Artykuł metodologiczny

Metody charakteryzowania spontanicznej i indukowanej przez odstraszenie lokomocji w modelu choroby Parkinsona wywołanym rotenonem Drosophila

DOI:

10.3791/51625

⸱

17 sierpnia 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Colby College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które wynika ze zwyrodnienia neuronów dopaminergicznych w ośrodkowym układzie nerwowym, powodując zaburzenia lokomocji. Rotenon modeluje chorobę Parkinsona u Drosophila. W artykule przedstawiono dwa testy, które charakteryzują zarówno spontaniczne, jak i wywołane przez przerażenie niedobory lokomocji spowodowane rotenonem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona jest zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które wynika ze zwyrodnienia neuronów dopaminergicznych w ośrodkowym układzie nerwowym, głównie w istocie czarnej. Choroba powoduje zaburzenia motoryczne, które objawiają się sztywnością, drżeniem i demencją u ludzi. Rotenon jest insektycydem, który powoduje uszkodzenia oksydacyjne poprzez hamowanie funkcji łańcucha transportu elektronów w mitochondriach. Jest również używany do modelowania choroby Parkinsona u Drosophila. Muchy mają wrodzoną negatywną reakcję geotaktyczną, która zmusza je do wspinania się w górę, gdy zostaną zaskoczone. Ustalono, że rotenon powoduje wczesną śmiertelność i wady lokomocji, które zakłócają zdolność much do wspinania się po stuknięciu w dół. Jednak wpływ rotenonu na spontaniczny ruch nie jest dobrze udokumentowany. Badanie to przedstawia dwa czułe, powtarzalne i wysokoprzepustowe testy w celu scharakteryzowania niedoborów wywołanych rotenonem w krótkotrwałej lokomocji wywołanej przestraszeniem i długotrwałej spontanicznej lokomocji u Drosophila. Testy te można wygodnie dostosować do scharakteryzowania innych modeli wad lokomocyjnych Drosophila i skuteczności środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaburzenia lokomocji są głównym objawem choroby Parkinsona i są w dużej mierze spowodowane pogorszeniem stanu neuronów dopaminergicznych istoty czarnej1. Rotenon jest ketonicznym środkiem owadobójczym, który był szeroko badany w celu modelowania deficytów motorycznych Parkinsona u Drosophila2-6. Rotenon powoduje uszkodzenia oksydacyjne poprzez blokowanie szlaku fosforylacji oksydacyjnej, co ostatecznie powoduje śmierć komórki7. Neurony dopaminergiczne są bardziej podatne na toksyczność rotenonu, co sprawia, że działanie tej substancji chemicznej opiera się głównie na motoryce2,7. Wywołując objawy choroby Parkinsona u much, możemy lepiej zrozumieć chorobę i zaradzić jej objawom6,8-11. Drosophila stanowi dobry model do badania tego efektu, ponieważ są genetycznie podatne, łatwe w utrzymaniu i mają szybki cykl życia.

Kilka badań wykazało, że rotenon powoduje krótkotrwałe zaburzenia lokomocji wywołane przez przerażenie u Drosophila - gdy muchy są utrzymywane na pokarmie uzupełnionym rotenonem, wykazują wolniejszą negatywną reakcję geotaktyczną po przestraszeniu2-6. Ich niezdolność do wspinania się w górę w aparacie fiolkowym tak szybko, jak w próbach kontrolnych, wskazuje na wady lokomocji wywołane przez przestraszenie.

Wpływ rotenonu na długotrwałe, spontaniczne ruchy nie jest dobrze opisany. Monitory aktywności Drosophila (DAM) zostały z powodzeniem wykorzystane do monitorowania ruchu w badaniach rytmu okołodobowego Drosophila 12,13. Muchy umieszcza się w pojedynczych tubach, które są ładowane do DAM. Aparat ten jest wyposażony w czujnik podczerwieni, który zlicza, ile razy mucha przerywa wiązkę podczerwieni. Liczby te mogą być używane jako miara niezakłóconej lokomocji i aktywności12,13. Umieszczając muchy w DAM, można scharakteryzować wpływ rotenonu na ich długotrwałą lokomocję. W badaniu tym opisano metody pomiaru krótkotrwałej lokomocji wywołanej przestraszeniem i długotrwałej spontanicznej lokomocji w celu lepszego zrozumienia skutków niedoborów motorycznych zależnych od rotenonu. Charakterystyka zaburzeń lokomocji naśladujących chorobę Parkinsona jest ważna, ponieważ pozwala na badanie innych związków, które mogą odwrócić te wady lokomocji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Test lokomocji wywołany przez Drosophila Startle

  1. Leczenie uzależnień od narkotyków
    1. Uspokoić żądaną liczbę (około 8-12) 1-3 jednodniowych samców much za pomocą CO2 i przetransportować je do fiolek zawierających pokarm uzupełniony lekiem. Uwaga: Inny środek znieczulający, np. eter lub lód, może być użyty do uspokojenia much, aby umożliwić liczenie i obsługę.
    2. Pozwolić muszkom dojść do siebie po sedacji przez 20 minut (lub do czasu wyzdrowienia) z fiolką w pozycji poziomej (aby zapobiec utknięciu much na jedzeniu), a następnie umieścić fiolkę pionowo w 12-godzinnym ciemnym, 12-godzinnym inkubatorze światła w temperaturze 25 °C na pozostałą część eksperymentu.
  2. Konfiguracja eksperymentalna
    1. Podzielić ten zestaw podwójnej fiolki na trzy równe części po 6,33 cm, zaznaczając kółka wokół fiolek trwałym markerem.
    2. Po 3 dniach ekspozycji na lek przenieść muchy bez znieczulenia do dolnej fiolki i szybko umieścić górną fiolkę nad otworem. Zakleić obie fiolki taśmą klejącą.
    3. Pozwól muchom zaaklimatyzować się w nowym środowisku przez 15 minut.
    4. Umieścić fiolki na białym tle i ustawić aparat cyfrowy w odpowiedniej odległości od aparatu z podwójną fiolką z timerem w widoku. Upewnij się, że całe urządzenie jest widoczne w jednej ramce obrazu i że wszystkie muchy są ostre. Aby zachować spójność klatek między próbami, należy zaznaczyć położenie kamery i fiolki.
  3. Test mobilności
    1. Wyraźnie wyświetlaj numer badania, leczenie farmakologiczne i licznik czasu w widoku z kamery.
    2. Mocno postukać podwójną fiolką o blat 3 razy i upewnić się, że wszystkie muchy opadną na dno fiolki. Jednocześnie uruchom stoper.
    3. Co 5 sekund przez 1 minutę rób zdjęcie aparatu. Uwaga: Alternatywnie film może zostać przechwycony i wstrzymany w odpowiednich odstępach czasu w celu pomiarów.
    4. Pozwól muchom zregenerować się bez przeszkód przez 1 minutę.
    5. Powtórz jeszcze 2 razy z 1-minutowym czasem regeneracji między każdą próbą. Uwaga: Każde urządzenie powinno potrzebować 5 minut, aby zakończyć zbieranie danych. Utrzymuj podobną siłę stukania między próbami. Wiele (co najmniej 3) aparatów może być łatwo obsługiwanych jednocześnie.
  4. analiza danych
    1. Przeglądaj zdjęcia i rejestruj liczbę much w każdej sekcji w czasie. Oblicz procent much w każdej sekcji w czasie. Uwagi: Powtórz całą tę procedurę z tymi samymi muchami w 2 lub 3 punktach zainteresowania w czasie, na przykład w dniu 3, 5 i 7. Jeśli zbyt wiele much umrze w trakcie eksperymentu, możliwe jest zwiększenie pierwotnej liczby próby, aby zrekompensować śmiertelność. Użyj odpowiedniej analizy statystycznej, aby porównać dane.

2. Test spontanicznej lokomocji Drosophila

  1. Przygotowywanie posiłków
    1. Rozpuść 3 g błyskawicznej pożywki Drosophila w 15 ml wody dejonizowanej i żądanej dawce rotenonu (lub innego interesującego leku).
    2. Gdy mieszanka spożywcza stanie się twarda (około 5 minut), ostrożnie załaduj żywność tak, aby miała około 1 cm wysokości, do przezroczystych rurek dostarczonych przez producenta (5 mm X 65 mm). Dodaj pokarm w infuzji leku do probówek, ostrożnie umieszczając rurki pionowo w żywności i przekręcając je, aż będzie można je usunąć wraz z jedzeniem wewnątrz tuby. Uwaga: Pomocne jest umieszczenie palca na otworze rurki, aby wytworzyć próżnię. Jedzenie nie powinno zawierać pęcherzyków powietrza ani mieć nierównej powierzchni, ponieważ muchy mogą utknąć.
  2. Konfiguracja eksperymentalna
    1. Umieść plastikową nakrętkę na końcu rurki najbliżej żywności. Naciskać plastikową nakrętkę na probówkę tak rzadko, jak to możliwe, ponieważ może ona spowodować powstanie pęcherzyków powietrza w fiolce, jeśli zostanie dociśnięta na siłę.
    2. Uspokój 1-dniowe muchy samca za pomocą CO2 i ostrożnie włóż 1 samca muchy do każdej rurki za pomocą pędzla. Powtórz w zależności od liczby pożądanych prób.
    3. Zatkaj koniec rurki najbardziej oddalony od jedzenia małym wacikiem, który można ręcznie zwinąć z większych wacików kupionych w sklepie.
    4. Pozwól muchom dojść do siebie z rurkami w pozycji poziomej przez 15 minut i upewnij się, że wszystkie muchy są żywe i aktywne. Włóż rurki do DAM i upewnij się, że wszystkie rurki są w tej samej pozycji względem DAM. Uwaga: Możliwe jest umieszczenie ich w obszarze monitorowania w środku fiolki lub przesunięcie wszystkich fiolek na bok, tak aby monitorowany był koniec probówki. Uwaga: Zobacz dyskusję, aby zapoznać się z odmianami tej metody.
  3. Gromadzenie danych
    1. Umieść DAM w 12-godzinnym ciemnym, 12-godzinnym inkubatorze światła ustawionym na 25 °C. Podłącz DAM do systemu zbierania danych. Otwórz oprogramowanie DAM i w preferencjach wybierz długość kosza na 10 minut. Rozpocznij zbieranie danych i pozwól programowi zbierać dane przez 7 dni. Uwaga: W razie potrzeby długość pojemnika można dostosować.
    2. Analiza danych
      Uwaga: Przetwarzaj dane, aby uzyskać liczbę na minutę jako miarę długotrwałej spontanicznej lokomocji.
      1. Otwórz program skanowania plików DAM i uzyskaj dostęp do danych monitora, klikając wybierz dane wejściowe.
      2. Wybierz odpowiedni zakres monitorów i wybierz długość przedziału na interwały 10 min.
      3. W polu Typ pliku wyjściowego wybierz pliki kanałów. Pozostaw wszystkie inne opcje jako domyślne.
      4. Kliknij przycisk Skanuj dane i zapisz w wyznaczonym folderze.
      5. Importuj dane do oprogramowania do analizy danych okołodobowych, aby uzyskać liczbę na minutę. Uwaga: Do analizy danych powszechnie używane jest oprogramowanie Clocklab. Dostępne są również inne opcje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muchy typu dzikiego, kanton-S, wykazały silną negatywną reakcję geotaktyczną z tylko około 88% i 5% much odpowiednio w górnej i dolnej części aparatu z podwójną fiolką po 30 sekundach (Rysunek 1). Muchy wystawione na działanie 125 μM i 250 μM rotenonu przez 3 dni wykazały nieznaczny spadek liczby much w górnej części i nieznaczny w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisujemy dwie procedury pomiaru zarówno długotrwałej spontanicznej lokomocji, jak i krótkotrwałej lokomocji wywołanej przez przestraszenie w modelu choroby Parkinsona wywołanym rotenonem. Można również zmierzyć te cechy lokomocji u muszek wystawionych na działanie innych czynników farmakologicznych znanych z modelowania choroby Parkinsona , np. parakwatu14, modeli genetycznych choroby Parkinsona , np. mutantów alfa-synukleiny15 i innych modeli much chorób wp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Qiuli Wang, Language Resource Center, Colby College, za pomoc techniczną przy przetwarzaniu wideo oraz Ericowi Thomasowi, wydziałowi muzyki, Colby College, za dostarczenie muzyki w tle. Projekt ten był wspierany przez granty z National Center for Research Resources, INBRE (P20RR016463-12), National Institute for General Medical Sciences (P20 GM103423-12), Nationals Institutes of Health and Science Division Grant, Colby College (STA). JL i LWM były wspierane przez granty z Summer Scholar Fund, Colby College.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Standardowe wąskie fiolkiGenesee Scientific32-120
RotenoneSigmaR8875Przechowywać w zamrażarce, świeży do każdego eksperymentu
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)SigmaD8418Rozpuszczalnik do rotenonu
Instant Drosophilamedium Carolina Biological Wzór 4-24
Monitor aktywności Drosophila (DAM)TrikinetykaRurki DAM2trikinetics.com
DAMRurki Trikinetics5 X 65 mm
Przepis na Rotenon + żywność (dawka 125 mM)Przygotować 62,5 mM roztwór podstawowy rotenonu w DMSO, rozpuszczając 25 mg rotenonu w 1 ml DMSO; Aby uzyskać dawkę 125 mM, dodać 10 mM rotenonu w DMSO do 5 ml wody.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Olanow, C. W., Tatton, W. G. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annual review of neuroscience. 22, 123-144 (1999).
  2. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 10993-10998 (2004).
  3. Hosamani, R., Ramesh, S. R., Muralidhara, Attenuation of rotenone-induced mitochondrial oxidative damage and neurotoxicty in Drosophila melanogaster supplemented with creatine. Neurochemical research. 35, 1402-1412 (2010).
  4. Islam, R., et al. A neuroprotective role of the human uncoupling protein 2 (hUCP2) in a Drosophila Parkinson's disease model. Neurobiology of disease. 46, 137-146 (2012).
  5. Lawal, H. O., et al. The Drosophila vesicular monoamine transporter reduces pesticide-induced loss of dopaminergic neurons. Neurobiology of. 40, 102-112 (2010).
  6. St Laurent,, O'Brien, R., M, L., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  7. Sherer, T. B., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 10756-10764 (2003).
  8. Munoz-Soriano, V., Paricio, N. Drosophila models of Parkinson's disease: discovering relevant pathways and novel therapeutic strategies. Parkinson's disease. , 520640(2011).
  9. Steffan, J. S., et al. Histone deacetylase inhibitors arrest polyglutamine-dependent neurodegeneration in Drosophila. Nature. 413, 739-743 (2001).
  10. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  11. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8024-809 (2005).
  12. Ahmad, S. T., Steinmetz, S. B., Bussey, H. M., Possidente, B., Seggio, J. A. Larval ethanol exposure alters free-running circadian rhythm and per Locus transcription in adult D. melanogaster period mutants. Behavioural brain research. 241, 50-55 (2013).
  13. Seggio, J. A., Possidente, B., Ahmad, S. T. Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster. Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).
  14. Chaudhuri, A., et al. Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).
  15. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  16. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
  17. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  18. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  19. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lokomocja Drosophilamodel rotenonowytest reakcji zaskoczenialokomocja spontanicznaaparat z podw jnymi fiolkamimonitor aktywno ci Drosophilasedacja dwutlenkiem w glapokarm z dodatkiem rotenonuodpowied geotaktycznadefekty lokomocyjne

Powiązane artykuły