Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Summary

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Abstract

Białka kanału jonowego są uniwersalnymi urządzeniami do szybkiej komunikacji między błonami biologicznymi. Sygnatura czasowa generowanego przez nie strumienia jonowego zależy od właściwości właściwych dla każdego białka kanałowego, a także od mechanizmu, za pomocą którego jest ono generowane i kontrolowane, i stanowi ważny obszar obecnych badań. Informacje na temat dynamiki operacyjnej białek kanałów jonowych można uzyskać, obserwując długie odcinki prądu wytwarzanego przez pojedynczą cząsteczkę. Opisano tutaj protokół uzyskiwania jednokanałowych zapisów prądu patch-clamp dołączonych do komórek dla kanału jonowego bramkowanego ligandem, receptora NMDA, wyrażanego heterologicznie w komórkach HEK293 lub natywnie w neuronach korowych. Podano również instrukcję, jak dostosować metodę do innych interesujących kanałów jonowych, przedstawiając przykład mechanoczułego kanału PIEZO1. Metoda ta może dostarczyć danych dotyczących właściwości przewodnictwa kanału i czasowej sekwencji konformacji otwarty-zamkniętych, które składają się na mechanizm aktywacji kanału, pomagając w ten sposób zrozumieć ich funkcje w zdrowiu i chorobie.

Introduction

Szybka komunikacja między błonami biologicznymi opiera się prawie wyłącznie na oligomerycznych białkach błonowych tworzących pory, powszechnie nazywanych kanałami. Białka te różnią się znacznie sygnałami aktywacji, mechanizmami bramkowania i właściwościami przewodnictwa. Białka kanałowe, których pory są selektywne dla jonów, są klasyfikowane jako kanały jonowe; Ich aktywacja wytwarza prądy jonowe w poprzek błony, a ich reakcje mogą być rejestrowane z wysoką rozdzielczością w czasie rzeczywistym przy użyciu technik elektrofizjologicznych. Sygnały aktywacji obejmują szeroki zakres danych chemicznych i fizycznych, w tym gradienty stężeń, siły mechaniczne i elektryczne oraz temperaturę; W związku z tym dalsze klasyfikowanie kanałów jonowych na typy bramkowane ligandami, mechanowrażliwe, bramkowane napięciem lub wrażliwe na ciepło. W tym artykule opisano protokoły rejestrowania jednokanałowej aktywności z kanału bramkowanego ligandem, receptora NMDA, i kanału mechanowrażliwego, PIEZO1, przy użyciu techniki patch-clamp.

Elektrofizjologia patch-clamp jest pierwszą i najczęściej stosowaną metodą eksperymentalną, która jest wystarczająco czuła, aby umożliwić obserwację pojedynczych cząsteczek ^1,2. Oprócz tej wyjątkowej czułości, znacznie rozszerzył preparaty biologiczne podatne na zapis elektrofizjologiczny, a także umożliwił obserwację kanałów jonowych w nienaruszonych błonach. Po pierwsze, ponieważ zarówno zaciskanie napięcia, jak i rejestrowanie prądu odbywa się za pomocą tej samej elektrody, może być ona używana do rejestrowania sygnałów przez małe ogniwa lub łaty membranowe. Technika ta ujawniła, że kanały jonowe nie ograniczają się do pobudliwych błon mięśni żaby, elektroblaszek węgorza lub gigantycznych aksonów^{kałamarnic 3,4}, ale raczej, że reprezentują one wszechobecne elementy transbłonowych mechanizmów sygnalizacyjnych i są nieodłączne dla wszystkich typów błon komórkowych organizmów jedno- lub wielokomórkowych, a także dla błon wewnątrzkomórkowych. Co ważne, możliwość rejestrowania prądów transbłonowych poprzez proste przymocowanie szklanej pipety do nienaruszonej komórki zapewniła bezprecedensową możliwość rejestrowania aktywności kanałów jonowych w ich natywnych, niezakłóconych membranach. Tak więc technika patch-clamp dołączona do komórki, która jest opisana w tym protokole, pozwala na ciągłe monitorowanie aktywności kanałów jonowych przez dziesiątki minut lub dłużej w ich naturalnym środowisku.

Przy normalnych fluktuacjach termicznych, wszystkie białka, w tym białka kanałów jonowych, ulegają zmianom strukturalnym w szerokim zakresie czasu, przy czym najszybsze i najczęstsze przegrupowania są najprawdopodobniej reprezentowane przez ruchy łańcucha bocznego, a znacznie wolniejsze, rzadsze zmiany są reprezentowane przez repozycjonowanie całych domen lub podjednostek, lub w niektórych przypadkach przez modyfikacje potranslacyjne lub interakcje białko-białko^{5, Lokal mieszkalny} Obserwacja długich okresów aktywności generowanej przez jedną cząsteczkę może pomóc w zrozumieniu funkcjonalnej dynamiki kanałów jonowych w nienaruszonych błonach fizjologicznych i dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmu działania obserwowanej cząsteczki.

W przeciwieństwie do rosnącego zrozumienia różnorodności kanałów jonowych w różnych typach komórek i stadiach rozwoju, wiedza na temat składu molekularnego kanałów jonowych w natywnych błonach jest nadal ograniczona. Wszystkie kanały jonowe są białkami multimerycznymi, a większość natywnych kanałów jonowych składa się z kilku typów podjednostek wytwarzających białka o szerokiej różnorodności molekularnej, której często towarzyszą różne właściwości przewodnictwa i bramkowania. Z tego powodu kanały jonowe o określonym składzie molekularnym są badane po ekspresji w układach heterologicznych. W szczególności komórki HEK293, które są klonalną linią unieśmiertelnionych ludzkich embrionalnych komórek nerkowych⁷, zyskały powszechną akceptację jako preferowany system heterologicznej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych. Wśród wielu zalet, które podniosły poziom komórek HEK293 jako systemu wyboru dla elektrofizjologii kanałów jonowych, są łatwość i przystępność cenowa hodowli i utrzymywania długowiecznych stabilnych kultur, ich zdolność do przeprowadzania potranslacyjnego fałdowania, przetwarzania i transportu białek ssaków, a w wielu przypadkach ich niski poziom lub nawet brak endogennej ekspresji dla kanału będącego przedmiotem zainteresowania^{7. Rozdział 8}. Ekspresja rekombinowanych kanałów jonowych i badanie ich właściwości funkcjonalnych w komórkach HEK293 nadal jest cennym podejściem do uzyskiwania informacji na temat właściwości strukturalno-funkcjonalnych kanałów jonowych, a także specyficznych właściwości izoform kanałów jonowych i ich ról w tkance natywnej. Protokoły opisane w tym artykule mogą być równie dobrze stosowane do rekombinowanych kanałów jonowych ulegających ekspresji w komórkach HEK293, jak i do natywnych kanałów jonowych.

Podsumowując, technika patch-clamp, dzięki swojej bezprecedensowej zdolności do rozdzielania sygnałów z jednej cząsteczki, pozostaje jak dotąd najbardziej bezpośrednią metodą obserwacji zachowania pojedynczych molekuł. W trybie dołączonym do komórki, zapis patch-clamp pozwala na długie okresy obserwacji, które w przypadku jednej cząsteczki mogą zapewnić wyjątkowy wgląd w działanie kanałów jonowych. Poniżej przedstawiono protokół uzyskiwania wysokorozdzielczych nagrań prądowych z plastrów przyłączonych do komórek zawierających jedno białko kanału jonowego.

Protocol

1. Hodowla komórkowa i ekspresja białek

1. Utrzymuj komórki HEK293 (numer ATCC CRL-1573) między pasażami 22 i 40, w tym pasażami wykonywanymi przez ATCC, w hodowli jednowarstwowej w DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% mieszaniną penicyliny/streptomycyny w 5% CO₂ i 37 °C. Pomiędzy eksperymentami pasażować komórki do kolb T25 w 5-20 krotnych rozcieńczeniach w końcowej objętości 10 ml. Uwaga: Wykorzystanie komórek podczas tych pasaży gwarantuje korzystne zdrowie komórek, co pozwoli na optymalne tworzenie uszczelnień i stabilność łat
.
2. Do transfekcji umieścić komórki HEK293 w szalkach o średnicy 35 mm w gęstości ~10⁵ komórek/szalkę, co odpowiada ~0,5-0,6 ml zawiesiny komórkowej na szalkę i hodować komórki w 2 ml pożywki przez 18-24 godziny.
3. W sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przygotuj mieszaninę transfekcji na cztery szalki o średnicy 35 mm, dodając (w tej kolejności): (1) 1 μg każdego cDNA (GluN1, GluN2A i GFP); (2) 315 μl wody podwójnie destylowanej (ddH₂O); (3) 350 μl 42 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i (4) 35 μl 2,5 M CaCl₂ kropli, który jest używany do tworzenia osadu.
4. Wirować probówkę przez 5 sekund i dodać 175 μl zawiesiny transfekcyjnej do każdej z czterech szalek o średnicy 35 mm posianych dzień wcześniej, które teraz zawierają komórki o 50-60% konfluencji, i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
5. Odessać pożywkę transfekcyjną, przemyć PBS i zastąpić 2 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej 2 mM MgCl₂ w celu zapobieżenia ekscytotoksyczności za pośrednictwem receptora NMDA⁹. Uwaga: Ogniwa mogą być używane do zapisów elektrofizjologicznych 24-48 godzin po transfekcji.

2. Przygotowanie elektrody

1. Wygeneruj 2 symetryczne pipety rejestrujące, ciągnąc rurki ze szkła borokrzemianowego za pomocą pionowego ściągacza. W zależności od rozmiaru i geometrii powstałej końcówki należy dalej kształtować pipety za pomocą polerki. Uwaga: Rozmiar końcówki można ocenić wizualnie i elektrycznie. Wizualnie średnica zewnętrzna powinna mieścić się w zakresie 1,4-5,6 μm. Elektrycznie końcówka o optymalnym rozmiarze, po napełnieniu roztworem zewnątrzkomórkowym, powinna wytwarzać rezystancje w zakresie 12-24 MΩ (patrz rysunek 2B).
2. Użyj roztworu pipety, który do eksperymentów z przyłączeniem komórek reprezentuje środowisko zewnątrzkomórkowe, które wytworzy maksymalną aktywność kanału i wysokie amplitudy prądu. Uwaga: W przypadku receptorów NMDA odpowiada to roztworowi zawierającemu nasycone stężenia agonistów (glutaminianu i glicyny), 1 mM EDTA, który chelatuje dwuwartościowe inhibitory kationowe i blokery, i ma fizjologiczne stężenia sodu (150 mM) jako jedynego jonu permodalnego (w mM: 1 glutaminian, 0,1 glicyna, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 EDTA i 10 HEPBS, buforowany w pH 8,0 z 1 N NaOH).

3. Nagrywanie z użyciem zacisku krosowego dołączonego do komórki

1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych QuB (www.qub.buffalo.edu) i wybierz okno akwizycji w sekcji "układ". Otwórz nowy plik danych QuB (QDF), klikając "Nowe dane" w menu rozwijanym zatytułowanym "Plik" i wprowadź następujące parametry początkowe: częstotliwość próbkowania, 40 kHz; Skalowanie A/D, 3 000; kanał wyjściowy, 1; i rozmiar danych A/D, 2. Dostosuj skalowanie amplitudy do 0,1 V/pA, klikając prawym przyciskiem myszy plik danych, wybierając właściwości i klikając zakładkę "dane". Uwaga: Parametry te można doprecyzować dla każdej konfiguracji za pomocą komórki modelu w trybie dołączonej komórki. Dodatkowe instrukcje dotyczące akwizycji danych za pomocą oprogramowania QuB i właściwości QDF są dostępne online pod adresem www.qub.buffalo.edu.
2. Wybierz 35-milimetrową szalkę zawierającą komórki wyrażające kanał jonowy i zastąp pożywkę wzrostową 2 ml PBS zawierającej wapń i magnez; zamontuj szalkę na stoliku mikroskopu i skup się na polu komórkowym za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby ocenić, czy komórki są zdrowe i dobrze przyczepione do szalki w sposób jednowarstwowy (ryc. 1A). Przełącz się na detekcję fluorescencji, aby sprawdzić, czy transfekcja się powiodła (ryc. 1B). Uwaga: Zakres intensywności fluorescencji może być używany jako surowa miara ekspresji białek.
3. W przypadku nagrywania jednokanałowego należy ustawić wzmocnienie wyjściowe wzmacniacza na x10, konfigurację patcha na β = 1, filtr analogowy na 10 kHz, tryb na voltage-clamp i przyłożyć napięcie na +100 mV. Gdy polecenie utrzymania napięcia w pozycji OFF wybierz przycisk "test uszczelnienia".
4. Na podstawie fluorescencji i zdrowia komórki wybierz komórkę do załatania. Sprawdź pod kątem kontrastu fazowego, czy komórka jest dobrze przymocowana do naczynia, ma dużą część powierzchni komórki odsłoniętą do łatania i poza tym wygląda zdrowo. Uwaga: Utrzymuj oświetlenie z kontrastem fazowym, aby uniknąć bielenia ogniwa podczas podejścia i zaciskania łatki.
5. Napełnij świeżo wypolerowaną pipetę roztworem w takiej ilości, aby zetknęła się z elektrodą, i delikatnie potrząśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogą zostać uwięzione w końcówce. Przymocuj pipetę nagrywającą do amplifier headstage, dokręcając uszczelniającą uchwytu pipety i upewniając się, że srebrny drut jest zanurzony w roztworze pipety.
6. Używając małej (5 cm³) plastikowej strzykawki, która jest połączona z uchwytem pipety za pomocą rurki, delikatnie zastosuj nadciśnienie, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń i zatykaniu końcówki podczas podejścia (Rysunek 2A).
7. Za pomocą mikromanipulatora skierować pipetę do kąpieli i umieścić ją bezpośrednio nad celą wybraną do łatania (rysunek 1C), zamykając obwód elektryczny. Zwróć uwagę na oscyloskop, który powinien wskazywać prostokątny przebieg odpowiadający sygnałowi testowemu uszczelnienia wzmacniacza (rysunek 2B). Uwaga: Po wejściu do kąpieli rezystancja pipety w optymalnym zakresie wynosi 12-24 MΩ. Dla sygnału testowego 5 mV mierzony zakres prądu odpowiada ~20-40 pA.
8. Monitorując wizualnie położenie pipety za pomocą mikroskopu i opór pipety elektrycznie na oscyloskopie, kontynuuj podejście małymi krokami, aż pipeta delikatnie uderzy w komórkę, a sygnał testowy nieznacznie spadnie, wskazując na zwiększoną rezystancję (ilustracja 2B).
9. Aby utworzyć uszczelnienie, należy podnieść strzykawkę i zastosować lekkie podciśnienie przez boczną rurkę, pociągając za tłok strzykawki, który wciąga błonę komórkową do końcówki pipety rejestrującej i inicjuje tworzenie uszczelki rezystancyjnej^{GΩ 10}. Zwróć uwagę na przebieg sygnału testowego na oscyloskopie, w którym tworzenie się uszczelnienia jest sygnalizowane przez jego całkowite spłaszczenie, przy czym widoczne są tylko pojemnościowe stany nieustalone (rysunek 2B). Uwaga: Jeśli sygnał nie spłaszczy się całkowicie lub linia bazowa stanie się głośna, oznacza to słabe uszczelnienie ze znacznym upływem prądu wokół uszczelki. Zapobiegnie to rozwiązywaniu prądów jednokanałowych. W takim przypadku wyjmij pipetę z kuwety i z dala od kąpieli, wyjmij ją ze stopnia głowicy i wyrzuć. Powtórz proces ze świeżo wypolerowaną pipetą, aż do uzyskania uszczelki w odpowiednim zakresie (≥ 1 GΩ).
10. Na wzmacniaczu przełącz przełącznik poleceń zewnętrznych z "test uszczelnienia" na "wyłącz"; przełącz polecenie utrzymywania napięcia na dodatnie (które poprzednio było ustawione na "wyłączone") i zwiększ wzmocnienie do x100. Obserwuj oscyloskop pod kątem aktywności kanału, która, jeśli występuje, będzie wyświetlana jako kwadratowe odchylenia w górę od poprzednio płaskiej linii podstawowej (rysunek 2C).
11. Jeśli na oscyloskopie wyświetlana jest aktywność kanału, należy pobrać dane do poprzednio otwartego pliku cyfrowego w QuB, naciskając przycisk "play", a następnie przycisk "record". Aby zatrzymać pobieranie danych, naciśnij przycisk stop w QuB i zapisz plik QDF w łatwej do odzyskania lokalizacji na dysku twardym komputera, wybierając opcję "Zapisz dane jako..." z rozwijanego menu zatytułowanego "Plik".

4. Wstępne przetwarzanie danych i idealizacja

Uwaga: Ważne informacje można wydobyć z nagrań jednokanałowych za pomocą analiz statystycznych, które przypisują każdy punkt danych do odpowiedniej klasy przewodności (w najprostszym przypadku zamkniętej lub otwartej). Proces ten jest określany jako idealizacja danych, a krótki opis idealizacji danych metodą segmentowych k średnich (SKM)¹¹ w QuB opisano poniżej.

1. Otwórz plik danych w QuB i wyświetl bieżące ślady w interfejsie "Pre" w sekcji "układ". Wyświetl nagrany plik bez filtrowania (usuń filtr cyfrowy), odznaczając pole oznaczone "Fc".
2. Zeskanuj wzrokowo rekord, aby wykryć nieprawidłowości i artefakty (Rysunek 4A). Skoryguj krótkie skoki prądu, które występują w obrębie ścieżki (Rysunek 4A), wybierając sąsiedni czysty obszar o tej samej klasie przewodności, podświetlając ten obszar, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję "ustaw bufor usuwania". Powiększ spajek, aż poszczególne punkty próbki będą widoczne, wybierz obszar do zastąpienia i wymaż podświetlając tylko ten obszar, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy "wymaż".
3. Zdefiniuj zerową bieżącą linię bazową dla całego rekordu, wybierając wczesną część rekordu, w której linia bazowa jest stabilna, podświetl, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "ustaw linię bazową". Sprawdź, czy wyświetlana wytyczne, które dokładnie reprezentują poziom podstawowy (fioletowy na rysunku 4B)
4. Zidentyfikuj punkty w rekordzie, w których linia bazowa danych pierwotnych wyraźnie odbiega od ustawionej linii bazowej. Popraw to, wybierając mały fragment linii bazowej w odbiegającym regionie, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie "dodaj węzeł linii bazowej".
5. Zidentyfikuj obszary nagrania zawierające nadmierny szum lub artefakty, których nie można łatwo skorygować (rysunek 4C). Zaznacz region, który ma zostać odrzucony, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "usuń". Uwaga: W takim przypadku informacje kinetyczne zostaną utracone: przetworzony zapis będzie krótszy, a punkty znajdujące się za punktem łączenia będą wydawały się być ciągłe z obszarem przed szumem.
6. Aby wyidealizować rekordy za pomocą algorytmu SKM¹¹, zaznacz część śladu zawierającą zarówno zdarzenia otwarte, jak i zamknięte i wejdź do interfejsu "Mod" w sekcji "Układ". W panelu "model" zaznacz czystą część śladu, która jest reprezentatywna dla linii bazowej w całym pliku, kliknij prawym przyciskiem myszy kwadrat (stan zamknięty) i wybierz "chwyć". Zrób to samo dla otworów kanałów, podświetlając otwartą przewodność, kliknij prawym przyciskiem myszy czerwony kwadrat w panelu "model" i wybierz "chwyć".
7. Wykonaj idealizację dla całego rekordu, wybierając przycisk "Plik" w sekcji "Źródło danych". Kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę "Idealizuj" pod sekcją "Modelowanie", aby sprawdzić, czy żądane parametry analizy są poprawne, a następnie kliknij "Uruchom". Wynik idealizacji wraz z histogramem amplitudy dla całego pliku, jest nakładany na dane, aby umożliwić wizualną kontrolę idealizacji (Rysunek 5). Uwaga: Nieodpowiednia idealizacja może prowadzić do generowania "fałszywych zdarzeń", w których QuB wykrywa otwarcia i zamknięcia kanałów, które w rzeczywistości nie występują. W ramach rozdzielczości nagrywania, która jest ustawiana przez filtr analogowy wzmacniacza i częstotliwość próbkowania, rozdzielczość, z jaką SKM wykrywa zdarzenia otwarte i zamknięte, może być kontrolowana poprzez ustawienie czasu martwego dla analiz. Optymalne czasy martwe muszą być wybierane metodą prób i błędów i będą zależeć od częstotliwości próbkowania, jednak dobrą zasadą jest wybranie czasu martwego, który wynosi 2-3 próbki¹².
8. Aby sprawdzić, czy idealizacja dokładnie odzwierciedla nieprzetworzone dane, ręcznie zeskanuj wyidealizowany ślad. Po zidentyfikowaniu błędów w idealizacji, zaznacz ślad nad fałszywym zdarzeniem, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Dołącz do Idl". Uwaga: Aby uzyskać dodatkowe opcje i szczegółowe wyjaśnienie różnych poleceń i funkcji w QuB, zapoznaj się z Podręcznikiem QuB online (www.qub.buffalo.edu).

Results

Rekombinowane receptory NMDA

Receptory NMDA wiążą się i reagują na równoczesne działanie dwóch współagonistów: glutaminianu i glicyny. Łączą się jako heterotetramery dwóch podjednostek wiążących glicynę GluN1 i dwóch podjednostek wiążących glutaminian GluN2. Podjednostki GluN2 są kodowane przez cztery geny (A-D), a spośród nich najczęściej transkrybowanymi formami w mózgu są GluN2A u dorosłych i GluN2B u młodych zwierząt. Ze względu na różnorodność podtypów receptora NMDA w pr...

Discussion

W dziedzinie kanałów jonowych ważnym obszarem badań jest zrozumienie sekwencji zdarzeń, które prowadzą do otwarcia kanału lub mechanizmu bramkowania kanału. W przypadku większości kanałów proces ten jest złożony i obejmuje kilka kroków kinetycznych, których nie można wydedukować z makroskopowego sygnału wielokanałowego. W przeciwieństwie do tego, eksperymenty mogą być projektowane tak, aby obserwacja sekwencji zdarzeń otwartych/zamkniętych w rekordzie pojedynczego kanału mogła dostarczyć bardziej szczegółowych informacji...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemikalia	Sigma	Różne
szkło borokrzemianowe	Sutter	BF-150-86-10
Mikroskop odwrócony jasnego pola	Olympus	1x51	Nikon ma również podobne mikroskopy
Pudełko fluroescencyjne	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	Mikromanipulator X-cite	OEX-LG15
	Sutter Instruments	MP-225
Oscyloskop	Tektronix	TDS1001
Wzmacniacz	Urządzenia molekularne	Axon Axopatch 200B
Tabela	TMC	63561
Karta NIDAQ	National Instruments	776844-01
Ściągacz	Polerka
	Narishige	Microforge MF-830
Klatka Faradaya	TMC	8133306
Zacisk ciśnieniowy o dużej prędkości	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pompa ciśnieniowo-próżniowa	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	Do HSPC-1