Izolacja cholangiocytów zewnątrzwątrobowych noworodków

Podsumowanie

Opisano technikę izolowania cholangiocytów z pozawątrobowych dróg żółciowych u noworodków myszy. Kanaliki są skrupulatnie preparowane, a następnie komórki są izolowane przez wyrost w gęstych żelach kolagenowych. Metoda ta stanowi przydatne narzędzie do badania rozwoju i patologii pozawątrobowych dróg żółciowych.

Streszczenie

Wewnątrz- i zewnątrzwątrobowe drogi żółciowe wątroby są rozwojowo odrębne i mogą być różnie dotknięte przez niektóre choroby. Jednak różnice między cholangiocytami wewnątrz- i zewnątrzwątrobowymi oraz między komórkami noworodków i dorosłych nie są dobrze poznane.

Metody izolacji cholangiocytów z wewnątrzwątrobowych dróg żółciowych są dobrze znane^1-4. Izolacja pozawątrobowych komórek przewodowych, zwłaszcza od noworodka, nie została jeszcze opisana, chociaż byłoby to bardzo korzystne dla zrozumienia różnic między różnymi populacjami cholangiocytów i w badaniu chorób, takich jak atrezja dróg żółciowych, które wydają się celować w przewody pozawątrobowe. Opisano tutaj zoptymalizowaną technikę izolowania pozawątrobowych komórek dróg żółciowych zarówno noworodków, jak i dorosłych myszy. Technika ta pozwala uzyskać czystą populację komórek z minimalnym zanieczyszczeniem komórkami mezenchymalnymi, takimi jak fibroblasty.

Ta metoda opiera się na usunięciu przewodów pozawątrobowych i pęcherzyka żółciowego, a następnie na skrupulatnym rozbieraniu i skrobaniu w celu usunięcia warstw tłuszczu i fibroblastów. Struktury są osadzane w grubych warstwach kolagenu i hodowane przez około 3 tygodnie, aby umożliwić wzrost cholangiocytów w monowarstwach, które następnie można trypsynizować i ponownie posiać do użytku eksperymentalnego.

Wprowadzenie

Pochodzenie i rozwój wewnątrz- i zewnątrzwątrobowych cholangiocytów są wyraźnie różne. Wątroba rozwija się z uchyłka endodermy brzusznego jelita przedniego⁵. Obszar ogonowy uchyłka tworzy pozawątrobowe drzewo żółciowe, podczas gdy obszar czaszki generuje wewnątrzwątrobowe drzewo żółciowe⁵. Cholangiocyty przewodu wewnątrzwątrobowego pochodzą z komórek progenitorowych wokół płytki przewodowej w obszarach wrotnych okołobiegunowych⁶. Komórki te mają zdolność różnicowania się w hepatocyty lub cholangiocyty⁶. Ma to znaczące implikacje kliniczne, biorąc pod uwagę, że cholangiopatie mogą być specyficznie ukierunkowane na jedną kategorię cholangiocytów. Na przykład atrezja dróg żółciowych początkowo wpływa na przewody pozawątrobowe noworodka, podczas gdy zespół Alagille'a wpływa na przewody wewnątrzwątrobowe.

Istnieje wiele opisów izolacji wewnątrzwątrobowych cholangiocytów i jednostek dróg żółciowych od myszy i szczurów. Badacze wyizolowali pojedyncze komórki przez izolację przewodów i późniejszy wzrost lub przez trawienie wątroby i ściąganie przeciwciał w dół cholangiocytów wyrażających określone markery powierzchni komórek^1-4. Funkcjonalne i spolaryzowane jednostki dróg żółciowych zostały wyizolowane przez trawienie wątroby i filtrację wielkości⁷. Jednostki dróg żółciowych są zdolne do reagowania na bodźce wydzielnicze i wykazują wydzielanie płynów⁷, podczas gdy wykazano, że izolowane cholangiocyty rozwijają struktury przewodowe in vitro^1,2. Do ograniczeń tych metod należy konieczność posiadania specjalistycznej wiedzy technicznej i specjalnego sprzętu do perfuzji wątroby za pomocą enzymów trawiennych. Ponadto istnieje ryzyko zanieczyszczenia komórkami mezenchymalnymi³.

Metoda izolowania pozawątrobowych cholangiocytów dróg żółciowych, szczególnie od pozawątrobowych dróg żółciowych noworodków, nie została wcześniej opisana. W artykule przedstawiono uproszczoną technikę izolowania komórek pozawątrobowych dróg żółciowych noworodków i dorosłych przy zachowaniu wysokiego poziomu czystości. Technika ta ułatwi badanie różnic między cholangiocytami wewnątrz- i zewnątrzwątrobowymi oraz badania nad mechanizmami chorób, takich jak atrezja dróg żółciowych, które obejmują przewody pozawątrobowe.

Protokół

Cała procedura jest przeprowadzana w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Wszystkie prace ze zwierzętami powinny być wykonywane w humanitarnych warunkach, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez lokalny Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC).

1. Przygotowanie sprzętu i rozwiązań

1. Ustaw stół chirurgiczny myszy w bliskiej odległości od kaptura do hodowli tkanek i inkubatora (ryc. 1A). Uwaga: Wymagane wyposażenie obejmuje mikroskop preparacyjny, źródło światła, nożyczki do prostej tęczówki o długości 12,5 cm, 6-calowe nieząbkowane zakrzywione kleszcze z cienkimi końcówkami oraz 4-calowe ząbkowane kleszcze z zakrzywionymi końcówkami (rysunek 1B).
2. Wysterylizowane narzędzia umieścić na stole operacyjnym w szklanej zlewce z 70% alkoholem.
3. Napełnić trzy sterylne szalki Petriego o średnicy 60 mm sterylnymi pożywkami izolacyjnymi (Tabela 1); umieścić dwie na stole operacyjnym i jedną w kapturze, wszystkie na lodzie.
4. Umieść kolagen z ogona szczura, sterylną sól fizjologiczną buforowaną 10 razy fosforanem (PBS), sterylną wodę, sterylne 1 N NaOH i pożywkę z komórek nabłonka żółciowego (BEC) (Tabela 1) w kapturze do hodowli tkankowej. Uwaga: Kolagen powinien być na lodzie.

2. Izolacja i posiew dróg żółciowych

1. Poddać eutanazji nowonarodzone myszy między 0-3 dniem życia, poprzez wystawienie na dwutlenek węgla do utraty przytomności, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, zgodnie z wytycznymi IACUC (ryc. 1C).
   Uwaga: starsze myszy mogą być używane w zależności od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.
2. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i wykonaj małe poziome nacięcie przecinające linię środkową w okolicy miednicy. Rozciągnij to nacięcie na boki i po obu stronach brzucha, tworząc płat w kształcie litery U. Obróć klapę do góry, aby odsłonić narządy jamy brzusznej. Gdy brzuch jest otwarty, ostrożnie wysuń jelita z jamy brzusznej w kierunku prawej strony zwierzęcia, aby uzyskać lepszą wizualizację wątroby i wspólnego przewodu żółciowego. Uwaga: może być konieczne przedłużenie bocznych nacięć w klatce piersiowej w celu uzyskania lepszej identyfikacji wątroby.
3. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zidentyfikuj wspólny przewód żółciowy, wątrobę i jelita. Najpierw zidentyfikuj wspólny przewód żółciowy (ryc. 1D), zachowując ostrożność, ponieważ struktury są bardzo delikatne. Za pomocą ząbkowanych i nieząbkowanych kleszczy skrupulatnie oczyść i usuń tkankę łączną, w tym tłuszcz otaczający żółć. Użyj jednego kleszcza do przytrzymania kanału, a drugiego do czyszczenia.
4. Użyj podobnej techniki do czyszczenia pęcherzyka żółciowego.
5. Umieść oczyszczone kanały i woreczek żółciowy w pierwszym naczyniu z podłożem izolacyjnym na lodzie. Delikatnie masuj struktury nieząbkowanymi kleszczami w pożywce, aby dodatkowo usunąć tkankę łączną i usunąć żółć z pęcherzyka żółciowego.
6. Przenieś kanały i pęcherzyk żółciowy do drugiego naczynia z podłożem izolacyjnym.
7. Po odizolowaniu przewodów i pęcherzyków żółciowych od 5 zwierząt, przenieś kawałki na trzecią szalkę Petriego, w kapturze. Uwaga: Jeśli komórki mają być izolowane od więcej niż 5 zwierząt, należy je izolować partiami, używając świeżych roztworów dla każdej grupy 5 zwierząt.
8. Przygotuj gęste żele kolagenowe w kapturze do hodowli tkankowej:
   Uwaga: można użyć naczynia o dowolnym rozmiarze. Dobrze sprawdza się naczynie hodowlane o średnicy 60 mm z końcową objętością 3 ml kolagenu dla każdej grupy 5 noworodków. Powinien być przygotowany na świeżo w momencie osadzania świeżo odizolowanych kanałów.
   1. Umieść kolagen z ogona szczura, sterylną sól fizjologiczną 10x buforowaną fosforanem (10x PBS), sterylne dH₂O i sterylne 1 N NaOH na lodzie.
   2. Obliczyć objętości dH₂0, 10x PBS, NaOH i kolagenu wymagane dla żeli o końcowym stężeniu 2 mg / ml kolagenu w 1x PBS, używając objętości 1 N NaOH równej 0,023 objętości dodanego kolagenu. Uwaga: Jeśli używane jest alternatywne źródło kolagenu, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi neutralizacji i tworzenia żelu.
   3. Wymieszaj ze sobą dH₂0, 10x PBS i 1 N NaOH, a następnie dobrze dodaj kolagen i pipetę, aby zapewnić równomierne wymieszanie.
9. Gdy roztwór kolagenu zgęstnieje do konsystencji żelu w temperaturze pokojowej, natychmiast zanurz kanaliki w kolagenie.
10. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ na 30 minut, aby kolagen mógł się zestalić.
11. Po zestaleniu się żelu (zmiana barwy z przezroczystej na białą) nałożyć na 3,5 ml pożywki BEC (Tabela 1) i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
12. Usuwaj pożywkę BEC 3 razy w tygodniu i zastąp ją 3,5 ml świeżej pożywki.

3. Izolowanie pierwotnych cholangiocytów z gęstych żeli kolagenowych

Uwaga: w ciągu 3 tygodni arkusze cholangiocytów (komórki z dużymi jądrami wychodzącymi bezpośrednio z osadzonych przewodów) będą widoczne w gęstym kolagenie. Jeśli w naczyniu znajduje się duża liczba fibroblastów, należy je wyrzucić. Jeśli w kilku obszarach naczynia narośli narośli fibroblasty, można je wyciąć skalpelem i usunąć przed podziałem cholangiocytów.

1. Przygotuj cienkie żele kolagenowe:
   1. Rozcieńczyć kolagen do stężenia 1 mg/ml sterylnym PBS. Uwaga: użyć 1 ml na płytkę 100 mm; Dostosuj odpowiednio do potraw o innych rozmiarach.
   2. Roztwór kolagenu rozprowadzić równomiernie za pomocą rozsiewacza komórek (duże szalki) lub końcówki pipety (małe szalki), a następnie pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut.
   3. Przykryć płytkę DMEM/F12 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 10 minut.
   4. Wyjąć płytkę z inkubatora i umyć 1x PBS. Natychmiast zassać 1x PBS.
   5. Pokryj drugą cienką warstwą kolagenu, rozprowadzając poprzez obracanie płytki lub umieszczanie płytki na shakerze. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 10 minut.
   6. Po zestaleniu się kolagenu przykryć płytkę DMEM/F12 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 30 minut.
2. Rozszczepione komórki z gęstych żeli kolagenowych:
   1. Za pomocą szpatułki do hodowli komórkowych lub skrobaka do komórek delikatnie zeskrob żel kolagenowy z płytki, aby unosił się na wodzie.
   2. Przygotować roztwór kolagenazy, rozcieńczając kolagenazę typu XI (patrz lista materiałów) do 10 mg/ml za pomocą DMEM/F12. Dobrze wymieszaj i sterylny filtr.
   3. Dodać 1 ml roztworu kolagenazy (powyżej) na 60 mm naczynie komórek w gęstym kolagenie. Nie wyjmuj pożywki BEC (która powinna mieć 3 ml). Inkubować naczynie przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   4. Usunąć roztwór zawierający komórki i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
   5. Wirować przy 2,200 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w podobnej objętości DMEM/F12.
   6. Ponownie wirować roztwór przy 2 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
   7. Zawiesić osad w 3 ml 0,5% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 5 minut. Po inkubacji pipetować roztwór w górę iw dół, aby rozbić arkusze cholangiocytów. Dodać 5 ml pożywki BEC i wirować roztwór o stężeniu 1 500 x g przez 5 min.
   8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w DMEM/F12, a następnie wirować roztwór o stężeniu 1 500 x g przez 5 minut.
   9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pożywce BEC (Tabela 1). Płytki komórkowe na wcześniej przygotowanych cienkich żelach kolagenowych.

4. Przemieszczanie i przechowywanie komórek

Uwaga: komórki na cienkich żelach kolagenowych mogą być dzielone w zależności od potrzeb.

1. Umyć płytki sterylnym PBS przed inkubacją w 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10-15 min.
2. Zneutralizować równą objętością pożywki BEC i granulować w ilości 1.500 x g przez 5 min. Przepłukać osad DMEM/F12, a następnie osad w 1.500 x g przez 5 min.
3. Ponownie zawiesić komórki w pożywce BEC w celu dystrybucji do naczyń do hodowli komórkowych pokrytych kolagenem.
   Uwaga: Alternatywnie, komórki można ponownie zawiesić na nośniku pamięci i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie (tabela 1).

Wyniki

Zastosowanie niniejszego protokołu pozwala na wyizolowanie populacji noworodkowych cholangiocytów pozawatrobowych myszy o wysokiej czystości, co wykazano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego K19 (Ryc. 2A i 2B); podobne wyniki uzyskano podczas izolacji komórek od myszy dorosłych. Zaobserwowano, że komórki z nowo wyizolowanych dróg żółciowych potrzebują 3 tygodni na utworzenie monowarstw na grubych żelach kolagenowych. Cholangiocyty rosną liniowo w obrębie grubego kolagenu, tworząc płaty komórek poc...

Dyskusja

Opisano tutaj technikę izolowania czystych cholangiocytów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy w każdym wieku, w tym noworodków. Technika ta ma tę zaletę, że cholangiocyty pozawątrobowe mogą być badane oddzielnie od cholangiocytów wewnątrzwątrobowych i mogą ułatwić badania mające na celu zidentyfikowanie kluczowych różnic między tymi populacjami komórek. Niedawno opublikowaliśmy badanie wykazujące zmniejszenie rzęsek w cholangiocytach pozawątrobowych wyizolowanych tą metodą i zakażonych rotawirusem rezus⁸. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12 (1:1)	Gibco/ Life technologies	11320-033	500 ml, stosowany w podłożach BEC
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	25 ml, stosowany w podłożach BEC
MEM z aminokwasami endogennymi	Gibco/ Life technologies	11140-019	5 ml, stosowany w podłożach BEC
Insulina-transferyna-selen	Gibco/ Life technologies	51300-044	5 ml, stosowany w podłożach BEC
Na Pirogronian	Cellgro	25-000-CL	5 ml, stosowany w podłożach BEC
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy	Gibco/ Life technologies	11905-031	5 ml, stosowany w pożywkach BEC
Penicylina-Streptomycyna	Cellgro	30-002-CI	5 ml, stosowany w podłożach BEC i 500 μ l w izolacji
Gentamycyna	Gibco/ Life technologie	15750-060	0,2 ml, stosowana w pożywkach BEC i 500 μ l w izolacji
Etanoloamina	Sigma Aldrich	E9508-100ml	0,13 ml, stosowany w pożywkach BEC
Roztwór witaminowy MEM	Gibco/ Life technologies	11120-052	5 ml, stosowany w pożywkach BEC
Inhibitor trypsyny sojowej	Biowhittaker	17-605E	5 ml, stosowany w podłożach BEC. Rozpuszczalnikiem jest PBS, wymieszać do stężenia podstawowego 5 mg/ml
L-glutaminy	Cellgro	25-005-CL	5 ml, stosowany w pożywkach BEC
Ekstrakt z przysadki bydlęcej	Gemini	500-102	1,1 ml, stosowany w pożywkach BEC
Deksametazon	Sigma Aldrich	D4902	0,5 ml, stosowany w podłożach BEC, Stock conc 393 μ g / ml rozcieńczyć etanolem
3 3',5-trijodo-L-tyronina	Sigma Aldrich	T6397	0,5 ml, stosowany w pożywkach BEC, Stężenie magazynowe 3,4 mg/ml rozcieńczony etanolem
Naskórkowy czynnik wzrostu	Millipore	01-101	0,5 ml, stosowany w podłożach BEC, 25 μ g/ml rozcieńczyć DMEM F12+1%BSA
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886 5	ml, stosowany w podłożach BEC, stosować w stężeniu podstawowym 0,411 mg/ml i rozcieńczyć DMSO
Fungizone	Gibco/ Life technologies	15290-018	1 ml, stosowany w podłożach BEC i 500 μ l w izolacji
Kolagen ze szczurzego ogona	BD Biosciences	354236	zmienny w zależności od stężenia kolagenu
PBS 10x	USB Corporation	75889	zastosowanie przy 10x, sterlie, używany do produkcji kolagenu, ilość użyta zależy od stężenia kolagenu
dH2O	N/	A N/A	sterylny, używany do produkcji kolagenu, ilość użyta zależy od stężenia kolagenu
NaOH 10 N	Fischer Scientific	ss255-1	Rozcieńczony do 1 N, sterylny, używany do wytwarzania kolagenu, ilość użyta zależy od stężenia
kolagenu kolagenaza typu XI z Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657	rozcieńczyć w DMEM i sterylnym filtrze przed użyciem
trypsyna-EDTA (1x) 0,25%	Gibco/ Life technologies	25200-056	3 ml, inkubować max 10 min
trypsyna-EDTA (10x) 0,5%	Gibco/ Life technologies	15400-054	3 ml, inkubacja max 10 min
Mikroskop preparacyjny	Nikon	SMZ645	Inne modele dopuszczalne
Źródło światła (oświetlacz światłowodowy)	Schott-Fostec	Ace EKE LR 92240	Inne modele dopuszczalne
12,5 cm proste nożyczki do tęczówki	Kent Scientific		Inne modele dopuszczalne
6-calowe nieząbkowane zakrzywione kleszcze z cienkimi końcówkami	Mikroskopia elektronowa		Inne modele dopuszczalne
4-calowe ząbkowane kleszcze ze stali nierdzewnej z cienkimi końcówkami		mikroskopii elektronowej	Inne modele dopuszczalne

Nauki Nauki o