Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Podsumowanie

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Streszczenie

Białka kanału jonowego są uniwersalnymi urządzeniami do szybkiej komunikacji między błonami biologicznymi. Sygnatura czasowa generowanego przez nie strumienia jonowego zależy od właściwości właściwych dla każdego białka kanałowego, a także od mechanizmu, za pomocą którego jest ono generowane i kontrolowane, i stanowi ważny obszar obecnych badań. Informacje na temat dynamiki operacyjnej białek kanałów jonowych można uzyskać, obserwując długie odcinki prądu wytwarzanego przez pojedynczą cząsteczkę. Opisano tutaj protokół uzyskiwania jednokanałowych zapisów prądu patch-clamp dołączonych do komórek dla kanału jonowego bramkowanego ligandem, receptora NMDA, wyrażanego heterologicznie w komórkach HEK293 lub natywnie w neuronach korowych. Podano również instrukcję, jak dostosować metodę do innych interesujących kanałów jonowych, przedstawiając przykład mechanoczułego kanału PIEZO1. Metoda ta może dostarczyć danych dotyczących właściwości przewodnictwa kanału i czasowej sekwencji konformacji otwarty-zamkniętych, które składają się na mechanizm aktywacji kanału, pomagając w ten sposób zrozumieć ich funkcje w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Szybka komunikacja między błonami biologicznymi opiera się prawie wyłącznie na oligomerycznych białkach błonowych tworzących pory, powszechnie nazywanych kanałami. Białka te różnią się znacznie sygnałami aktywacji, mechanizmami bramkowania i właściwościami przewodnictwa. Białka kanałowe, których pory są selektywne dla jonów, są klasyfikowane jako kanały jonowe; Ich aktywacja wytwarza prądy jonowe w poprzek błony, a ich reakcje mogą być rejestrowane z wysoką rozdzielczością w czasie rzeczywistym przy użyciu technik elektrofizjologicznych. Sygnały aktywacji obejmują szeroki zakres danych chemicznych i fizycznych, w tym gradienty stężeń, siły mechaniczne i elektryczne or....

Protokół

1. Hodowla komórkowa i ekspresja białek

1. Utrzymuj komórki HEK293 (numer ATCC CRL-1573) między pasażami 22 i 40, w tym pasażami wykonywanymi przez ATCC, w hodowli jednowarstwowej w DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% mieszaniną penicyliny/streptomycyny w 5% CO₂ i 37 °C. Pomiędzy eksperymentami pasażować komórki do kolb T25 w 5-20 krotnych rozcieńczeniach w końcowej objętości 10 ml. Uwaga: Wykorzystanie komórek podczas tych pasaży gwarantuje korzystne zdrowie komórek, co pozwoli na optymalne tworzenie uszczelnień i stabilność łat
.
2. Do transfekcji umieścić komórki HEK293 w szalkach o średnicy 35 mm w gęstości ~10^....

Wyniki

Rekombinowane receptory NMDA

Receptory NMDA wiążą i reagują na jednoczesne działanie dwóch koagonistów: glutaminianu i glicyny. Składają się one z heterotetramerów obejmujących dwie podjednostki GluN1 wiążące glicynę oraz dwie podjednostki GluN2 wiążące glutaminian. Podjednostki GluN2 są kodowane przez cztery geny (A-D), z których najszerzej transkrybowanymi formami w mózgu są GluN2A u osobników dorosłych oraz GluN2B u osobników młodocianych. Ze względu na różnorodność podtypó.......

Dyskusja

W dziedzinie kanałów jonowych ważnym obszarem badań jest zrozumienie sekwencji zdarzeń, które prowadzą do otwarcia kanału lub mechanizmu bramkowania kanału. W przypadku większości kanałów proces ten jest złożony i obejmuje kilka kroków kinetycznych, których nie można wydedukować z makroskopowego sygnału wielokanałowego. W przeciwieństwie do tego, eksperymenty mogą być projektowane tak, aby obserwacja sekwencji zdarzeń otwartych/zamkniętych w rekordzie pojedynczego kanału mogła dostarczyć bardziej szczegółowych informacji.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemikalia	Sigma	Różne
szkło borokrzemianowe	Sutter	BF-150-86-10
Mikroskop odwrócony jasnego pola	Olympus	1x51	Nikon ma również podobne mikroskopy
Pudełko fluroescencyjne	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	Mikromanipulator X-cite	OEX-LG15
	Sutter Instruments	MP-225
Oscyloskop	Tektronix	TDS1001
Wzmacniacz	Urządzenia molekularne	Axon Axopatch 200B
Tabela	TMC	63561
Karta NIDAQ	National Instruments	776844-01
Ściągacz	Polerka
	Narishige	Microforge MF-830
Klatka Faradaya	TMC	8133306
Zacisk ciśnieniowy o dużej prędkości	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pompa ciśnieniowo-próżniowa	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	Do HSPC-1

Narishige PC-10