Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51640

⸱

2 czerwca 2014

 ,  , 
1Monell Chemical Senses Center

W tym artykule

Podsumowanie

Wzorce aktywacji receptorów węchowych kodują tożsamość zapachu, ale brak opublikowanych danych identyfikujących ligandy zapachowe dla receptorów węchowych ssaków utrudnia opracowanie kompleksowego modelu kodowania zapachu. Protokół ten opisuje metodę ułatwiającą wysokoprzepustową identyfikację ligandów receptorów węchowych i ilościowe określenie aktywacji receptora.

Streszczenie

Odoranty tworzą unikalne i nakładające się na siebie wzorce aktywacji receptorów węchowych, pozwalając rodzinie około 1000 mysich i 400 ludzkich receptorów rozpoznać tysiące zapachów. Ligandy zapachowe zostały opublikowane dla mniej niż 6% ludzkich receptorów1-11. Ten brak danych wynika częściowo z trudności w funkcjonalnej ekspresji tych receptorów w systemach heterologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę ekspresji większości rodziny receptorów węchowych w komórkach Hana3A, a następnie wysokoprzepustową ocenę aktywacji receptorów węchowych za pomocą testu reporterowego lucyferazy. Test ten można wykorzystać do (1) przesiewania paneli substancji zapachowych przed panelami receptorów węchowych; (2) potwierdzić interakcję między nazapachem a receptorem za pomocą krzywych dawka-odpowiedź; oraz (3) porównać poziomy aktywacji receptorów między wariantami receptorów. W naszej próbie 328 receptorów węchowych zostało przebadanych pod kątem 26 substancji zapachowych. Pary odorant/receptor o różnych wynikach odpowiedzi zostały wybrane i przetestowane pod kątem odpowiedzi na dawkę. Dane te wskazują, że badanie przesiewowe jest skuteczną metodą wzbogacania o pary substancji zapachowej/receptora, które przejdą eksperyment z reakcją na dawkę, tj. receptory, które reagują na środek zapachowy w dobrej wierze. Dlatego ten wysokoprzepustowy test lucyferazy jest skuteczną metodą charakteryzowania receptorów węchowych - niezbędnym krokiem w kierunku modelu kodowania zapachu w układzie węchowym ssaków.

Wprowadzenie

System węchowy ssaków ma zdolność reagowania na ogromną liczbę bodźców zapachowych, co pozwala na wykrywanie i rozróżnianie tysięcy zapachów. Receptory węchowe (OR) to czujniki molekularne wyrażane przez węchowe neurony czuciowe w nabłonku węchowym12. Rozpoznawanie zapachu u ssaków następuje poprzez różnicową aktywację OR przez substancje zapachowe, a rodzina genów OR jest rozległa, z około 1000 mysich i 400 ludzkich receptorów12-16. Wcześniejsze analizy funkcjonalne OR w neuronach węchowych i komórkach heterologicznych wykazały, że różne substancje zapachowe są rozpoznawane przez unikalne, ale nakładające się na siebie zespoły OR10,17-20. Dopasowanie ligandów do OR ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia kodu węchowego i jest niezbędne do budowania realnych modeli węchu. Ze względu na trudności w ekspresji OR w układach heterologicznych, a także dużą liczbę zarówno nawaniaczy, jak i OR, dane te były w dużej mierze niedostępne w terenie; rzeczywiście, mniej niż 6% ludzkich OR ma opublikowany ligand1-11. Protokół ten opisuje zastosowanie testu lucyferazy do scharakteryzowania interakcji odorant/OR. Test ten umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę OR, co jest zadaniem niezbędnym do zrozumienia interakcji nawaniacz/sala operacyjna, a także opracowania modelu kodowania zapachów.

Wysokoprzepustowe badania ORs stoją przed trzema głównymi wyzwaniami. Po pierwsze, OR ulegały ekspresji w komórkach heterologicznych, a następnie ulegały degradacji w proteasomie21,22, zapobiegając interakcji OR z substancjami zapachowymi w systemie testowym23-25. Problem ten został rozwiązany poprzez odkrycie białek pomocniczych, które ułatwiają stabilną ekspresję na powierzchni komórki szerokiego zakresu OR19,26,27. Białka transportujące receptory 1 i 2 (RTP1 i 2) promują ekspresję i aktywację powierzchni komórki OR w odpowiedzi na stymulację odorantem19. Na podstawie tej pracy komórki HEK293T zmodyfikowano w celu stabilnej ekspresji RTP1 long (RTP1L) i RTP2, białka zwiększającego ekspresję receptora 1 i Gαolf, w wyniku czego powstała linia komórkowa Hana3A19,27. Ponadto receptor muskarynowy acetylocholiny typu 3 (M3-R) oddziałuje z OR na powierzchni komórki i zwiększa aktywację w odpowiedzi na substancje zapachowe26. Kotransfekcja OR z RTP1S i M3-R do komórek Hana3A powoduje solidną, spójną i funkcjonalną ekspresję szerokiego zakresu OR na powierzchni komórki27. Po drugie, repertuar sal operacyjnych ssaków jest dość duży. Na przykład u ludzi repertuar OR jest o rząd wielkości liczniejszy niż repertuar receptorów smakowych i o 2 rzędy wielkości liczniejszy niż repertuar receptorów wzrokowych. Chociaż klonowanie pojedynczego operatora operacyjnego jest stosunkowo prostym protokołem, wygenerowanie obszernej biblioteki wymaga znacznego wysiłku z góry. Po trzecie, chociaż wiemy, że w widzeniu długość fali przekłada się na kolor, a częstotliwość słyszenia przekłada się na wysokość dźwięku, organizacja zapachów jest słabo poznana, co utrudnia badaczom interpolację z reprezentatywnej próbki substancji zapachowych. Chociaż na tym froncie poczyniono pewne postępy10,28, mapa krajobrazu węchowego pozostaje niekompletna. Badania przesiewowe dziesiątek tysięcy cząsteczek pod kątem setek OR to trudne zadanie; Ekrany o wysokiej przepustowości w tej domenie wymagają starannie zdefiniowanych kampanii. Głównymi pozostałymi wyzwaniami są kwestie logistyczne i kosztowe, a nie problemy związane z tą techniką. Chociaż heterologiczne badania przesiewowe nie były powszechnie stosowane do identyfikacji ligandów przez grupy akademickie, prywatna firma wykorzystała tę samą technikę do identyfikacji ligandów dla 100 ludzkich OR 29. Niestety, dane te pozostają zastrzeżone.

Opisany tutaj test lucyferazy o wysokiej przepustowości ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami używanymi do oceny aktywacji OR. Chociaż odpowiedzi natywnych węchowych neuronów czuciowych zostały zmierzone za pomocą elektrofizjologii i obrazowania wapnia, techniki te mają trudności z odróżnieniem, który OR prowadzi do odpowiedzi neuronu ze względu na nakładanie się właściwości odpowiedzi dla neuronów węchowych. Chociaż wkłucie typu receptoraznakowanego GFP 30,31, dostarczenie specyficznych receptorów za pośrednictwem adenowirusa do mysich neuronów węchowych32,33 lub wykonanie RT-PCR po nagraniach17,24,33 może połączyć nagrania z pojedynczymi typami receptorów, metody te są niskoprzepustowe i nie nadają się do badań przesiewowych na dużą skalę. Heterologiczne systemy przesiewowe są bardziej skalowalne, a w literaturze można znaleźć dwie główne formy: reportery szlaku cAMP i reportery szlaku trifosforanu inozytolu (IP3). Po stymulacji zapachu OR aktywują kaskadę sygnalizacyjną transdukcjiG-αolf, która powoduje wytwarzanie cyklicznego AMP (cAMP)12. Poprzez kotransfekcję genu reporterowego lucyferazy świetlika pod kontrolą elementu odpowiedzi cAMP (CRE), produkcję lucyferazy można zmierzyć jako funkcję odpowiedzi na zapach, co pozwala na ilościowe określenie aktywacji OR. Aktywacja OR może być również powiązana ze szlakiem IP3 poprzez koekspresję białek G, takich jak Gα15/16 lub chimera Gα15-olf 24,25,34. Wybraliśmy przedstawiony tutaj test w oparciu o trzy czynniki: (1) koekspresja RTP1 z receptorami węchowymi znakowanymi Rho poprawia ekspresję receptorów węchowych na powierzchni komórki19,27; (2) zastosowanie genu reporterowego reagującego na cAMP pozwala na pomiar aktywacji OR przez kanoniczny drugi szlak przekaźnikowy; oraz (3) test dobrze nadaje się do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

Ten wysokoprzepustowy test lucyferazy ma zastosowanie do wielu badań cennych dla dziedziny węchu. Po pierwsze, duża liczba OR może być przesiewana pod kątem pojedynczego środka zapachowego w celu określenia wzorca aktywacji receptora dla określonego środka zapachowego. W tego typu badaniu zidentyfikowano OR7D4 jako salę operacyjną odpowiedzialną za odpowiedź na steroidowy środek zapachowy androstenon8. I odwrotnie, jedna sala operacyjna może być przesiewana pod kątem panelu substancji zapachowych w celu określenia profilu odpowiedzi receptora10. Gdy za pomocą tych ekranów zostaną zidentyfikowane pary zapachowo-nawaniaczy/sala operacyjna, interakcję można potwierdzić, przeprowadzając eksperyment z odpowiedzią na dawkę, badając reakcję sali operacyjnej na rosnące stężenia środka zapachowego. Krzywe dawka-odpowiedź mogą również ocenić, w jaki sposób zmienność genetyczna na sali operacyjnej wpływa na odpowiedź zapachową in vitro 8,9,11,35, a badania te można rozszerzyć na międzygatunkową zmienność OR, co pozwala na zbadanie ewolucji receptorów między gatunkami i mutacji przyczynowych w ewolucji36,37, Wreszcie, test ten można wykorzystać do badań przesiewowych pod kątem antagonistów zapachu, którzy są w stanie zantagonizować odpowiedź OR na określony zapach dla znanej pary zapachownik/receptor38,39. Podsumowując, ten wysokoprzepustowy test lucyferazy ma zastosowanie w szeregu badań, które pomogą scharakteryzować wzorce aktywacji OR i zapewnią lepsze zrozumienie kodowania zapachu w układzie węchowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek Hana3A

  1. Przygotuj pożywkę M10, uzupełniając minimalną niezbędną pożywkę (MEM) 10% (v/v) FBS.
  2. Utrzymanie kultury
    1. Utrzymuj komórki w pożywce M10. UWAGA: Wektory ekspresyjne dla RTP1L, RTP2, REEP1 i Gαolf nadają komórkom Hana3A oporność na puromycynę, ale utrzymanie komórek z tym antybiotykiem nie wpływa znacząco na wyniki testów.
    2. Subkultura w proporcji 1:8 na 10 cm naczynia co 2-3 dni.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

2. Komórki poszycia do transfekcji

  1. Odessać pożywkę ze 100% zlewającej się 10-centymetrowej płytki komórek Hana3A.
  2. Umyj komórki, dodając 10 ml PBS, obracając naczynie i zasysając PBS.
  3. Dodaj 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA i poczekaj, aż komórki się rozdzielą (około 1 minuta).
  4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml M10 i rozbij grudki komórek, rozcierając około 10 razy pipetą o pojemności 10 ml. Pipetę należy uważnie, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do podłoża.
  5. Na każdą 96-dołkową płytkę przenieść 1 ml komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 200 x g przez 5 minut i zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.
  6. Zawiesić komórki w 6 ml M10 na 1 ml komórek przeniesionych w kroku 2.5.
  7. Pobrać pipetę 50 μl komórek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

3. Transfekcja receptorów węchowych

  1. Przygotowanie plazmidowego DNA
    1. Przygotuj plazmidowe DNA za pomocą protokołu wolnego od endotoksyn. UWAGA: Użyj zestawów do przygotowania plazmidowego DNA oznaczonych jako "wolne od endotoksyn" lub dodaj etap ekstrakcji fenolowo-chloroformowej do protokołu przygotowania plazmidowego DNA.
    2. Rozcieńczyć DNA do stężenia 100 ng/μl w buforze TE.
  2. Obserwować posiane komórki (krok 2.7), aby zapewnić prawidłowe zlewanie się około 30-50% na studzienkę i wrócić do inkubatora. UWAGA: Chociaż ta konfluencja nie jest optymalna dla odczynnika do transfekcji lipidów, konfluencja 30-50% na tym etapie jest optymalna do pomiaru aktywności lucyferazy 24 godziny po transfekcji.
  3. Przygotowanie mieszanki transfekcyjnej
    1. Pipetować plazmidy RTP1S-pCI, M3-R-pCI, pCRE-luc i pSV40-RL do pożywki MEM zgodnie z objętościami wyszczególnionymi w Tabeli 1, aby wymieszać plazmid (podane objętości dotyczą płytki 96-dołkowej).
      Mieszanka plazmidu
      na studnięna płytkę 96-dołkową
      MEM--500 μl
      RTP1S-pCI5 ngów480 ng
      M3-R-pCI2,5 nga240 ng
      pCRE-luc10 ng960 ng
      pSV40-RL5 ngów480 ng

      Tabela 1. Składniki mieszanki plazmidowej. Na studzienkę i na 96-dołkową płytkę objętości RTP1S-pCI, M3-R-pCI, pCRE-luc i pSV40-RL oraz MEM.
    2. Dla każdej płytki 96-dołkowej rozcieńczyć 18 μl odczynnika do transfekcji lipidów w 450 μl pożywki MEM.
    3. Pipeta Mieszanina plazmidu (z kroku 3.3.1), receptor węchowy znakowany rodopsyną w plazmidzie pCI (Rho-OR-pCI) i mieszanina transfekcji lipidów (z kroku 3.3.2), aby uzyskać kompleks szczegółowo opisany w tabeli 2. Wymieszać roztwór przez rozcieranie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Zatrzymać reakcję, dodając M10 zgodnie z tabelą 2. UWAGA: ta reakcja jest zależna od czasu i nie powinna trwać dłużej niż 30 minut. Obliczenie studni + 10% jest ważne, aby zapewnić wystarczającą objętość dla kolejnych kroków.
      Złożony
      na studnięza studnię + 10%
      Mieszanka plazmidu4,2 μl4,58 μl
      Rho-OR-pCI0,05 ngsa0,06 ng
      Mieszanka transfekcji lipidów4,2 μl4,58 μl
      M1041,7 μl45,83 μl

      Tabela 2. Złożone komponenty. Na studzienkę i na studzienkę + 10% objętości mieszaniny plazmidowej (Tabela 1), plazmid receptora węchowego (Rho-OR-pCI) i mieszanina transfekcji lipidów. M10 dodaje się w celu wygaszenia reakcji po 15 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej.
  1. Wytrząśnij nośnik z płytek ogniw.
  2. Odpipetować pipetą 50 μl kompleksu do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

4. Stymulacja zapachowa

  1. Obserwuj transfekowane komórki, aby zapewnić prawidłową konfluencję 50-80% na studzienkę i wróć do inkubatora. UWAGA: Jeśli komórki są mniej niż 50% zlewające się, odczyty lucyferazy świetlika i lucyferazy renilla mogą być zbyt niskie, aby zmierzyć aktywację receptora. Rozważ wyrzucenie talerza.
  2. Przygotuj 1 M roztwory podstawowe każdego zapachu w DMSO.
  3. Przygotować roztwory stymulujące zapachy w podłożu CD293.
    1. W przypadku eksperymentów przesiewowych rozcieńczyć roztwór podstawowy o zapachu do 100 μM. Przygotuj również kontrolę bezzapachową (tylko CD293) w celu kontroli aktywacji w tle sali operacyjnej. UWAGA: W przypadku eksperymentów przesiewowych każda para OR/zapach jest testowana tylko raz na eksperyment. Ponieważ możliwa jest pewna dyfuzja zapachu w studzienkach, zaleca się stymulację jednym środkiem zapachowym na każdą płytkę.
    2. W przypadku eksperymentów z reakcją na dawkę należy przygotować siedem 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń roztworu podstawowego zapachu w trzech egzemplarzach, zaczynając od 1 mM dla każdego receptora. Przygotuj również te same rozcieńczenia zapachu w trzech egzemplarzach dla pustych komórek transfekowanych wektorami w celu kontroli aktywacji tła zapachu. UWAGA: W przypadku eksperymentów dotyczących reakcji na dawkę, każde badanie stężenia zapachu należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach.
  4. Wytrząśnij nośnik z płytek ogniw.
  5. Odpipetować pipetą 25 μl roztworu do stymulacji zapachów do każdego dołka i inkubować przez 4 godziny.

5. Pomiar aktywności OR za pomocą testu lucyferazy

  1. Zawiesić substrat lucyferazy świetlika zgodnie z instrukcjami producenta i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Rozmrozić 1 ml substratu lucyferazy świetlika na 96-dołkową płytkę.
  3. Przygotować świeży środek wygaszający reakcję lucyferazy świetlika i odczynnik substratu lucyferazy Renilla (5 μl substratu lucyferazy wygaszającej/lucyferazy Renilla na 1 ml buforu). UWAGA: Potrzeba około 1 ml odczynnika na płytkę 96-dołkową.
  4. Przygotuj czytnik mikropłytek luminescencyjnych. Otwórz oprogramowanie czytnika mikropłytek. W ikonie systemu:
    1. W zakładce "Podgrzewanie wstępne" zaznacz pole "WŁĄCZONE" i ustaw temperaturę urządzenia na 25 °C.
    2. W zakładce "Dozownik" napełnij każdy dozownik 1 000 μl 70% etanolu, a następnie 1 000 μl wody destylowanej. UWAGA: Do każdego dozownika należy używać oddzielnych porcji alkoholu i wody. Do dezynfekcji dozowników używa się etanolu, a woda usuwa resztki etanolu.
    3. Zalać każdy dozownik 1 500 μl powietrza (wyjąć dozowniki z płynu). UWAGA: zalewanie powietrzem zapewnia, że substraty lucyferazy nie są rozcieńczane resztkową wodą.
    4. Zalać dozownik 1 1,080 μl substratu lucyferazy świetlików (od kroku 5.2). Zalać dozownik 2 substratem lucyferazy Renilla (od kroku 5.3). UWAGA: Uważaj, aby nie zanieczyścić krzyżowo substratów lucyferazy. Zalewanie substratami lucyferazy wypełnia martwą przestrzeń w dozownikach odczynników.
  5. Skonfiguruj następujący protokół, aby odczytywać luminescencję lucyferazy świetlika i Renilla. W oprogramowaniu powiązanym z czytnikiem mikropłytek, w menu "Plik" kliknij "Nowe zadanie". Zaznacz "Protokoły" i kliknij "Utwórz nowy". W kolejnym oknie należy zaznaczyć kółko obok "Standard Protocol". Kliknij "OK". Kliknij dwukrotnie "Procedura" po lewej stronie ekranu.
    1. Dozuj 10 μl substratu lucyferazy świetlików do wszystkich studzienek za pomocą dozownika 1. W menu "Akcje" kliknij "Dozuj". W oknie "Etap dozowania" ustaw: "Dozownik" na 1, "Zalewanie" na brak, "Objętość dozowania" na 10 μl i "Szybkość" na 225 μl/sek. Kliknij "OK".
    2. Potrząsaj płytką przez 30 sekund. W menu "Akcje" kliknij "Potrząśnij". W oknie "Shake Step" ustaw "Intensywność" na Średni i "Czas trwania" na 0:30 MM:SS. Kliknij "OK".
    3. Odczytaj luminescencję wszystkich studzienek przez 0,5 sekundy na studzienkę. W menu "Akcje" kliknij "Przeczytaj". W oknie "Krok odczytu" ustaw: "Metoda wykrywania" na Luminescencja, "Typ odczytu" na Punkt końcowy, "Czas integracji" na 0:00:50 MM:SS:ss, "Zestawy filtrów" na 1, "Emisja" na Otwór, "Pozycja optyki" na Górę, "Wzmocnienie" na 135 i "Wysokość odczytu" na 1,00 mm. Kliknij "OK".
    4. Dozować 10 μl substratu lucyferazy Renilla do wszystkich studzienek za pomocą dozownika 2. Ustaw warunki jak w kroku 5.6.1, z wyjątkiem ustawienia "Dozownik" na 2.
    5. Potrząsaj płytką przez 30 sekund. Ustaw warunki jak w kroku 5.6.2.
    6. Odczytaj luminescencję wszystkich dołków przez 0,5 sekundy na studzienkę. Ustaw warunki jak w kroku 5.6.3.
  6. Zdjąć pokrywkę z płytki 96-dołkowej i umieścić ją w czytniku mikropłytek. Uruchom program skonfigurowany w kroku 5.5, aby odczytać luminescencję płyty.
  7. Wyczyść pompy dozownika odczynników. Z ikony systemu w zakładce "Dyspenser":
    1. Usuń 1,000 μl substratu lucyferazy świetlika z dozownika lucyferazy świetlika do probówki regeneracyjnej. UWAGA: Lucyferazy świetlika można przechowywać w temperaturze -80 °C i ponownie wykorzystać.
    2. Zalać każdy dozownik 1 000 μl wody destylowanej, następnie 1 000 μl 70% etanolu, a na końcu 1 500 μl powietrza (wyjąć dozowniki z płynu). UWAGA: Woda usuwa substraty lucyferazy z pomp odczynników, etanol dezynfekuje, a powietrze suszy wszelkie pozostałości etanolu.

6. Analiza danych

  1. Eksport danych
    1. W oprogramowaniu czytnika mikropłytek kliknij dwukrotnie na "Kreatory raportów/eksportu" po lewej stronie ekranu.
    2. Kliknij przycisk "Nowy eksport do Excela" i kliknij "OK".
    3. Podświetl Eksport1 i kliknij "Edytuj".
      1. W sekcji "Zawartość" zaznacz "Opis systemu", "Procedura", "Opis tablicy" i "Matryca układu płyt". Uwzględnij "Surowe dane" i "Obliczone dane".
      2. W sekcji "Przepływ pracy" zaznacz "Automatyczne wykonywanie po zakończeniu procedury". W trybie eksportu zaznacz "Wszystkie płyty w tym samym skoroszycie" i "Jako nowy arkusz".
      3. W sekcji "Plik" wybierz format nazwy pliku i lokalizację pliku, a następnie kliknij "OK".
      4. Zamknij okno "Kreatory raportów/eksportu".
  2. Aby uzyskać znormalizowane wartości lucyferazy, podziel odczyt luminescencji lucyferazy świetlika dla każdej studzienki (Krok 5.6.3) przez odczyt luminescencji Renilla dla każdej studzienki (Krok 5.6.6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W ramach wstępnego przesiewu przetestowano 328 receptorów węchowych (OR) w obecności 26 zapachów o stężeniu 100 µM. Wykazano, że takie stężenie substancji zapachowych skutecznie aktywuje znaczną część receptorów OR o znanych ligandach10. W pierwszej kolejności obliczono znormalizowaną aktywność lucyferazy, dzieląc odczyt lucyferazy świetlikowej przez odczyt lucyferazy Renilla. Następnie wyznaczono wartości bazowe poprzez odjęcie znormalizowanych odczytów lucyferazy dla kontroli bez zapachu od znormali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tożsamość substancji zapachowej jest kodowana przez wzorce aktywacji receptorów węchowych, ale wzorce aktywacji receptorów, w tym które receptory są aktywowane i w jakim stopniu, są znane dla mniej niż 6% ludzkich receptorów węchowych1-11. Wysiłki zmierzające do scharakteryzowania receptorów węchowych zostały ograniczone przez ich pracochłonne metody lub możliwość zastosowania tylko do podzbioru rodziny receptorów węchowych17,23,24,33,34. Heterologiczny system ekspresji Hana3A wspiera solidną ekspre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez R01 DC013339, R03 DC011373 oraz Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. Część prac została wykonana przy użyciu Monell Chemosensory Receptor Signaling Core, który jest częściowo wspierany przez finansowanie z NIH-NIDCD Core Grant P30 DC011735. Autorzy dziękują C. Sezille za pomoc w zbieraniu danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ogniwa Hana3ADostępne w Laboratorium Matsunami na żądanie
RTP1S-pCIDostępne w Laboratorium Matsunami na żądanie
M3-R-pCIDostępne w Laboratorium Matsunami na życzenie
pCRE-lucAgilent219076LUC
pSV40-RLPromegaE2231RL
Minimum Essential Media, EagleSigma AldrichM4655MEM
FBSLife Technologies16000-044FBS
PBS (bez Ca2+ i Mg2+)Cellgro21-040-CVa href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS
Trypsin (0,05% trypsyny EDTA)Life Technologies25300Trypsin
CD293Life Technologies11913-019CD293
96-well PDL biała/przezroczysta płytkaBD BioCoat356693plates
Odczynnik do transfekcji lipidów: Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019LipofectamineSubstrat
lucyferazy świetlika, wygaszacz lucyferazy świetlika/Renilla substrat lucyferazy: Test Dual-GloPromegaE2980dual glo
Synergy S2 BioTekSLADa href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">Oprogramowanie do czytnika BioTek S2
Microplate: Oprogramowanie do analizy danychGen5 BioTekGen5Gen5
BIOSTACKBioTekBIOSTACK2WRBioStack
MultifloBioTekMFPMultiFlo
300 μ l GripTipsIntegra4433GripTips
12.5 μ l GripTipsIntegra4414GripTips
300 μ l GripTips ViaFlo96Integra6433XYZ końcówki
12.5 μ l GripTips 384 XYZIntegra6403XYZ tips
384ViaFloIntegra6030384ViaFlo
TE bufferMacherey Nagel740797.1
DMSOSigma AldrichD2650-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en& region=US">DMSO
ForskolinEnzo Life SciencesBML-CN100-0010FOR
<<<

Bibliografia

  1. Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  2. Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
  3. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  4. Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
  5. Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
  6. Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
  7. Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
  8. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
  9. Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
  10. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
  11. Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
  12. DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
  13. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
  14. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
  15. Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87(2008).
  16. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
  17. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  18. Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
  19. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  20. Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
  21. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
  22. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
  23. Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  24. Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  25. Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
  26. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
  27. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
  28. Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
  29. Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
  30. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  31. Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  32. Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  33. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  34. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
  35. McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  36. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
  37. Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
  38. Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
  39. Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
  40. Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
  41. Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
  42. Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja receptor w w chowychtest reporterowy lucyferazyprzesiewanie wysokoprzepustowekom rki Hana3Aprotok transfekcjistymulacja odorantamianaliza zale no ci dawka odpowiedlucyferaza wietlikalucyferaza waniliowaczytnik mikrop ytek
Wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.