Ocena behawioralna układu przedsionkowego starzejącej się myszy

Podsumowanie

Wiadomo, że kontrola motoryczna i równowaga pogarszają się wraz z wiekiem. W artykule przedstawiono szereg standardowych nieinwazyjnych testów behawioralnych z dodatkiem prostego bodźca obrotowego, który stanowi wyzwanie dla układu przedsionkowego i pokazuje zmiany w wydajności równowagi w mysim modelu starzenia.

Streszczenie

Związany z wiekiem spadek równowagi wiąże się z pogarszającą się siłą mięśni, koordynacją ruchową i funkcją przedsionkową. Podczas gdy wiele badań wykazuje zmiany w fenotypie równowagi wraz z wiekiem u gryzoni, bardzo niewiele z nich izoluje wkład układu przedsionkowego w równowagę w normalnych warunkach lub podczas starzenia się. Używamy dwóch standardowych testów behawioralnych, aby scharakteryzować wydajność równowagi myszy w określonych punktach wiekowych w ciągu całego życia: test Rotarod i test pochylonej równoważni. Co jednak ważne, specjalnie zbudowany rotator jest również używany do stymulacji układu przedsionkowego myszy (bez wywoływania jawnych objawów choroby lokomocyjnej). Te dwa testy zostały wykorzystane do wykazania, że zmiany w wydajności równowagi za pośrednictwem układu przedsionkowego są obecne przez całe życie myszy . Wstępne wyniki pokazują, że zarówno test rotarod, jak i zmodyfikowany test równoważni mogą być wykorzystywane do identyfikacji zmian w wydajności równowagi podczas starzenia się jako alternatywa dla trudniejszych i bardziej inwazyjnych technik, takich jak pomiary przedsionkowo-oczne (VOR).

Wprowadzenie

Nasz zmysł równowagi jest prawdopodobnie jednym z najbardziej pomijanych, ale istotnych elementów nawet najbardziej podstawowych czynności motorycznych, takich jak chodzenie i obracanie się. Na równowagę wpływa wiele czynników, w tym siła mięśni, koordynacja ruchowa i funkcja przedsionkowa, i tylko w obecności neuropatii przedsionkowych lub podczas normalnego starzenia się docenia się znaczenie w pełni funkcjonalnego systemu równowagi. Zaburzenia układu przedsionkowego są często związane z doświadczaniem zawrotów głowy lub zawrotów głowy i braku równowagi, co skutkuje zwiększonym ryzykiem upadków i późniejszych urazów¹. Jest to szczególnie ważne w starszych populacjach, gdzie upadki są jedną z głównych przyczyn urazów².

Testy funkcji przedsionkowych są zwykle oparte na odruchach przedsionkowych, w szczególności przedsionkowo-ocznych (VOR) lub przedsionkowo-kolczystych (VCR). VOR i magnetowid są niezbędne do stabilizacji obrazów na siatkówce i pozycji głowy podczas ruchów odpowiednio głowy i ciała. Zazwyczaj pomiary VOR wymagają inwazyjnej implantacji cewek poszukiwawczych w celu pomiaru ruchów gałek ocznych lub śledzenia ruchu gałek ocznych³. Jest to trudne u myszy ze względu na mały charakter oka myszy i trudności w wykryciu źrenicy do analizy wideo³. Alternatywnie, magnetowid został wykorzystany do pomiaru stabilizacji głowy w odpowiedzi na ruchy ciała u myszy bez konieczności inwazyjnej operacji⁴. Mimo to niewiele badań koncentruje się konkretnie na tym, jak działa układ przedsionkowy jako całość, a co ważniejsze, jak zmienia się podczas starzenia się.

Aby w prosty i nieinwazyjny sposób ocenić ogólną wydajność równowagi, zmodyfikowaliśmy dwa powszechnie używane testy behawioralne. Testy z rotarodem i pochyloną równoważnią oceniają różne aspekty wydajności motorycznej u gryzoni i w poprzednich badaniach były wykorzystywane w akumulatorze testowym w celu uzyskania pełnego profilu zdolności motorycznych. Na tę zdolność może wpływać choroba lub modyfikacja genetyczna, a także jest wrażliwa na procesy związane z normalnym rozwojem i starzeniem^{się 5-7}. Wcześniejsze prace z użyciem rotarodu wykazały, że koordynacja ruchowa u myszy pogarsza się po 3^{miesiącu życia 8}. Ponadto szczury wykazują zauważalne deficyty równowagi wraz z wiekiem w teście równoważni⁹.

Ten artykuł opisuje użycie testów rotarod i równoważni w połączeniu z bodźcem przedsionkowym w celu rzucenia wyzwania układowi przedsionkowemu i scharakteryzowania późniejszego wpływu na wydajność równowagi u młodych i starszych myszy. Chociaż opisane proste i nieinwazyjne metody nie są zaprojektowane jako samodzielne pomiary obwodowej funkcji przedsionkowej, zapewniają one użyteczną i prostą miarę behawioralną do porównywania zmian komórkowych i subkomórkowych na wielu etapach przetwarzania przedsionkowego podczas normalnego starzenia się u myszy.

Protokół

1. Zwierzęta

1. Myszy (C57/BL6) w wieku 1, 9 i 13 miesięcy uzyskano z Centrum Zasobów Zwierzęcych (Perth, Australia). Myszy te były trzymane w standardowych klatkach dla myszy w Bosch Rodent Facility na Uniwersytecie w Sydney w 12/12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Przedstawione poniżej procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Sydney.
2. Przed każdym testem należy wprowadzić klatki dla myszy do pomieszczenia testowego na 10 minut, aby umożliwić myszom zaaklimatyzowanie się w środowisku testowym.

2. Rotarod

1. Ustaw aparat rotarod (rysunek 1A):
   1. Zamontuj kołki na każdym pasie rotarod.
      Uwaga: W tym przypadku kołki szczurze (o średnicy 70 mm) są używane zamiast kołków myszy (o średnicy 32 mm), aby zniechęcić myszy do trzymania się kołka i wykonywania "pasywnych obrotów"¹⁰.
   2. Umieść magnetyczne platformy do lądowania na drucie znajdującym się na dole każdego pasa ruchu rotarodu, upewniając się, że nie przechylają się, aby dotknąć podłogi rotarod i są umieszczone jak najbliżej magnetycznej prawej ściany każdego pasa bez dotykania.
      Uwaga: Podczas testowania Rotarod myszy muszą chodzić w kierunku do przodu, aby pozostać na obracających się i przyspieszających kołkach. Kiedy mysz nie jest już w stanie utrzymać się na kołku, spada i przemieszcza platformę lądowania, która następnie aktywuje czujnik magnetyczny. Czas potrzebny do upadku z obracającego się kołka, prędkość obrotowa kołka w momencie upadku oraz przebyta odległość są automatycznie obliczane dla każdej myszy i rejestrowane na ekranie wyświetlacza z przodu rotarod.
   3. Wsuń 2 przezroczyste plastikowe panele z przodu każdego pasa obrotu z krótszymi panelami na dole i dłuższymi panelami powyżej.
   4. Wprowadź parametry testowe za pomocą klawiatury znajdującej się z przodu rotorodu. Postępować zgodnie z krokami 2.1.4.1 do 2.1.4.6 dla parametrów badania prędkości obrotowej oraz etapami od 2.1.4.7 do 2.1.4.12 dla parametrów badania rotarod przy stałej prędkości.
      1. Ustaw maksymalny czas trwania testu na 60 sekund.
      2. Ustaw liczbę torów, które mają być używane (lub liczbę myszy do przetestowania).
      3. Ustaw prędkość początkową testu na 5 obr./min.
      4. Ustaw maksymalną prędkość testu na 44 obr./min.
      5. Ustaw prędkość narastania testu na 60 sekund.
      6. Ustaw rozmiar wybranych kołków i kierunek obrotu na kołki szczurów obracające się w kierunku do przodu.
      7. Ustaw maksymalny czas trwania testu na 240 sekund.
      8. Ustaw liczbę torów, które mają być używane, na 1, ponieważ myszy są testowane indywidualnie.
      9. Ustaw prędkość początkową testu na 15 obr./min.
      10. Ustaw maksymalną prędkość testu na 15 obr./min.
      11. Ustaw prędkość narastania testu na 0 sekund.
      12. Ustaw rozmiar wybranego kołka i kierunek obrotu na kołek szczura obracający się w kierunku do przodu.
          Uwaga: powyższe ustawienia mogą ulec zmianie w zależności od potrzeb różnych eksperymentów.
   5. Umieść kamerę przed rotarodem do testu rotarod o stałej prędkości, tak aby można było nagrywać zachowanie myszy podczas prób i wykorzystywać filmy do późniejszej analizy w celu określenia czasu, przez jaki myszy były w stanie pozostać na rotarod
   .
2. Wykonaj kroki od 2.2.1 do 2.2.4 dla badania obrotowego przyspieszającego:
   1. Umieść jedną mysz na każdym nieruchomym kołku na 5 minut, aby umożliwić myszom zaaklimatyzowanie się do rotarodu.
   2. Delikatnie popchnij myszy, aby były zwrócone w stronę tylnej części rotarodu i rozpocznij test rotarod, gdy wszyscy badani są zwróceni w tym kierunku (patrz rysunek 1B).
   3. Przywróć wszystkie myszy do klatek, gdy spadną z obracających się kołków i pozostaw je na 10 minut z dostępem do jedzenia i wody.
   4. Powtórz kroki od 2.2.1 do 2.2.3, aby ukończyć w sumie 8 prób, upewniając się, że kołki, tory i platformy do lądowania rotarod są oczyszczone z moczu i kału, a następnie przesuwaj platformy lądowania z powrotem do pozycji wyjściowej między każdą próbą.
      Uwaga: Pierwsze 3-5 prób służy jako próby treningowe, aby umożliwić myszom zapoznanie się z zadaniem. Czas do upadku, przebyta odległość i końcowa prędkość obrotowa kołka w momencie upadku dla każdej kolejnej próby są rejestrowane do późniejszej analizy (rysunek 2).
3. Wykonać kroki od 2.3.1 do 2.3.8 dla badania rotarodu o stałej prędkości:
   1. Umieść jedną mysz na kołku na 5 minut, aby umożliwić jej zaaklimatyzowanie się do rotarodu. Umieść mysz z powrotem w klatce.
   2. Rozpocznij nagrywanie wideo w kamerze i naciśnij start na rotarod. Następnie umieść mysz na obracającym się kołku, upewniając się, że jest skierowana do tyłu rotarodu.
   3. Zatrzymaj nagrywanie wideo w aparacie, gdy mysz spadnie z obracających się kołków, i wróć do klatek na 10 minut z dostępem do jedzenia i wody.
   4. Powtarzać kroki 2.3.2 i 2.3.3, aż do uzyskania łącznie 8 prób, upewniając się, że kołki, tory i platformy lądowania rotarod są oczyszczone z kału i moczu, a następnie przesunąć platformy lądowania z powrotem do pozycji wyjściowej między każdą próbą.
   5. Włącz specjalnie zbudowany rotator na 3 Hz na 20 sekund, aby myszy mogły zapoznać się z dźwiękiem. Zatrzymaj rotator po 20 sekundach, wyłączając wiertło i połóż ręce po obu stronach koła jezdnego, aby zatrzymać jego dalsze obracanie się po początkowych 20 sekundach
      Uwaga: Sam rotator składa się z koła jezdnego gryzonia przymocowanego do wiertła (Rysunek 3A). Na środku koła jezdnego znajduje się mała komora z siatkową pokrywą, w której umieszcza się mysz (Rysunek 3B). Rotator obraca się w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara wokół osi pionowej. Wielkość bodźca jest zgodna z wcześniejszymi badaniami, które pokazują, że stymulacje obrotowe w zakresie od 0,2 do 3 Hz są wystarczające do wygenerowania odpowiedzi VOR i VCR^4,11,12.
   6. Umieść mysz w komorze na środku rotatora i załóż pokrywę.
   7. Włącz rotator na najniższym ustawieniu 3 Hz na 20 sekund. Uruchom rotor i rozpocznij nagrywanie wideo na kamerze w tym czasie w ramach przygotowań do nadchodzącej próby. Wyłącz wiertło po upływie 20 sekund i połóż ręce po obu stronach koła jezdnego, aby zapobiec jego obracaniu się. Natychmiast przetestuj ponownie mysz na rotarodzie, przenosząc ją tak szybko, jak to możliwe, na obracający się kołek.
   8. Zatrzymaj nagrywanie wideo w aparacie, gdy mysz spadnie z kołka i włóż mysz z powrotem do klatki.
4. Wyczyść przezroczyste plastikowe panele łagodną mieszanką detergentu i wody oraz cylindryczne kołki, pasy i metalowe platformy do lądowania rotarodu 70% etanolem, gdy wszystkie myszy zostały przetestowane.

3. Równoważnia z wyzwaniem przedsionkowym

1. Ustaw urządzenie równoważni, jak pokazano na rysunku 4A.
   Uwaga: Aparat równoważni został zaadaptowany z aparatu opisanego w Carter et al. (2001)¹³. W tym teście myszy przechodzą od dolnego końca belki, który znajduje się 52,5 cm nad ziemią, do zaciemnionej skrzynki bramkowej (13 x 22 cm, z drzwiami o wymiarach 5 x 6 cm) umieszczonej 60 cm nad ziemią (ryc. 4A). Myszy w naturalny sposób szukają ciemności i ochrony pola bramkowego na rzecz odsłoniętej belki, a następnie są zachęcane do pokonywania belki przez lekkie nachylenie, które wykorzystuje ich naturalny mechanizm ucieczki do biegania w górę¹⁴. Sama belka ma 1 m długości i okrągły przekrój o średnicy 14 mm. Można zastosować dostosowany zakres średnic wiązki, co pozwala eksperymentatorowi dostosować czułość testu lub dostosować się do większych obiektów. Na dolnym końcu równoważni biała linia wskazuje linię startu. Kolejna linia została narysowana w odległości 60 cm od linii startu na wyższym końcu belki, aby wskazać linię mety (rysunek 4A).
   1. Umieść 2 kamery, po jednej z każdej strony równoważni, na dolnym końcu równoważni (Rysunek 4B).
      Uwaga: Kamery te powinny być ustawione pod kątem, aby uchwycić całą długość równoważni i upewnić się, że linie początkowe i końcowe zaznaczone na równoważni są wyraźnie widoczne. Kamery te będą używane do nagrywania wideo zachowania myszy podczas przechodzenia przez równoważnię, a uzyskane filmy zostaną wykorzystane do późniejszej analizy.
   2. Wyłóż podłogę pudełka bramkowego ręcznikiem papierowym, aby umożliwić łatwe czyszczenie moczu i kału po przetestowaniu każdej myszy, a następnie umieść kopułę obudowy z klatki domowej obiektu wewnątrz pudełka bramkowego.
   3. Umieść odpowiednią piankę lub inny materiał amortyzujący pod podniesioną belką, aby chronić wszelkie przedmioty, które spadną z urządzenia. Myszy, które upadną, zostaną natychmiast podniesione przez eksperymentatora i umieszczone w polu bramkowym, aby odpoczęły.
2. Umieść jedną mysz w polu bramki na 2 minuty, aby zapoznała się z tym środowiskiem. Zakryj otwór do pola bramkowego ręką w rękawiczce na 5 sekund, jeśli mysz próbuje w tym czasie wejść na belkę, aby zniechęcić do takiego zachowania.
3. Trenuj mysz, umieszczając ją na belce tuż za otworem do pola bramkowego i pozwalając jej wejść do pola bramki. Kontynuuj trening myszy, umieszczając ją na belce stopniowo oddalając się od pola bramkowego, aż mysz będzie w stanie przejść od linii startu do pola bramki bez pomocy i minimalnego wahania. Pozostaw mysz na odpoczynek w polu bramkowym na 1 minutę po każdym biegu.
4. Rozpocznij testowanie myszy po zakończeniu trenowania.
   1. Rozpocznij nagrywanie wideo w kamerach.
   2. Umieść mysz na linii startu belki i poczekaj, aż przejdzie przez belkę w kierunku pola bramkowego.
   3. Zatrzymaj nagrywanie wideo w kamerach, gdy mysz dotrze do pola.
   4. Pozostaw mysz na 1 minutę w polu bramkowym. Usuń mocz lub kał, który mógł zostać zdeponowany podczas próby, podczas oczekiwania.
   5. Powtarzać kroki od 3.4.1 do 3.4.4, aż do zakończenia łącznie 5 prób.
5. Włącz specjalnie zbudowany rotator o częstotliwości 3 Hz na 20 sekund (jak w teście rotaru o stałej prędkości), aby myszy mogły zapoznać się z dźwiękiem. Zatrzymaj rotator po 20 sekundach, wyłączając wiertło i połóż ręce po obu stronach koła jezdnego, aby zatrzymać jego obracanie się.
6. Umieść mysz w komorze na środku rotatora i załóż pokrywę.
7. Włącz rotator na najniższym ustawieniu 3 Hz na 20 sekund. W tym czasie rozpocznij nagrywanie wideo na kamerach, w ramach przygotowań do nadchodzącej próby. Wyłącz wiertło po upływie 20 sekund i połóż ręce po obu stronach koła jezdnego, aby zapobiec jego dalszemu obracaniu się po początkowych 20 sekundach. Przenieś mysz na początek równoważni tak szybko, jak to możliwe i poczekaj, aż mysz przejdzie przez belkę do pola bramki.
8. Zatrzymaj nagrywanie wideo na kamerach, gdy mysz dotrze do pola bramki i wróć do klatki.
9. Wyczyść równoważnię 70% etanolem i zmień ręcznik papierowy w pudełku na bramkę po przetestowaniu każdej myszy.

Wyniki

Rotarod

Sprawność motoryczną myszy opisano jako czas upadku (Time To Fall, TTF) zarejestrowany dla każdej myszy w ciągu 8 prób. Na podstawie tych pomiarów TTF można wykreślić krzywe uczenia się dla każdej myszy. Rysunek 2 przedstawia przykłady sprawności motorycznej jednej miesięcznej myszy oraz jednej dziewięciomiesięcznej myszy w przebiegu 8 prób. Krzywe uczenia się te wykazują wzrost TTF podczas pierwszych 3–5 prób, po czym następuje plateau. Pomiary TTF zarejestrowane przed o...

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Wcześniejsze prace wykazały, że łatwo jest przetrenować myszy zarówno na rotarodzie, jak i na równoważni, a w konsekwencji uzyskanie dokładnych pomiarów może być wyzwaniem¹⁵. Na przykład przetrenowanie na rotarodzie może prowadzić do tego, że myszy celowo zeskakują z kołków zarówno w okresie aklimatyzacji, jak i próby, podczas gdy przetrenowanie na równoważni może prowadzić do częstszego zatrzymywania się (zachowanie eksploracyjne) i podróżowania w prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rotarod	IITC Nauki przyrodnicze Inc.	#755	"Kołki rozporowe" = średnica 70 mm. Nie pozwól, aby etanol stykał się z pleksiglasem.
iPhone	Apple		Może używać dowolnego typu aparatu. Rzep mocowany do tylnej powierzchni do mocowania do ramienia przegubowego 3D.
Ramię przegubowe 3D	Fisso/Baitella	Classic 3300-28	Każdy rodzaj stabilnego stojaka pionowego byłby wystarczający. Rzep jest przymocowany do wierzchołkowego końca ramienia w celu zamocowania iPhone'a.
Drewniana belka krocząca: pas gładkiego drewna o długości 1 m o okrągłym przekroju o średnicy			W celu dopasowania do parametrów eksperymentalnych można zastosować różne średnice i kształty przekrojów Drewniana skrzynka
na bramkę (130 x 140 x 220 mm) wykonana z desek
Stojak nośny wykonany z belek 41 x 41 mm: 2 belki pionowe w odległości 525 i 590 mm od podłoża odpowiednio na początku i na końcu bramki; Belka pozioma o długości 803 mm, która biegnie wzdłuż podłoża bezpośrednio pod belką prowadzącą; dwie belki o długości 20 mm działają jak "stopy", łącząc belki poziome i pionowe na każdym końcu; blok o wymiarach 21 x 21 x 36 mm ociosany na wierzchołkowym końcu "początkowej" belki pionowej; Otwór o wymiarach 13 x 13 mm wycięty jest w środku tego bloku, tworząc tunel biegnący prostopadle do belki kroczącej.			Usztywnij wszystkie połączenia za pomocą małych stalowych wsporników.
farba (na bazie wody)	Handycan	Akryl Matowy	2-3 warstwy na wszystkie drewniane powierzchnie aparatu równoważni
Wykończenie bezbarwne	Wattle Estapol	Poliuretan Matt	Pojedyncza warstwa na wszystkie belki. Podwójna warstwa na wszystkie inne powierzchnie aparatu równoważni
Pianka, materiał			Aby zamortyzować wszelkie upadki z równoważni
70% etanolu, ręczniki			Czysta belka i skrzynka bramkowa między każdym zwierzęciem.
Gaziki/ręczniki			Do wyłożenia podłogi w polu bramkowym
Domek dla myszy (z klatki domowej)

14 mm o grubości 11 mm opakowaniowy papierowe papierowe