Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja jadu i mikrodysekcji gruczołów jadowych od pająków do analiz proteomicznych i transkryptomicznych

DOI:

10.3791/51618

⸱

3 listopada 2014

1Department of Biological Sciences, University of Massachusetts Lowell

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł zawiera protokół ekstrakcji jadu z pająków za pomocą stymulacji elektrycznej w celu: 1) przeprowadzenia charakterystyki proteomicznej, 2) stymulowania ekspresji genów gruczołów jadowych oraz 3) przeprowadzenia badań funkcjonalnych jadów. Następnie opisano mikrodysekcje gruczołów jadowych do badań ekspresji genów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jady to chemicznie złożone wydzieliny, zazwyczaj zawierające liczne białka i peptydy o różnorodnych czynnościach fizjologicznych. Charakterystyka funkcjonalna białek jadowych ma ważne zastosowania biomedyczne, w tym identyfikację przewodów lub sond dla receptorów komórkowych. Pająki są najbogatszym gatunkowo kladem jadowitych organizmów, ale jady tylko kilku gatunków są dobrze poznane, częściowo ze względu na trudności związane z zbieraniem niewielkich ilości jadu od małych zwierząt. W pracy przedstawiono protokół pobierania jadu od pająków za pomocą stymulacji elektrycznej, demonstrując procedurę na czarnej wdowie zachodniej (Latrodectus hesperus). Pobrany jad jest przydatny do różnych dalszych analiz, w tym bezpośredniej identyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas, testów funkcjonalnych i stymulacji ekspresji genów jadu w badaniach transkryptomicznych. Technika ta ma przewagę nad protokołami, które izolują jad z homogenatów całych gruczołów, które nie oddzielają prawdziwych składników jadu od białek komórkowych, które nie są wydzielane jako część jadu. Reprezentatywne wyniki wskazują na wykrycie znanych peptydów jadowych w pobranej próbce za pomocą spektrometrii mas. Po procedurze pobierania jadu stosuje się protokół preparacji gruczołów jadu pająka, którego wyniki pokazują, że prowadzi to do scharakteryzowania białek i peptydów wyrażanych przez jad na poziomie sekwencji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jady to wydzieliny zwierzęce, głównie wstrzykiwane innemu zwierzęciu w celu drapieżnictwa lub obrony, a także mają ważne zastosowania biologiczne o znaczeniu biomedycznym1–3. Tylko niektóre zwierzęta syntetyzują jad, ale jego produkcja jest taksonomicznie szeroko rozpowszechniona wśród bezkręgowców (np. parzydełkowatych, ślimaków stożkowych, skorpionów i pająków) i kręgowców (np. węży, niektórych ryb i ssaków), ponieważ niezależnie ewoluował wielokrotnie1,4. Charakterystyka biochemiczna jadów zazwyczaj pokazuje, że składają się one z szerokiej gamy białek i peptydów, które w dużej mierze działają na układ krążenia i nerwowy wstrzykiwanych zwierząt, szybko dostarczając toksyny składowe1. Niewielka część jadowitych zwierząt może stanowić zagrożenie dla ludzi, zwłaszcza gatunków o występowaniu synantropijnym5. Badania nad składem jadu i czynnościami funkcjonalnymi odegrały ważną rolę w funkcjonalnej charakterystyce składników komórkowych kręgowców (w szczególności neuronalnych kanałów jonowych)6 oraz w wyjaśnieniu podstawowych procesów komórkowych (np. neurowydzielania)7. Co więcej, wybrane peptydy jadowe mają użyteczne właściwości w kontekście biomedycznym, w tym ich zastosowanie w leczeniu raka i bólu8,9, i są wydobywane w celu uzyskania potencjalnych leków i rozwoju antyjadu. Jady odgrywają również znaczącą rolę w badaniach ekologicznych i ewolucyjnych1,4,10,11, dlatego zbieranie tych niebezpiecznych wydzielin ma wiele zastosowań.

Istnieje >40 000 opisanych gatunków pająków (rząd Araneae), a wszystkie z ponad 100 rodzin pająków oprócz jednego posiadają sparowane gruczoły jadowe, które kończą się kłami>12. Duża różnorodność gatunkowa pająków sugeruje, że reprezentują one największy klad organizmów jadowitych. Jednak charakterystyka biochemiczna jadów pająków w dużej mierze skoncentrowała się na niewielkiej liczbie gatunków najczęściej związanych z jadem człowieka. Ostatnie badania proteomiczne i transkryptomiczne jadów pająków wskazują, że zazwyczaj zawierają one wiele unikalnych białek i peptydów2,13,14. Postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu cDNA i odciskach peptydowych spektrometrii mas znacznie ułatwiły odkrycie tych białek jadu15. Niemniej jednak taka praca zaczyna się od zebrania wystarczającej ilości jadu i/lub gruczołów jadowych od pająków, a szczegółowa dokumentacja dla takich technik jestnieliczna16.

Ten artykuł przedstawia protokół pobierania jadu i gruczołów jadowych od pająków czarnej wdowy, który może być zastosowany do pająków o podobnej wielkości. Gromadzenie jadu oddzielnie od gruczołów umożliwia identyfikację białek, które są wydzielane do jadu, w przeciwieństwie do białek pełniących inne funkcje komórkowe. Czarne wdowy i inne gatunki Latrodectus są powszechnie uznawane za jedne z najbardziej niebezpiecznych pająków ze względu na ich wysoce neurotoksyczny jad, który powoduje silny ból u ludzi, któremu czasami towarzyszy obfite pocenie się, skurcze mięśni, nadciśnienie, trudności w oddychaniu i niejednolity paraliż5. Przedstawiony tutaj protokół zbierania jadu wykorzystuje elektrostymulację do dostarczania prądu elektrycznego do znieczulonych pająków w celu wywołania skurczów mięśni i uwolnienia jadu. Kropelki jadu są szybko zbierane za pomocą mikrokapilar i dozowane do probówek do przechowywania w zamrażarce. Ponieważ protokół obejmuje niebezpieczne procedury, powinien być wykonywany wyłącznie przez dobrze przeszkolone osoby i zaleca się ostrożność przy kluczowych krokach. Pobrany jad ma wiele zastosowań, takich jak charakterystyka i izolacja cząsteczek składowych2, do eksperymentów fizjologicznych lub testów funkcjonalnych18 oraz do stymulowania ekspresji genów jadu11. Protokół kończy się opisem sekcji i konserwacji gruczołów jadowych przydatnych do klonowania genów specyficznych dla jadu, których ekspresja zachodzi 2-3 dni po wyczerpaniu jadu u różnych pająków10,11.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie aparatu do elektrostymulatora

  1. Podłącz przewód zasilający elektrostymulatora do gniazdka i podłącz zewnętrzny pedał nożny do zewnętrznego wejścia sygnałowego.
    Uwaga: Przewody elektryczne muszą być odpowiednio izolowane, a odsłonięty metal dostarczający prąd nie powinien być dotykany. Dla ochrony nosić rękawice lateksowe lub nitrylowe. Włącznik zasilania elektrostymulatora powinien znajdować się w pozycji OFF podczas podłączania przewodu zasilającego i podłączania przewodów.
  2. Podłącz elektrodę dodatnią do czerwonego zacisku wyjściowego na elektrostymulatorze (gdy przełącznik polaryzacji jest w trybie normalnym) i podłącz elektrodę ujemną do czarnego zacisku wyjściowego. Uwaga: Każdy drut elektrody powinien być zakończony zaciskiem krokodylkowym.
  3. Ustaw stymulator na następujące zalecane ustawienia początkowe: napięcie=7 V, częstotliwość=1 impulsy na sekundę, opóźnienie=0 milisekund, czas trwania=200 milisekund, przełącznik dwóch impulsów=regularny, i przełącznik trybu=wyłączony.
  4. Przetestuj wyjście elektrod, podłączając zaciski krokodylkowe do dodatnich i ujemnych przewodów pomiarowych woltomierza. Włącz wyłącznik zasilania stymulatora i dostarczaj prąd za pomocą pedału nożnego.

2. Przygotowanie kleszczy unieruchamiających i innych materiałów

  1. Zanurz jeden ząb lekkich jak piórko kleszczy w płynnej powłoce z tworzywa sztucznego i odczekaj cztery godziny, aż powłoka wyschnie. Szczelnie owinąć 15 mm końcówki przeciwległego bolca pojedynczą warstwą bawełnianej nici do szycia i zabezpieczyć nić, wiążąc koniec w węzeł.
    Uwaga: Nić służy do absorpcji zastosowanego roztworu soli fizjologicznej, który wspomaga przewodność elektryczną, podczas gdy powłoka z tworzywa sztucznego zapewnia izolację przed opóźnieniem prądu.
  2. Odetnij końcówkę igły podskórnej ostrymi nożyczkami i wygładź otwór papierem ściernym. Przymocować igłę do syfonu próżniowego (np. kolby z filtrem próżniowym) za pomocą rurki.
    Uwaga: Igła będzie odsysać wodę i zwracanie i posłuży do uzupełnienia obwodu utworzonego przez elektrody stymulatora. Otwór igły musi być wystarczająco mały, aby nie zaszkodzić pająkowi, ale wystarczająco duży, aby odkurzyć roztwór bez zatykania (np. 25 G x 1 1/2 cala, patrz Lista materiałów).
  3. Umieść szczypce piórkowe poziomo w szczelnie zamkniętej pozycji za pomocą pokrytego winylem dwuzębnego zacisku przymocowanego do podstawy magnetycznej lub stałego aparatu stojącego pod mikroskopem preparacyjnym view, z pokrytym tworzywem sztucznym bolcem kleszczy na górze i bolcem pokrytym gwintem na dole.
    Uwaga: Dwubolcowy zacisk jest utrzymywany w pozycji nieruchomej do podstawy magnetycznej za pomocą clamp uchwyt (patrz Lista materiałów). Gumka może być szczelnie przymocowana wokół zębów kleszczy do wagi piórkowej, obok uchwytu zacisku, aby dodać dodatkowy nacisk, aby utrzymać kleszcze piórkowe w zamkniętej pozycji wokół pająka po wprowadzeniu.
  4. Przymocuj zacisk krokodylkowy z elektrodą dodatnią do dolnego bolca kleszczy przed gwintem i przymocuj ujemny zacisk krokodylkowy do metalowej igły próżniowej.
  5. Przetestuj prąd obwodu za pomocą woltomierza, umieszczając dodatni przewód na bolcu kleszczy między gwintem a zaciskiem krokodylkowym i umieszczając ujemny przewód na igle próżniowej. Naciśnij pedał nożny, aby upewnić się, że wykryty jest wystarczający prąd i odłącz przewody, jeśli zostanie wykryty wystarczający prąd.
  6. Przygotuj kilka probówek mikrokapilarnych do pobrania jadu. Przytrzymaj pojedynczą rurkę mikrokapilarną na jednym końcu ręką w rękawiczce, a na drugim końcu sterylnymi metalowymi kleszczami, umieszczając końcówkę trzymaną w kleszczach poziomo nad płomieniem palnika Bunsena. Pociągnij mikrokapilę metalowymi kleszczami z dala od płomienia, aby utworzyć wydłużoną końcówkę, trzymając drugi koniec w pozycji nieruchomej.
    Uwaga: nosić okulary ochronne, ponieważ mikronaczynia włosowate mogą łatwo pękać.
  7. Przygotowane mikrokapilary odpocznij na pasku szpachlówki montażowej na szalce Petriego. Zbadaj końce mikrokapilar pod mikroskopem preparacyjnym i utwórz mały, skośny otwór na wyciągniętym końcu za pomocą wysterylizowanych metalowych kleszczyków.
  8. Oznacz zmienną liczbę sterylnych probówek 0,5 ml. Dodaj sterylną, dejonizowaną wodę do sterylnych probówek (np. 5 μl autoklawowanej wody dejonizowanej). Zamknij probówki i umieść je na lodzie.
  9. Przygotować roztwór soli fizjologicznej w zlewce i napełnić drugą zlewkę wodą z autoklawizu.

3. Unieruchomienie pająka w kleszczach

  1. Włączyć zbiornik CO2 i przenieść pająka z zamkniętej plastikowej fiolki zbiorczej (patrz Lista materiałów) do komory CO2 za pomocą długich metalowych kleszczy.
    Uwaga: pająki czarnej wdowy mają niebezpieczny jad; Podczas tego protokołu zawsze noś rękawiczki.
  2. Trzymaj pająka w komorze przez 5-10 minut lub do momentu znieczulenia i nie poruszaj się już po delikatnym szturchnięciu długimi kleszczami. Użyć pipety do przenoszenia mokrej nici na kleszczach z roztworem soli fizjologicznej.
    Uwaga: Wytyczne dotyczące parametrów znieczulenia CO2 dla czarnych wdów znajdują się w Spagna i Moore19.
  3. Odzyskaj znieczulonego pająka z komory CO2, podnosząc go za przednie nogi za pomocą kleszczy preparacyjnych i rąk w rękawiczkach. Przenieś znieczulonego pająka do aparatu kleszczowego do wagi piórkowej. Oddziel zęby zamkniętych kleszczy do wagi piórkowej i umieść głowotułów pająka między zębami i pozwól, aby zęby się zamknęły, aby upewnić się, że pająk jest mocno trzymany na miejscu, ale nie jest miażdżony. Upewnij się, że pająk jest umieszczony grzbietową stroną pancerza w dół (patrz Foelix20, aby zapoznać się z anatomią pająka), spoczywając na bolcu pokrytym gwintem, a brzuszna strona pancerza jest skierowana w stronę plastikowej powłoki, podczas gdy elektroda dodatnia pozostaje przymocowana do dolnego bolca. Pracuj szybko podczas obsługi pająka.
  4. Dostosuj powiększenie, ostrość i źródło światła mikroskopu preparacyjnego, aż chelicerae i kły pająka będą wyraźnie widoczne.

4. Kolekcja Venom

  1. Włącz próżnię i spryskaj pająka roztworem wodnym za pomocą drugiej igły strzykawkowej z końcówką. Odessać wodę za pomocą igły próżniowej, aby usunąć zanieczyszczenia.
  2. Dotknij igły próżniowej z dołączoną elektrodą ujemną do mównicy pająka i dostarcz impuls za pomocą pedału nożnego jeden lub więcej razy. W razie potrzeby odkurzyć, zwrócić zwracanie.
    Uwaga: mównica pająka znajduje się w jamie ustnej za chelicerae na powierzchni grzbietowej między chelicerae a endites (patrz Foelix20 w celu uzyskania szczegółowej anatomii pająka). Uwaga: Z każdym impulsem nogi pająka kurczą się, a jad będzie widoczny jako przezroczyste kropelki wyłaniające się z kłów.
  3. Zebrać kropelki jadu za pomocą końcówki mikrokapilarnej i przenieść końcówkę kapilarną do 0,5 ml probówki z wodą lub roztworem buforowym (roztwór zostanie zassany do kapilary).
    Uwaga: unikać nakłuwania pająka naczyniami włosowatymi, które mogą prowadzić do zanieczyszczenia hemolimfą i śmierci. Unikaj również zanieczyszczenia kapilar jedwabiem i klejem z dysz przędzalniczych.
  4. Przymocować strzykawkę do przenoszenia z adapterem probówki do mikrokapilary (na końcu przeciwległym do końcówki zbiorczej) i dozować roztwór jadu z powrotem do probówki. Połóż rurkę na lodzie.
    Uwaga: Kapilary na odpady należy wyrzucić do pobliskiego pojemnika na ostre przedmioty.
  5. Umieść otwartą plastikową fiolkę zbiorczą wraz z nakrętką w pobliżu pająka. Ostrożnie chwyć nogi pająka kleszczami preparacyjnymi trzymanymi w jednej ręce, a drugą ręką ostrożnie otwórz zęby kleszczy do wagi piórkowej, wsuwając pająka do fiolki zbiorczej za pomocą kleszczy i szybko zamknij nakrętkę. Kontynuuj z następnym pająkiem i po zakończeniu przechowuj probówki zawierające jad w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
    Uwaga: należy zachować ostrożność podczas przenoszenia pająka z kleszczy z powrotem do fiolki. Upewnij się, że fiolka i nakrętka znajdują się w pobliżu pająka, aby umożliwić ich szybkie przeniesienie i załóż rękawice.

5. Rozwarstwienie gruczołów jadowych

  1. Dwa do trzech dni po pobraniu jadu znieczulić pająka w komorze CO2 (patrz krok 3.1). Napełnij nośnik ciekłym azotem i umieść obok mikroskopu preparacyjnego.
    Uwaga: podczas pracy z ciekłym azotem należy używać ochrony oczu i rękawic kriogenicznych.
  2. Oczyść obszar sekcji i kleszcze preparacyjne roztworem, który eliminuje zanieczyszczenie RNazą i DNA. Napełnij małą szalkę Petriego umieszczoną pod mikroskopem preparacyjnym buforem preparacyjnym (np. 1x bufor z solą fizjologiczną i cytrynianem sodu (SSC)).
  3. Przenieś pająka z komory CO2 na szalkę Petriego i użyj kleszczy, aby szybko oddzielić głowotułów od brzucha.
  4. Przytrzymaj głowotułów pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy i ustaw chelicerae w polu widzenia. Użyj ostrych końców drugiej pary kleszczy, aby przeciąć naskórek łączący pancerz z bocznymi aspektami chelicerae. Chwyć bocznie chelicerae za pomocą drugiej pary kleszczy i delikatnie szarp w przód iw tył, aż gruczoły jadowe zostaną wyciągnięte.
  5. Oddzielić gruczoły od chelicerae (lub pozostawić przymocowane do chelicerae, jeśli jest to pożądane) i przenieść do probówki cyrosafe 0,5 ml. Umieść zamkniętą rurkę w ciekłym azocie.
    Uwaga: każda sekcja nie powinna trwać dłużej niż 15 minut.
  6. Powtórz sekcję z dodatkowymi pająkami, aż do zakończenia. Przenieść probówki z ciekłym azotem do zamrażarki o temperaturze -80 °C.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozyskiwanie jadu oraz sekcje gruczołów jadowych są często przeprowadzane w celu charakterystyki białek i peptydów jadu na poziomie sekwencji10,11,15. Zebrany jad może być również wykorzystywany w badaniach fizjologicznych do określenia jego aktywności funkcjonalnej18. Pozyskiwanie jadu stymuluje ekspresję genów w gruczołach jadowych, co ułatwia klonowanie specyficznych transkryptów toksyn za pomocą RT-PCR10,11. Identyfikację białek jadu można również przeprowadzić w sposób wysokoprzepustowy, integrując standardowe techniki spektrometrii mas z bazami danych sekwencji wygenerowanymi z bibliotek cDNA gruczołów jadowych15,21. Przykład takich prac, rozpoczynających się od jadu i gruczołów pobranych zgodnie z powyższym protokołem i wykazujących jego skuteczność, przedstawiono na Rysunku 1.

Jad pobrany od dorosłych samic L. hesperus poddano trawieniu trypsyną, a następnie analizie MuDPIT w roztworze, która łączy HPLC (wysokosprawną chromatografię cieczową) z tandemową spektrometrią mas (MS/MS). W tym przypadku analiza MuDPIT została przeprowadzona przez University of Arizona Proteomics Consortium. Masy wykrytych peptydów oraz ich dysocjowanych fragmentów (jonów potomnych, wywnioskowanych ze widm) porównano z sekwencjami peptydowymi teoretycznie przewidzianymi na podstawie translacji sekwencji cDNA uzyskanych z biblioteki ekspresji genów skonstruowanej z gruczołów jadowych L. hesperus (gruczoły pozyskano zgodnie z opisanym powyżej protokołem sekcji)21. W tym eksperymencie, przy progu prawdopodobieństwa 99,9%, ze wszystkich zebranych widm wykryto 36 białek, z których każde zawierało co najmniej jeden wykryty peptyd. Jedno z wykrytych białek jest potwierdzone łącznie przez 43 widma (przykładowe widma przedstawiono na Rysunku 1A), co odpowiada trzem unikalnym peptydom pokrywającym 35% sekwencji białka (Rysunek 1B). Wykryte białko (przetłumaczone z pobranego cDNA) wykazało najwyższą zgodność w BLASTp z latrodaktyną z L. tredecimguttatus (numer dostępu GenBank P49125.1), z e-score wynoszącym 2e-46 i 80% tożsamości na poziomie sekwencji aminokwasowej z białkiem wykrytym w tym eksperymencie. Latrodaktyna, znana również jako białko o niskiej masie cząsteczkowej alfa-latrotoksyny, jest uznanym składnikiem jadu pająków z rodzaju czarne wdowy22,23, co potwierdza skuteczność przedstawionego protokołu. Niektóre białka zidentyfikowane w jadzie odpowiadają sekwencjom, dla których nie znaleziono dopasowania w BLAST. Nie jest jasne, czy taki wynik wynika z ograniczonych zasobów genomicznych dostępnych dla pająków oraz ograniczonej wiedzy funkcjonalnej o ich białkach, czy też nieznane białko stanowi zanieczyszczenie jadu. Niemniej jednak analizy ekspresji genów lub białek badające obfitość takiego nowego białka w gruczołach jadowych w stosunku do innych tkanek powinny wykazać, czy jest ono rzeczywistym składnikiem jadu.

Analiza fragmentów peptydów metodą spektrometrii mas; widmo m/z; identyfikacja sekwencji peptydowej.
Rycina 1: Peptyd latrodaktyny zidentyfikowany w jadzie wdowy czarnej przy użyciu spektrometrii mas. (A) Reprezentatywne widma (jedno z 43) wykryte w części MS/MS analizy MuDPIT jadu L. hesperus, które przypisano do przewidywanej translacji zebranej sekwencji cDNA przedstawionej w części B. Widma przedstawiają stosunek masy do ładunku (m/z) wykrytych jonów potomnych na osi poziomej, powstałych w wyniku fragmentacji peptydy rodzica (CGEEDFGEEIVK), przy czym litery na górze wskazują sekwencję peptydową na podstawie mas jonów potomnych. (B) Sekwencja białka, do której przypisano widma w części A; czerwony, pogrubiony i podkreślony tekst wskazuje odpowiadającą sekwencję z widm przedstawionych w części A, a dodatkowy czerwony tekst (niepogrubiony) reprezentuje inny peptyd w tym białku wykryty w innych zebranych widmach. Sekwencja białka jest wynikiem translacji sekwencji cDNA uzyskanej z wypreparowanych gruczołów jadowych.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jady stanowią ważne źródło fizjologicznie reaktywnych białek, peptydów i innych cząsteczek, które znajdują zastosowanie w odkrywaniu leków, a także w podstawowych aspektach badań komórkowych i ekologicznych1–3. Jednak zbieranie jadu, szczególnie od niebezpiecznych lub małych zwierząt, jest trudnym zadaniem. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób jad i gruczoły jadowe mogą być pobierane od pająków czarnej wdowy i potwierdza sukces tego podejścia poprzez połączenie analizy MuDPIT jadu i bazy danych białek pochodzących z cDNA sklonowanych z gruczołów jadowych21. Podczas gdy ten protokół działa dobrze w przypadku czarnych wdów i średniej wielkości pająków, inne techniki zbierania jadu zostały zastosowane w przypadku większych pająków mygalomorficznych (podobnych do tarantuli), takich jak bezpośrednie aspiracja jadu z kłów do szklanych pipet, np. 24. To ostatnie podejście nie sprawdzi się jednak w przypadku mniejszych pająków, które nie są agresywne.

Jednym ze szczególnie krytycznych aspektów opisanego tutaj protokołu pobierania jadu są początkowe fazy przygotowania i optymalizacji procesu pobierania, tak aby stał się on bardziej rutynowy, spójny i szybszy. Protokół jest początkowo trudny do opanowania, ale dzięki wielokrotnym próbom staje się łatwiejszy i szybszy. Zaleca się również ostrożność we wszystkich krytycznych fazach związanych z obchodzeniem się z niebezpiecznymi pająkami, użyciem prądu elektrycznego, mikrokapilar z cienkiego szkła i igieł strzykawkowych. Podczas kształtowania mikronaczynek ważne jest noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i zamknięte buty, a także okulary.

Innym wyzwaniem związanym z zbieraniem jadu jest niewielka ilość jadu wytwarzana przez jednego pająka, w szczególności gatunek Latrodectus, z którego zebrane ilości mogą być w najlepszym razie ograniczone do 1-2 mikrolitrów na osobnika. Uzyskanie wystarczającej ilości jadu do dalszych zastosowań, takich jak żele białkowe lub testy funkcjonalne, może wymagać połączenia jadu od wielu osób w jednej probówce. W takich przypadkach jad powinien być łączony tylko od osobników tej samej płci, w tym samym stadium ontogenetycznym i populacji, biorąc pod uwagę rozpoznanie zmienności interseksualnej, rozwojowej i geograficznej w niektórych jadach 25,26. Pająki mogą również wykazywać znaczne różnice w ilości jadu wytwarzanego wśród osobników, przy czym mniejsze ilości mogą odzwierciedlać niedawne wyczerpanie gruczołu. Dlatego może być wskazane zebranie jadu kilka dni po ich ostatnim karmieniu. Jeśli uwolni się niewielka ilość jadu, nie należy przykładać nadmiernego prądu do pająka, co może spowodować pęknięcie naskórka, co prowadzi do zanieczyszczenia jadu hemolimfą lub śmierci.

Należy również unikać zanieczyszczenia próbek jadu pajęczą nicią lub źródłami ludzkimi poprzez stosowanie sterylnego lub czystego sprzętu. Pomimo tych wyzwań, zbieranie czystego jadu, pozostawiając pająka przy życiu, jest lepsze niż metody polegające na pozyskiwaniu jadu z homogenatów gruczołów (które nie oddzielają składników jadu od innych białek komórkowych) i zabijaniu pająka. Bardzo ważne jest również zapewnienie szybkiego zamrażania próbek, aby zapobiec degradacji białek.

Ekstrakcja jadu sprzyja późniejszej produkcji jadu, stymulując w ten sposób ekspresję genu jadu w gruczole jadowym. Tak więc, ponieważ protokół ten pozwala pająkom przetrwać wyczerpanie jadu, ich gruczoły mogą zostać wypreparowane kilka dni później (zabijając pająka) w punkcie, w którym oczekuje się, że ekspresja genu jadu będzie wystarczająca do badań genetycznych, takich jak klonowanie transkryptu10,11. W przypadku rozwarstwiania gruczołów jadowych należy również podjąć kilka ważnych środków ostrożności. Należy położyć nacisk na stosowanie sprzętu laboratoryjnego i odczynników, które są wolne od RNaz rozkładających RNA. Dlatego zaleca się przecieranie kleszczyków i innego jednorazowego sprzętu i powierzchni roztworami eliminującymi zanieczyszczenie RNazą i DNA. Sekcje powinny być wykonane tak szybko, jak to możliwe i bezpośrednio zamrożone, aby jeszcze bardziej zapewnić integralność RNA tkanki. Wreszcie, sekcje powinny być wykonywane tylko na znieczulonych pająkach, po szybkim oddzieleniu ich głowotułowia i brzucha.

Podsumowując, ten artykuł zawiera zweryfikowany protokół pozyskiwania jadu pająka i gruczołów jadowych. Jad i gruczoły jadowe pozwalają na izolację i charakterystykę ich składników białkowych i peptydowych przy użyciu podejść proteomicznych i transkryptomicznych. Ponadto próbki jadu mogą stanowić punkt wyjścia do testów funkcjonalnych, które określają potencjał biomedyczny i farmakologiczny ich cząsteczek składowych. Prawie wszystkie pająki wytwarzają jad, a duża różnorodność składników jadu syntetyzowanych przez poszczególne gatunki sugeruje, że ogromna różnorodność cząsteczek jadu nie została jeszczeodkryta13. W związku z tym protokół ten dostarcza narzędzi do badania bogatego źródła biologicznie aktywnych cząsteczek obecnych w jadach pająków.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do ujawnienia i nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję następującym osobom za pomoc w rozwoju tego protokołu: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier i Mays Imad. Dane ze spektrometrii mas i proteomiki zostały pozyskane przez Arizona Proteomics Consortium przy wsparciu grantu NIEHS ES06694 dla SWEHSC, grantu NIH/NCI CA023074 dla AZCC oraz przez Instytut BIO5 Uniwersytetu Arizony. Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez National Institutes of Health (National Institute of General Medicine) z grantów 1F32GM83661-01 i 1R15GM097714-01 dla Jessiki E. Garb.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stymulator nerwów i mięśni (elektrostymulator) Trawiastywoltomierz SD9http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html
RadioShack22-223można zastąpić dowolnym ogólnym woltomierzem/multimetrem
Spiczaste kleszcze piórkoweBioquip4748
Plasti DipPerformixDostępne w Ace Hardware
25 G x 1½ w Precision Glide igła do strzykawki podskórnejBD Medical305127
Termos z filtrem próżniowym 1 LNalgeneDS4101-1000mniejsze rozmiary kolb mogą również działać
Lejek dwuczęściowy Buchner, 90 mmNalgene4280-0900
5 μ l Otwory kapilarne (mikrokapilary)VWR53508-375
Montażowa listwa szpachlowa Loctitedostępny w Ace Hardware
Fisherbrand Bardzo długie kleszcze ogólnego przeznaczenia Długość: 11-13/16 cala.Bufor SSC Fisher10-316C
, 20x (pH 7,0), klasy molekularnejPromegaV4261może być wytwarzany z podstawowych chemikaliów (150 mM NaCl, 15 mM cytrynian sodu)
Probówki Eppendorf safe-lock 0,5 ml (bezpieczne kriogenicznie)Eppendorf22363611
Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Kolba stołowa z ciekłym azotemThermo Scientific4150-1000
Rnase AwayVWR53225-514
Pęseta Ultra Fine (kleszcze preparacyjne)Podobne wysokiej jakości kleszczyki punktoweEMS78310-0
przełącznikiem nożnym/pedałemLinemaster Switch Corp.491-S
Dwuzębny zacisk przedłużający, z tulejami pokrytymi winylem, 8,5 calaVWR21570-007podobne modele można zastąpić
Uchwyt zaciskowyVWR89084-746podobne modele można zastąpić, muszą pasować do średnicy pręta zaciskowego przedłużającego
Podstawa magnetyczna (utrzymuje zacisk przedłużający za pomocą uchwytu zaciskowego)VWR300042-270podobny aparat, który jest w stanie bezpiecznie utrzymać zacisk przedłużający w ustalonej pozycji, może zostać zastąpiony
Plastikowe fiolki do zbierania (duże/40 dram)Bioquip8940
Bawełniana nić do szyciaJoann tkanina i sklep z rękodziełem7245855podobny produkt można zastąpić
można zastąpić

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fry, B. G., et al. The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms. Annu. Rev. Genom. Hum. G. 10, 483-511 (2009).
  2. Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 43 (3), 279-295 (2008).
  3. Twede, V. D., Miljanich, G., Olivera, B. M., Bulaj, G. Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads. Curr. Opin. Drug Disc. 12 (2), 231-239 (2009).
  4. Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms. Trends Ecol. Evol. 28 (4), 219-229 (2013).
  5. Vetter, R. S., Isbister, G. K. Medical aspects of spider bites. Annu. Rev. Entomol. 53, 409-429 (2008).
  6. Adams, M. E., Myers, R. A., Imperial, J. S., Olivera, B. M. Toxityping rat brain calcium channels with omega-toxins from spider and cone snail venoms. Biochemistry. 32 (47), 12566-12570 (1993).
  7. Silva, J. -P., et al. Latrophilin 1 and its endogenous ligand Lasso/Teneurin-2 form a high-affinity transsynaptic receptor pair with signaling capabilities. PNAS. 108 (29), 12113-12118 (2011).
  8. Williams, J. A., Day, M., Heavner, J. E. Ziconotide: an update and review. Expert Opin. Pharmacother. 9 (9), 1575-1583 (2008).
  9. Veiseh, M., et al. Tumor paint: a chlorotoxin:Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res. 67 (14), 6882-6888 (2007).
  10. Binford, G. J., et al. Molecular evolution, functional variation, and proposed nomenclature of the gene family that includes sphingomyelinase D in sicariid spider venoms. Mol. Biol. Evol. 26 (3), 547-566 (2009).
  11. Garb, J. E., Hayashi, C. Y. Molecular evolution of α-latrotoxin, the exceptionally potent vertebrate neurotoxin in black widow spider venom. Mol. Biol. Evol. 30 (5), 999-1014 (2013).
  12. Platnick, N. I. The World Spider Catalog., Version 14.0., DOI: 10.5531/db.iz.0001. , Available online at: http://research.amnh.org/entomology/spiders/catalog/index.html (2013).
  13. Sollod, B. L., Wilson, D., Zhaxybayeva, O., Gogarten, J. P., Drinkwater, R., King, G. F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries. Peptides. 26 (1), 131-139 (2005).
  14. King, G. F., Hardy, M. C. Spider-venom peptides: Structure, pharmacology, and potential for control of insect pests. Annu. Rev. Entomol. 58 (1), 475-496 (2013).
  15. Escoubas, P., Sollod, B., King, G. F. Venom landscapes: Mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach. Toxicon. 47 (6), 650-663 (2006).
  16. Kristensen, C. Comments on the natural expression and artificial extraction of venom gland components from spiders. Toxin Rev. 24 (3-4), 257-270 (2005).
  17. Ushkaryov, Y. A., Volynski, K. E., Ashton, A. C. The multiple actions of black widow spider toxins and their selective use in neurosecretion studies. Toxicon. 43 (5), 527-542 (2004).
  18. Graudins, A., et al. Cloning and activity of a novel α-latrotoxin from red-back spider venom. Biochem. Pharmacol. 83 (1), 170-183 (2012).
  19. Spagna, J. C., Moore, A. M. F. Safe immobilization by CO2 of Latrodectus hesperus (Arachnida: Theridiidae). Pan-Pac. Entomo. l. 74 (4), 210-213 (1998).
  20. Foelix, R. Biology of Spiders. , Oxford University Press. (2010).
  21. Haney, R. A., Ayoub, N. A., Clarke, T. H., Hayashi, C. Y., Garb, J. E. Dramatic expansion of the black widow toxin arsenal uncovered by multi-tissue transcriptomics and venom proteomics. BMC Genomics. 15, 366(2014).
  22. Pescatori, M., Bradbury, A., Bouet, F., Gargano, N., Mastrogiacomo, A., Grasso, A. The cloning of a cDNA encoding a protein (latrodectin) which co-purifies with the α-latrotoxin from the black widow spider Latrodectus tredecimguttatus (Theridiidae). Eur. J. Biochem. 230 (1), 322-328 (1995).
  23. Grasso, A., Pescatori, M. Structural and functional studies of latrodectin from the venom of black widow spider (Latrodectus tredecimguttatus). Adv. Exp. Med. Biol. 391, 237-243 (1996).
  24. Szeto, T. H., et al. Isolation of a funnel-web spider polypeptide with homology to mamba intestinal toxin 1 and the embryonic head inducer Dickkopf-1. Toxicon. 38, 429-442 (2000).
  25. Binford, G. J. An analysis of geographic and intersexual chemical variation in venoms of the spider Tegenaria agrestis (Agelenidae). Toxicon. 39, 955-968 (2001).
  26. Alape-Girón, A., et al. Snake venomics of the lancehead pitviper Bothrops asper: geographic, individual, and ontogenetic variations. J. Proteome. Res. 7 (8), 3556-3571 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja jadu paj kastymulacja elektrycznasekcja gruczo w jadowychanaliza spektrometri masbadania proteomiczne i transkrypcyjneczarna wdowa zachodniapobieranie mikrokapilarneznieczulenie CO2p sety precyzyjneprzechowywanie w ciek ym azocie

Powiązane artykuły