8.4-8.7.
9. Obserwuj i/lub zobrazuj próbkę za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub złożonego.
10. Preparat do montażu płaskiego należy przechowywać płasko z tekturowym uchwytem na szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni lub tymczasowo w temperaturze pokojowej. Uwaga: Plama WISH będzie z czasem stopniowo blaknąć, szczególnie w reakcjach z czerwonym substratem, i nie może być konserwowana w glicerolu w nieskończoność. Fioletowe plamy również łatwiej blakną, jeśli są przechowywane w glicerolu w porównaniu z PFA (patrz krok 8.11). Co ciekawe, opublikowano, że umieszczanie zarodków w permount, a nie w glicerolu, może umożliwić przechowywanie w nieskończoność w temperaturze pokojowej¹⁵.
11. W celu długotrwałego przechowywania próbek barwionych na purpurowym podłożu, usuń szklane szkiełko nakrywkowe i opłucz zarodek dwukrotnie przepłukany w 1x PBST, a następnie przenieś do probówki mikrowirówkowej z 4% PFA/1x PBS w celu długotrwałego przechowywania. Uwaga: Alternatywnie, zarodki w 1x PBST mogą być przetwarzane do dodatkowych analiz, takich jak izolacja DNA w celu genotypowania.

Wyniki

Procedura płaskiego montażu polega na przekształceniu zarodka danio pręgowanego z jego normalnej anatomii, w której oś ciała jest owinięta wokół centralnie umieszczonej kulki żółtka, w dwuwymiarową preparację (Rysunek 1A). Obrazowanie całego zarodka młodego danio pręgowanego jest ograniczone przez charakter sposobu, w jaki oś zarodka jest owinięta wokół żółtka. W rezultacie, boczne lub grzbietowe widoki całych barwionych zarodków mogą uchwycić tylko część osi lub zasłaniać poszczególne tkanki (ryc. 1B). Dla porównania, odżółkowanie i spłaszczenie zarodka umożliwia uwidocznienie całej osi embrionalnej w tym samym czasie (ryc. 1B). Ograniczenia te wykazano, badając zarodek barwiony WISH, który został oznaczony rybosondami antysensownymi w celu wykrycia irx3b (fioletowy), który oznacza podzbiór progenitorów nerkowych znajdujących się w sąsiedztwie somitów od 7 do 13, oraz myod1 (czerwony), który oznacza somity (Figura 1B). Pole progenitorów nerkowych irx3b+ jest zasłonięte w całym widoku bocznym wierzchowca, ponieważ transkrypty irx3b są obfite w ośrodkowym układzie nerwowym, co sprawia, że pole nerkowe jest praktycznie niemożliwe do wizualizacji pod bocznym kątem kamery; ponadto pole progenitorów nerkowych irx3b + jest tylko częściowo widoczne, gdy zarodek jest obracany do widoku kamery grzbietowej, ponieważ pole jest owinięte wokół żółtka (ryc. 1B). Jednak widok grzbietowy tego samego zarodka po płaskim montażu umożliwia analizę całego pola progenitorów nerkowych irx3b+ w prosty sposób w odniesieniu do somitów wzdłuż tułowia i innych struktur embrionalnych (ryc. 1B). W ten sposób za pomocą tej metody można idealnie udokumentować skomplikowane domeny przestrzenne.

Kilka głównych kroków jest związanych z pomyślnym przeprowadzeniem procedury montażu płaskiego. Aby wykonać tę technikę, kulka żółtka musi być najpierw odłączona od właściwego zarodka (ryc. 2A), co można zrobić za pomocą precyzyjnych narzędzi, takich jak para cienkich kleszczy, podczas gdy zarodek jest wizualizowany za pomocą stereomikroskopu. Po prymitywnym usunięciu kulki żółtka, do zeskrobania granulek żółtka, które pozostały przyczepione do zarodka, używa się cienkiego narzędzia do rzęs (ryc. 2B). Usunięcie pozostałych granulek żółtka ułatwia wizualizację tkanek embrionalnych. Na koniec zarodek z żółtkiem jest manipulowany w celu stabilnego umieszczenia go na szkiełku podstawowym (ryc. 2C), co umożliwia obserwację i pomaga w dokumentacji próbki za pomocą oprogramowania do obrazowania i kamery dołączonej do mikroskopu. Narzędzia do rzęs to urządzenia domowej roboty, które można skonstruować, przymocowując odpowiednią rzęsę do końcówki pipety za pomocą kleju superglue, który w razie potrzeby można zamontować na uchwycie (Rysunek 3A, tabela materiałów). W celu wytworzenia narzędzi do rzęs o nieco innych właściwościach pod względem długości i stożka można uzyskać różne próbki rzęs (ryc. 3B), do których każdy użytkownik może mieć inne upodobania, gdy zacznie eksperymentować z procedurą płaskiego mocowania. Przykłady próbek rzęs obejmują naturalnie wypadające ludzkie rzęsy, naturalnie wypadające żylaste włosy lub wąsy zwierzęce, a także syntetyczne odmiany rzęs dostępnych na rynku, które można znaleźć w detalicznych działach kosmetycznych.

Lokalny obszar otaczający i zawierający próbkę (próbki) umieszczoną na szklanym szkiełku (Rysunek 4A) może być zobrazowany do analizy w wysokiej rozdzielczości. Kombinacja sond została użyta do oznaczenia rozwijających się komórek progenitorowych nerek, które dają początek nerce w zarodku typu dzikiego we wczesnych stadiach rozwojowych za pomocą dwukolorowego WISH, a następnie przeprowadzono przygotowania do montażu płaskiego w celu obejrzenia próbek (Figura 4B, 4C). We wczesnych stadiach somitów progenitorzy nerek są wyznaczeni we wzorze w kształcie litery U przez ekspresję transkryptów pax2a (fioletowych) otaczających mezodermę przyosiową, która jednocześnie wyraża delta C (dlc) (czerwony) (lewa kolumna, ryc. 4B)^6,7. Dla porównania, gdy transkrypty DLC zostały wykryte z fioletowym substratem i zostały oznaczone w połączeniu z markerem tyłomózgowia krox20 (czerwony), zwizualizowano poddomenę rostralną przodków nerek, która wyraża dlc (prawa kolumna, ryc. 4B), jak wspomniano wcześniej^6,7. Preparaty flat mount mogą być stosowane w podobny sposób do badania późniejszych etapów somitogenezy. Na etapie 14 somitów przeanalizowaliśmy ekspresję markerów nerkowych pax2a, slc4a4 i slc12a3 (fioletowy) wraz z smyhc1 (czerwony), który oznacza somity (Figura 4C). Kombinacje te umożliwiają mapowanie całej domeny progenitorowej nerki za pomocą pax2a, ujawniając jednocześnie, że podzbiór komórek w poddomenie rostralnej wyrażał slc4a4a i różnił się nienakładającą się poddomeną ogonową przodków nerek, które wykazywały ekspresję slc12a3.

Dwukolorowe ŻYCZENIE i preparat do montażu płaskiego są również cenne dla badania domen komórkowych podczas organogenezy u danio pręgowanego z mutacjami genetycznymi lub innymi zaburzeniami wynikającymi z ekspozycji środowiska na małe cząsteczki^6,7 (Rysunek 5). Mutanty danio pręgowanego nls i lib są nosicielami mutacji w dehydrogenazie aldehydowej 1a2 (aldh1a2, wcześniej znanej jako raldh2), która koduje enzym niezbędny do biosyntezy kwasu retinowego (RA). RZS jest niezbędny do prawidłowego rozwoju wielu typów komórek nerkowych, w tym do tworzenia komórek podocytów, które przyczyniają się do wytwarzania filtra krwi w nerce embrionalnej, znanej jako kłębuszki^{nerkowy 6,7}. WISH wykonano w celu znakowania komórek progenitorowych podocytów wt1a jednocześnie z rozgraniczeniem rozwijających się somitów za pomocą smyhc1 i tyłomózgowia za pomocą krox20 w zarodkach typu dzikiego, zarodkach z mutacją NLS, zarodkach z mutacją lib i zarodkach traktowanych chemicznym inhibitorem enzymu Aldh, DEAB (Figura 5). Zarodki z niedostateczną ekspresją aldh1a2 wykazywały zmniejszoną ekspresję wt1a w porównaniu z zarodkami typu dzikiego, podczas gdy zarodki traktowane DEAB wykazywały zniesienie transkryptów wt1a (ryc. 5, prawa kolumna). Podsumowując, te reprezentatywne wyniki pokazują, w jaki sposób technika flat mount może być wykorzystana do precyzyjnej analizy i dokumentowania różnic anatomicznych we wczesnym zarodku, a tym samym może zostać wykorzystana do cennych badań rozwojowych.

Rysunek 1. Przegląd preparatu do montażu płaskiego dla zarodków danio pręgowanego. A) Procedura płaskiego montażu umożliwia jednoczesne oglądanie tkanek wzdłuż osi zarodka, ponieważ centralna masa żółtka jest usuwana, a zarodek stabilnie ustawiany na płaskiej powierzchni. B) Obrazy całego zarodka wybarwionego metodą WISH w widoku bocznym i grzbietowym, a następnie po płaskim montażu przeprowadzono preparację. Zarodek został wybarwiony sondami antysensownymi w celu wykrycia transkryptów genów kodujących irx3b (fioletowy) i myod1 (czerwony).

Rysunek 2. Schemat procedury flat mount dla zarodków danio pręgowanego. A) Zarodek jest najpierw grubo odżółkowany w celu usunięcia większości masy żółtkowej, następnie (B) powierzchnia brzuszna jest drobno ogolkowana w celu usunięcia pozostałych granulek żółtka, a po umyciu zarodka jest (C) montowana grzbietową stroną do góry na szkiełku podstawowym w celu analizy wizualnej i/lub obrazowania fotograficznego.

Rysunek 3. Zdjęcia przykładowych narzędzi do rzęs w porównaniu z cienkimi kleszkami. A) Narzędzia do rzęs domowej roboty zostały sfotografowane wraz ze standardową parą cienkich kleszczyków, umieszczonymi obok linijki metrycznej, aby zapewnić odniesienie. B) Powiększony widok narzędzi do rzęs obok cienkich kleszczy, z milimetrowym odniesieniem podanym wzdłuż górnej części widoku. Pokazane są dwa różne narzędzia do rzęs, z gwiazdką (*) używaną do oznaczania rzęsy uzyskanej z naturalnie wypadającej ludzkiej rzęsy oraz podwójną gwiazdką (**) używaną do oznaczania rzęsy, która została uzyskana z naturalnie zrzuconych kocich wąsów i przycięta, aby uzyskać nieco koniec. W każdym przypadku rzęsa została przewleczona przez końcówkę pipety i przymocowana kilkoma warstwami kleju superglue, aby stopniowo stworzyć mocne uszczelnienie stabilizujące/zakotwiczające rzęsę do pipety przymocowanej do urządzenia manipulacyjnego.

Rysunek 4. Charakterystyka zmian rozwojowych w polu progenitorowym nerki w zarodku danio pręgowanego typu dzikiego. A) Schemat slajdu przedstawiający obszar zobrazowany do analizy w (B, C). B) Zarodki typu dzikiego w stadium 1, 3 i 5 somitów barwiono dwukolorowym WISH w celu oceny składu pola progenitorowego nerki, które daje początek nerce embrionalnej, czyli przednercza. (Lewa kolumna) Transkrypty kodujące czynnik transkrypcyjny pax2a (zabarwiony na fioletowo) oznaczają kilka populacji w zarodku, w tym pole progenitorowe nerki, które wyłania się z mezodermy pośredniej. Transkrypty kodujące DLC ligandu Notch oznaczają somity, które tworzą się z mezodermy przyosiowej (zabarwionej na czerwono). (prawa kolumna) Gdy w tych samych zarodkach bada się ekspresję transkryptów DLC (barwionych na fioletowo) i markera rombomeru tylnego mózgu krox20 (barwionego na czerwono), ekspresję DLC można zaobserwować w poddomenie rostralnej progenitorów nerkowych znajdujących się w sąsiedztwie somitów 1-5, która była zasłonięta podczas jednoczesnego barwienia DLC z pax2a. C) Zarodki typu dzikiego w stadium 14 somitów były podwójnie lub potrójnie barwione kombinacją markera nerkowego (fioletowy), markera somitu smyhc1 (czerwony) i markera rombomerowego tyłomózgowia krox20 (również czerwony). (Górny panel) Na tym etapie transkrypty pax2a nadal wyznaczają progenitory nerek. (Środkowe, Dolne panele) Na terytorium progenitora nerki subdomena rostralna jest oznaczona przez slc4a4, a transkrypty kodujące slc12a3 oznaczają subdomenę ogonową.

Rysunek 5. Zastosowanie preparatów montowanych płasko w celu scharakteryzowania fenotypów spowodowanych mutacjami genetycznymi lub chemicznymi zaburzeniami genetycznymi, które modulują biosyntezę kwasu retinowego. Wzorzec ekspresji WISH w stadium 15 somitów wt1a (fioletowy) i smyhc1/krox20 (czerwony) porównano między typami dzikimi a zarodkami z niedoborami w produkcji kwasu retinowego (RA) z powodu defektów dehydrogenazy aldehydowej 1a2 (mutacje NLS i lib) lub chemicznego hamowania aktywności dehydrogenazy retinaldehydu za pomocą dietyloaminoobenzaldehydu (DEAB). Zmniejszenie produkcji RZS w lib jest nieco bardziej dotkliwe niż w nls, tak że zarodki lib wyrażają nieco zmniejszone barwienie transkryptów wt1a niż podobnie zaawansowane zmutowane zarodki nls, podczas gdy leczenie DEAB dzikich typów wiąże się z całkowitym zniesieniem ekspresji wt1a.

Dyskusja

W ostatnich latach danio pręgowany okazał się niezwykle cennym organizmem modelowym w całej społeczności naukowej. Danio pręgowany wykazuje znaczny stopień ochrony genetycznej w porównaniu z wyższymi kręgowcami, a zalety związane z ich anatomią, hodowlą i cyklem życiowym sprawiają, że gatunek ten jest bardzo podatny na analizy eksperymentalne. Co więcej, postęp w technikach molekularnych mających zastosowanie do danio pręgowanego jeszcze bardziej przyczynił się do wykorzystania tego organizmu modelowego w badaniach naukowych. Na przykład, stworzono wiele różnych transgenicznych linii danio pręgowanego, aby zbadać postęp choroby i odpowiedzieć na wiele podstawowych pytań, które leżą u podstaw kluczowych mechanizmów rozwoju, w tym organogenezy.

W związku z tym, w oparciu o dynamiczne wykorzystanie danio pręgowanego zarówno w badaniach nad chorobami, jak i rozwojem, metodologie znakowania komórek i kwantyfikacja sygnałów są kluczowym aspektem analiz danych. Podczas gdy metody wykorzystujące przeciwciała fluorescencyjne mogą być stosowane do wykrywania ekspresji białek u transgenicznego danio pręgowanego, naukowcy zazwyczaj polegają na standardowych procedurach, takich jak WISH^12-16, aby zbadać czasoprzestrzenną lokalizację transkryptów genów w stałej, nietransgenicznej próbce danio pręgowanego. W rzeczywistości WISH jest jedną z najczęściej stosowanych technik w biologii i jest istotnym narzędziem używanym do charakteryzowania fenotypu mutacji genetycznych i chemicznych zaburzeń genetycznych. Niemniej jednak WISH wiąże się z wieloma potencjalnymi pułapkami i wyzwaniami. Aby potwierdzić swoistość antysensownej rybosondy, rybosondy sensacyjne mogą być używane jako kontrola do oceny swoistości wzorców barwienia antysensownej rybosondy. Podczas gdy sekcje 4 i 5 są przedstawione w kolejności etykietowania i wykrywania sondy znakowanej digoksygeniną, a następnie sondy znakowanej fluoresceiną, kolejność tę można odwrócić. Zazwyczaj słabsze sygnały (geny o niższych poziomach ekspresji) są najlepiej wykrywane za pomocą sond znakowanych digoksygeniną, a to barwienie rozwija się najpierw za pomocą fioletowego substratu, a następnie wykrywania i barwienia silniejszego sygnału (genu o większej ekspresji) za pomocą czerwonego substratu. Jeśli jednak mają być przeprowadzone reakcje dwukolorowe, zaleca się przetestowanie różnych kombinacji etykiet i substratów w celu znalezienia procedury, która jest najbardziej odpowiednia do zbierania i analizy danych. Ponadto czasy przewidziane na blokowanie, inkubację przeciwciał i płukanie podane w sekcjach 4-5 są dostosowane do zarodków młodszych niż 24 godziny po zapłodnieniu; Długie odstępy między tymi samymi krokami ze starszymi zarodkami mogą prowadzić do gromadzenia się soli na próbce. Obszerne wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów ze standardowym zarodkiem danio pręgowanego WISH zostały już udokumentowane w literaturze^12-16. Prawdopodobnie najczęstszym dylematem jest wysokie tło. Zalecamy zwiększenie liczby prań MABT w kroku 4.7 do 15-20 prań w razie potrzeby, chociaż z naszego doświadczenia wynika, że dodanie "super-prania" MABT na noc daje znakomite rezultaty, gdy jest używane w połączeniu z 10 lub więcej krótkimi praniami MABT przed przejściem do kroku 4.8. Innym przykładem dylematu jest słaba infiltracja sondy, która może wystąpić w przypadku długich rybosond. Ścinanie rybosondy zgodnie z krokiem 3.6 poprzez hydrolizę alkaliczną może temu przeciwdziałać. Z naszego doświadczenia z młodymi próbkami wynika, że ścinanie sondą zazwyczaj nie jest wymagane. Należy jednak pamiętać, że parametry takie jak ten mogą być czynnikami przyczyniającymi się do wyniku eksperymentu WISH i sugerujemy zapoznanie się z tymi przydatnymi instrukcjami rozwiązywania problemów, które są już publicznie dostępne w społeczności, w razie potrzeby, aby udoskonalić parametry eksperymentalne dla WISH we^{własnych badaniach}.

Oprócz tradycyjnych technik WISH^12-16, stale pojawiają się postępy w metodologiach WISH i alternatywnych protokołach, które zostały sformułowane. Należą do nich nowe sposoby detekcji sygnałów, takie jak wykorzystanie fluorescencji^17-19, po metody umożliwiające lokalizację mikroRNA²⁰. Mimo to, pomimo wielu ulepszeń, które zostały wprowadzone do obecnych metod znakowania komórek, skuteczność tych procedur jest negowana, jeśli barwienia nie mogą być łatwo zobrazowane w próbce zainteresowania w pożądanym punkcie czasowym. To ograniczenie jest problematyczne dla badaczy, zwłaszcza gdy dotyczy wczesnych etapów embrionalnych ontogenezy danio pręgowanego, co może potencjalnie prowadzić do luk w naszym zrozumieniu różnych procesów rozwojowych, które pojawiają się w tym czasie. Podczas normalnego rozwoju danio pręgowanego woreczek żółtkowy będzie się stopniowo zmniejszał w miarę osiągania wieku¹¹ lat. Dlatego w tych późniejszych stadiach rozwoju (>24 godziny po zapłodnieniu) barwienie WISH jest dość proste do analizy, ponieważ zarodek jest większy w porównaniu z przylegającym do niego woreczkiem żółtkowym. Nie dzieje się tak jednak od etapu pąka ogonowego do wczesnej somitogenezy (kiedy masa embrionalna jest umieszczona wokół żółtka), gdzie nieprzezroczysty woreczek żółtkowy może czasami zasłaniać wizualizację plamy. W związku z tym metoda płaskiego montażu została opracowana, aby pomóc złagodzić problemy związane z obrazowaniem i analizą danych związane z charakteryzacją wczesnych próbek zarodków danio pręgowanego (schematyzowane na rysunku 1 i rysunku 2) i jest szeroko stosowana od czasu systematycznego fenotypowania mutacji genetycznych wyizolowanych z pierwszych badań genetycznych na dużą skalę²¹.

Od czasu pojawienia się techniki montażu płaskiego analiza wczesnych etapów rozwojowych została znacznie ulepszona. Po usunięciu żółtka z zarodka możliwe jest ułożenie zarodka płasko na szkiełku podstawowym w pożądanej orientacji do obrazowania. Ta dwuwymiarowa pozycja umożliwia oglądanie całego zarodka jednocześnie, co eliminuje konieczność obracania próbki. Liczne tkanki znajdują się w szerokich domenach zarodka, takich jak prekursory tworzące krew i nerki. Ponadto może być konieczne porównanie kilku różnych rozwijających się tkanek w tym samym czasie. Płaskie mocowanie umożliwia badaczowi jednoczesne oglądanie całej domeny takich grup komórek, a tym samym może znacznie pomóc w kwantyfikacji, takiej jak pomiar powierzchni tkanki lub liczby komórek. Technika ta ostatecznie pomogła doprowadzić do wielu odkryć dotyczących wielu ważnych mechanizmów rozwojowych leżących u podstaw hematopoezy, neurogenezy i organogenezy. Tak więc, po opanowaniu, zastosowania tej prostej techniki dla badaczy są dość znaczące.

Na przykład w badaniu oceniającym wybór linii podczas hematopoezy, preparaty flat mount zarodków danio pręgowanego w 14 i 18 stadiach somitowych (ss) zastosowano w celu zilustrowania zmian, które zaszły we wzorcu ekspresji czynnika transkrypcyjnego palca cynkowego pu.1 między zarodkami typu dzikiego i zarodkami z wstrzykniętym morfolinem GATA1 ²². Metoda ta umożliwiła wykrycie rozszerzonej domeny pu.1 w 18 ss, co wskazuje, że gata1 najprawdopodobniej reguluje ekspresję pu.1 w pośredniej masie komórkowej (ICM) w tym punkcie czasowym. Dodatkowe płasko osadzone zarodki barwione pod kątem różnych genów erytroidalnych, w tym gtpbp1 i epsiny, wykazały utratę ekspresji tych genów w mutantach vlt, które były gata1^-/-. Dalsze analizy nie wykazały żadnych zmian w ekspresji genów erytoidowych, takich jak biklf i testhymin, o których wiadomo, że są niezależne od aktywności GATA. W związku z tym, w połączeniu z innymi wynikami eksperymentalnymi, ujawniono, że gata1 jest niezbędny w regulacji różnicowania komórek w linii mielo-erytroidalnej. W badaniu rozwoju grzebienia nerwowego, płaskie mocowania wykorzystano do zbadania ekspresji grzebienia w mutantach Mont Blanc (mob^m610) w badaniu badającym role funkcji genu Mont Blanc i tfap2a ²³. Po 10 i 20 ss ekspresja grzebienia została całkowicie zniesiona w głowie i zmniejszyła się w obszarze tułowia mutantów ^{mob m610} w porównaniu z normalną ekspresją typu dzikiego, co ostatecznie pomogło tej grupie wyciągnąć wnioski na temat znaczenia regulacji Mont Blanc i TFAP2A podczas tworzenia grzebienia nerwowego. Dodatkowo, jeśli chodzi o organogenezę, płaskie mocowania umożliwiły odkrycie obecności odrębnych domen we wczesnym polu progenitorowym nerki podczas rozwoju zarodka nerki danio pręgowanego, znanej jako przednercze. Zarodek danio pręgowanego zapewnia konserwatywny, a jednocześnie anatomicznie prosty system do badania, w jaki sposób progenitorzy nerek dają początek jednostkom funkcjonalnym nefronów, które składają się na przednercze, proces znany jako nefrogeneza^6,7 (ryc. 4). Analiza płaskiego montażu była przydatna do dokumentowania domen komórek progenitorowych nerek i analizowania wyników zmian w sygnalizacji RZS podczas wzorca przednercza^6,7 (Figura 5), co było wcześniej nieznane. Podsumowując, przykłady te sugerują, że istnieje wiele szerokich zastosowań tego płaskiego protokołu montażu w badaniu różnych procesów, które zachodzą podczas normalnego rozwoju i stanów chorobowych.

Koncepcyjnie ta procedura montażu płaskiego jest ogólnie dość prosta. Jednak manipulacje i stopień finezji wymagany do opanowania tej metody mogą być dość trudne do opanowania przy braku wizualnej demonstracji. W związku z tym protokół ten został opracowany, aby umożliwić naukowcom, zwłaszcza tym, którzy są nowicjuszami w modelu danio pręgowanego, lepsze zrozumienie, jak wykonać tę technikę i podzielenie się naszymi poradami na temat odczynników, które mogą zoptymalizować postępowanie z tkankami. Mamy nadzieję, że ten protokół ostatecznie pozwoli innym członkom społeczności na udoskonalenie najbardziej idealnych warunków próbkowania, które zostaną wykorzystane do obrazowania premium, analizy danych i komunikowania swoich wyników w publikacjach. Ostatecznie powinno to umożliwić naukowcom pokonanie anatomicznych przeszkód u danio pręgowanego na wczesnym etapie embriogenezy, które mogą zaciemniać prezentację wyników eksperymentalnych, i rozwiązanie ich problemów dzięki zastosowaniu tej prostej, ale znaczącej techniki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
50 X E3			250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 w wodzie destylowanej. Uzupełnij błękitem metylenowym (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) w celu zahamowania zanieczyszczeń.
1 X E3			Rozcieńczyć 50 X E3 w wodzie destylowanej.
Sitko siatkowe do herbaty	English Tea Store	SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Naczynie do inkubacji zarodków	Falcon	35-1005
Pipeta transferowa	Samco	202, 204
Probówka do mikrowirówek z płaskim dnem	VWR	87003-300; 87003-298
Fiolka szklana	Wheaton	225012
1x PBST			0,1% detergent Tween-20 w 1x PBS, wytwarzany przez rozcieńczenie 10x PBS w wodzie destylowanej.
Tween-20 stock	American Bioanalytical	AB02038
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	19210
4% PFA/1X PBS			Rozpuścić 4% PFA (w/v) w 1x PBS, doprowadzić do wrzenia na gorącej płycie w dygestorium. Schłodzić i zamrozić porcje do przechowywania w temperaturze -20 °C. Rozmrozić tuż przed użyciem i nie zamrażać ponownie zapasów.
Jednostka do sterylizacji filtrów	Corning	430516	System filtracyjny 1 L, 0,45 μ m
CA MeOH	Sigma	34860-4L
Proteinaza K	Roche	03-115-879-001	Rozpuścić w wodzie destylowanej, aby uzyskać zapas proteinazy K (10 mg / ml) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 & stopni C.
HYB+			50% formamid, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/ml RNA toruli drożdżowej, 50 μ g/μ l
Rybosonda znakowana heparyną DIG/FLU in vitro odczynniki reakcji transkrypcyjnej	Roche	11175025910; 11685619910	Zapoznaj się z instrukcjami producenta.
Polimeraza RNA SP6 Polimeraza	Roche	11487671001
Polimeraza RNA T7 Polimeraza		10881775001
Polimeraza RNA T3	Inhibitor Roche	11031171001
RNazy 1	Inhibitor	3335399001
DNazy 1, 10x bufor DNazy 1	Roche	4716728001
Glycogen	Roche	10901393001
Etanol (EtOH)	Sigma	E7023	Podwielokrotność 50 ml podwielokrotności 100% EtOH i 70% EtOH (rozcieńczone wodą o czystości cząsteczkowej) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Woda destylowana klasy molekularnej	Mediatech	25-055-CM
Waterbath	Thermo	51221073	Model 2831
Nanodrop	Thermo	ND-2000c
Formamid	Amerykański AB00600 bioanalityczny		Przechowywać w temperaturze -20 stopni C.
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
MAB			2 L formuła: W 1,5 l wody destylowanej wymieszaj 23,2 g kwasu maleinowego, 17,5 g NaCl, 55,0 g zasady Trisma, następnie dodaj 8 ml 1M Tris-HCl pH 9,5, a następnie napełnij do 2 L. Autoklaw.
MABT			MAB + 0,1% (v/v) Tween-20
Roztwór			Robimy w 50 ml świeże porcje: 10 ml BSA (z 10% bulionu laboratoryjnego), 5 ml FCS (z bulionu) i 35 ml MABT. Zapisz nieużywany blok na 4 & stopni; C do stosowania jako roztwór przeciwciał. Uwaga: Rozmrozić zapasy BSA i FCS na poziomie 37 & deg; C– Jeśli rozmrozisz je w wyższej temperaturze, staną się gęstym żelem (nie używaj).
FCS (płodowa surowica cielęca)	Invitrogen	16140089	porcji Aliquot w porcjach po 5 lub 10 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Amerykański	AB00448	Bioanalityczny	Przygotować 10% bulion rozcieńczony w MAB przez rozpuszczenie płatków BSA w temperaturze pokojowej z szybkim mieszaniem, a następnie przechowywać 10 ml podwielokrotności w temperaturze -20 stopni C. Nierozpuszczone płatki BSA przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Przeciwciało anty-digoksygeninowe	Roche	11-093-274-910	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Przeciwciało antyfluoresceinowe	Roche	11-426-338-910	Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
12-dołkowe naczynie barwiące	BD-Falcon	35-3225
		do wstępnego barwienia	100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20. Zawsze rób świeże: wytrąci się w ciągu kilku dni.
Roztwór barwiący-fioletowy			Na każde potrzebne 10 ml: dodać 45 μ l z NBT i 35 μ BCIP do świeżego buforu do wstępnego barwienia (niestosowanego w próbkach zarodków).
Roztwór barwiący - czerwony			Na każde potrzebne 10 ml: dodać 31,5 μ l z INT i 35 μ BCIP do świeżego buforu do wstępnego barwienia (niestosowanego w próbkach zarodków).
Zapas NBT	Sigma	N6876	Przechowywany w temperaturze -20 ° C; proszek rozcieńczony 50 mg/ml w 70% DMF, 30% wodzie.
INT zapas	Sigma	I8377	Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C; proszek rozcieńczony 55 mg/ml w 70% DMF, 35% wodzie.
Kolba BCIP	Sigma	B8503	Przechowywana w temperaturze -20 & deg; C; proszek rozcieńczony 50 mg/ml w 100% DMF.
DMF (dimetyloformaldehyd)	AB00450		Bioanalityczny
Glicyna	Sigma	G8898	0,1 M glicyna, pH 2,2
Mała plastikowa szalka Petriego	Corning	430589, 430588
Glicerol	Sigma	G7893
Drobne kleszcze	Roboz	RS-1050	Dumont Pęseta Wzór #55
Narzędzie			Zbudowany poprzez przymocowanie odpowiedniej rzęsy do końcówki pipety (można użyć rozmiarów od P10 do P1000) za pomocą kleju superglue. Używamy naturalnie wypadającej ludzkiej rzęsy, naturalnie zrzucanych zwierzęcych wąsów lub żylastych włosów futrzanych lub rzęs naturalnych lub syntetycznych zakupionych w dziale kosmetycznym w sklepie farmaceutycznym lub detalicznym (bardzo długie rzęsy są najbardziej podatne na stabilne osadzenie na końcówce pipety). Końcówka pipety jest przymocowana do prostego pręta (o długości 8-10 cm), takiego jak uchwyt na igłę (np. , Fisher 08-965-A) w celu łatwej obsługi. Zobacz Rysunek 3 aby zobaczyć zdjęcia tych domowych narzędzi.
Szkiełko szklane	Thermo-Fisher	4445	White Frost
Szkiełko nakrywkowe	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
Modelina	Hasbro	Playdoh	Można zastąpić inne produkty z plasteliny rzemieślniczej.
Uchwyt na prowadnice	Thermo-Fisher	12-587-10	Taca kartonowa do przechowywania szkiełek na płasko.
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ645, SMZ1000
Mikroskop złożony	Nikon	80i, 90i