System hodowli ex vivo do badania rozwoju tarczycy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje sekcję zarodkowego anlagenu tarczycy myszy i hodowlę eksplantatów na półporowatych filtrach lub na plastikowych szkiełkach mikroskopowych. System ten idealnie nadaje się do badania zdarzeń morfogenetycznych lub różnicowania zachodzących podczas rozwoju tarczycy zarodków typu dzikiego lub zarodków z nokautem i jest podatny na eksperymenty dotyczące przyrostu i utraty funkcji.

Streszczenie

Tarczyca to dwuwydzielniczy gruczoł dokrewny zlokalizowany u podstawy szyi, produkujący hormony tarczycy T3, T4 i kalcytoninę. T3 i T4 są wytwarzane przez zróżnicowane tyreocyty, zorganizowane w zamknięte kule zwane pęcherzykami, podczas gdy kalcytonina jest syntetyzowana przez komórki C, przeplatane między pęcherzykami a gęstą siecią naczyń włosowatych krwi. Chociaż architektura i funkcje tarczycy u dorosłych osób zostały szeroko opisane i zbadane, tworzenie jednostek "angio-pęcherzykowych", rozmieszczenie komórek C w miąższu i komunikacja parakrynna między komórkami nabłonka i śródbłonka jest dalekie od zrozumienia.

Ta metoda opisuje sekwencyjne etapy rozwarstwiania mysiego embrionalnego anlagenu tarczycy i jego hodowli na półporowatych filtrach lub na plastikowych szkiełkach mikroskopowych. W ciągu czterech dni ten system hodowli wiernie odwzorowuje rozwój tarczycy in vivo. Rzeczywiście, (i) występuje dwupłatowość narządu (w przypadku eksplantatów e12,5), (ii) prekursory tyreocytów organizują się w pęcherzyki i polaryzują, (iii) tyreocyty i komórki C różnicują się oraz (iv) komórki śródbłonka obecne w mikrowypreparowanej tkance namnażają się, migrują do płatów tarczycy i ściśle łączą się z komórkami nabłonka, tak jak robią to in vivo.

Tkanki tarczycy można uzyskać z dzikich zarodków transgenicznych typu knockout lub fluorescencyjnego. Co więcej, kulturą eksplantatów można manipulować poprzez dodawanie inhibitorów, przeciwciał blokujących, czynników wzrostu, a nawet komórek lub kondycjonowanej pożywki. Rozwój ex vivo może być analizowany w czasie rzeczywistym lub w dowolnym momencie hodowli za pomocą barwienia immunologicznego i RT-qPCR.

Podsumowując, hodowla eksplantatów tarczycy w połączeniu z obrazowaniem całego montażu lub na odcinkach i profilowaniem ekspresji genów dostarcza potężnego systemu do manipulowania i badania morfogenetycznych i różnicujących zdarzeń organogenezy tarczycy.

Wprowadzenie

Tarczyca jest zbiorem niezależnych sfer nabłonkowych, zwanych pęcherzykami, otoczonych gęstą siecią naczyń włosowatych śródbłonka. Ta organizacja umożliwia funkcjonowanie tarczycy: naczynia włosowate śródbłonka dostarczają tyreocytom jodu, niezbędnego do syntezy hormonów T3 i T4, i rozprowadzają te ostatnie po całym ciele. Rozproszone między pęcherzykami i naczyniami włosowatymi komórki C wytwarzają hormon hipokalcemiczny, kalcytoninę¹. Chociaż architektura i funkcje tarczycy u dorosłych są dobrze znane, mechanizmy komórkowe i molekularne zaangażowane w rozwój embrionalny tarczycy (tworzenie i różnicowanie pęcherzyków) są dalekie od zrozumienia.

Podczas embriogenezy, przodek tyreocytów powstaje jako zgrubienie (anlage linii środkowej) ściany brzusznej endodermy jelita przedniego w dniu embrionalnym (e) 8,5 u zarodka myszy, podczas gdy przodkowie komórek C powstają w e11,5 jako wypukłości w kształcie kropelek (ciała ultimobranchialne) czwartych woreczków gardłowych^2-6. Pączek linii środkowej następnie odłącza się od endodermy, rozszerza się obustronnie, aby połączyć się w e13,5 z ciałami ultimobranchialnymi po obu stronach tchawicy. Wreszcie tyreocyty organizują się w pęcherzyki, a komórki C różnicują się.

Obecna wiedza na temat tworzenia się tarczycy pochodzi głównie z analizy histologicznej stałych tkanek, ale zdarzenia morfogenetyczne związane z tworzeniem się tarczycy są bardzo dynamiczne i obejmują komunikację i interakcje między różnymi typami komórek oraz z macierzą zewnątrzkomórkową. Niedawne prace wykazały, że komórki progenitorowe tyreocytów wytwarzają wysoki poziom VEGF w celu rekrutacji komórek śródbłonka do rozwijającej się tarczycy, a z kolei rekrutowane komórki śródbłonka sprzyjają tworzeniu pęcherzyków i różnicowaniu komórek C⁷.

Większość badań ex vivo nad tarczycą została przeprowadzona na izolowanych dorosłych komórkach pochodzących z tarczycy, hodowanych na plastikowych szalkach do hodowli tkanek 2D lub w matrycach 3D. Korzystając z tego typu hodowli, zróżnicowane komórki pęcherzykowe albo pozostają spolaryzowane i zorganizowane jako pęcherzyki, albo ponownie uzyskują organizację 3D^8-10. Jednak te czyste komórki nabłonkowe, wyprowadzone ze środowiska fizjologicznego i hodowane w 2D, ignorują interakcje z macierzą zewnątrzkomórkową, cytokinami, czynnikami wzrostu i innymi typami komórek, takimi jak komórki śródbłonka lub nerwy, z którymi normalnie spotykają się in vivo. Bardzo fajne badanie opisało niedawno protokół różnicowania komórek ES w pęcherzyki tarczycy przy użyciu końcowego etapu hodowli w matrycy^{3D 11}. Jednak te kultury 3D nie mają kontaktu z innymi typami komórek.

Na podstawie wcześniejszych ekspertyz na temat hodowli narządów trzustki i gruczołów ślinowych^12-14, opracowano metodę preparowania mysich embrionalnych anlagenów tarczycy i hodowli eksplantatów na półporowatych filtrach lub na plastikowych szkiełkach mikroskopowych.

Podczas pracy z embrionami e12.5, podwójne pochodzenie anlagenu tarczycy (linia środkowa i dwa boczne ciała ultimobranchialne) narzuciło mikrodysekcję dużego fragmentu tkanki. Zawierał on tchawicę, ale nie przełyk i rozciągał się od tętnic łuku gardłowego aż do obrzęku arytenoidalnego. Podczas hodowli na filtrach, anlage linii środkowej rozciąga się bocznie po każdej stronie tchawicy, gdzie łączą się z ciałami ultimobranchialnymi, tworząc dwa płaty tarczycy, nadal połączone wąskim przesmykiem.

W hodowli komórki nabłonkowe namnażają się, organizują w pęcherzyki i różnicują w tyreocyty i komórki C, w zależności od ich pochodzenia. Komórki śródbłonka zawarte w mikrowypreparowanej tkance również namnażają się i atakują płaty tarczycy, aby ostatecznie ściśle związać się ze strukturą pęcherzyków nabłonkowych, niezależnie od przepływu krwi czy czynników krążących. Ponieważ rozwój eksplantatów wiernie odzwierciedla rozwój in vivo, ten system hodowli jest optymalny do badania zdarzeń morfogenetycznych i różnicowania zachodzących podczas rozwoju tarczycy.

Tkanki tarczycy mogą być uzyskane z dzikich zarodków transgenicznych, nokautujących lub fluorescencyjnych, a system hodowli jest podatny na eksperymenty z utratą i zyskiem funkcji. Wreszcie, obrazowanie poklatkowe znakowanych fluorescencyjnie eksplantatów tarczycy na plastikowych naczyniach mikroskopowych może zostać wykorzystane do lepszego zbadania kinetyki i ciągłości ruchów morfogenetycznych zachodzących in vivo. Obrazowanie poklatkowe zostało już wykorzystane do badania rozgałęzionej morfogenezy trzustki^15,16 lub zawiązka moczowodu¹⁷.

Protokół

Myszy były hodowane i leczone zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi Uniwersyteckiego Komitetu ds. Dobrostanu Zwierząt. Wszystkie procedury i protokoły zostały zatwierdzone przez ten Komitet.

1. Powlekanie mikroskopowych komór do hodowli tworzyw sztucznych

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Te dwa rodzaje powłok są funkcjonalnie równoważne.

1. Plastikowe komory hodowlane należy pokryć fibronektyną na dzień przed izolacją tkanek tarczycy:
   1. Rozcieńczyć sterylną fibronektynę do końcowego stężenia 50 μg/ml w pożywce M199 uzupełnionej 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml fungizonu i 2 mM glutaminy¹².
   2. Przykryć studzienki 200 μl rozcieńczonej fibronektyny i inkubować przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C.
   3. W dniu sekcji należy odessać fibronektynę, przepłukać studzienki raz M199 i dodać minimalną objętość 200 μl M199 uzupełnioną antybiotykami, glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą.
   4. Pozostaw powlekane komory w inkubatorze, aż będą gotowe do ułożenia eksplantatów.
2. Pokryj plastikowe komory hodowlane kolagenem typu I na 2 godziny przed izolacją tkanek tarczycy:
   1. Rozcieńczyć sterylny kolagen typu I do końcowego stężenia 50 μg/ml w 10 mM HCl. UWAGA: Roztwór podstawowy kolagenu należy przechowywać na lodzie.
   2. Przykryj studzienki 200 μl rozcieńczonego kolagenu typu I i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
   3. Odessać roztwór kolagenu typu I, przepłukać studzienki raz M199 i dodać minimalną objętość 200 μl M199 uzupełnioną antybiotykami, glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą.
   4. Pozostaw powlekane komory w inkubatorze, aż będą gotowe do ułożenia eksplantatów.

2. Rozwarstwienie tkanek zawierających anlagen tarczycy (e12.5) lub płatów tarczycy (e13.5-e14.5)

UWAGA: Używaj czystych narzędzi do preparowania i płytek Petriego/kulturowych. Ogólne etapy i nacięcia opisane poniżej są takie same dla zarodków e12.5 i e14.5.

1. Uśmierc samice myszy w ciąży w czasie w pożądanym dniu embrionalnym (e) (od e12,5 do e14,5) i usuń macicę za pomocą narzędzi preparacyjnych.
2. Umieść wypreparowaną macicę w 10-centymetrowej płytce zawierającej HBSS.
3. Przytrzymaj jeden koniec macicy kleszczami i otwórz macicę małymi nożyczkami, aby stopniowo uwalniać wszystkie zarodki.
4. Oddzielić zarodki od łożyska nożyczkami i przenieść zarodki wraz z ich błonami pozazarodkowymi na nową 10-centymetrową płytkę zawierającą HBSS.
5. Usuń woreczek żółtkowy i owodnię. UWAGA: Od tego momentu pracuj pod mikroskopem stereoskopowym z transoświetleniem od dołu; zwiększanie powiększenia z krokami sekcji. Użyj igieł wolframowych w szklanych naczyniach włosowatych jako narzędzi preparacyjnych.
6. Za pomocą igieł, takich jak nóż i widelec, usuń górną część głowy, w tym górną szczękę i uszy (ryc. 1A, przeciąć wzdłuż).
7. Przytrzymaj zarodek na plecach i usuń najpierw dodatkowy kawałek cewy nerwowej (ryc. 1A, przecięty wzdłuż b), a następnie dolną część zarodka, tuż pod kończynami przednimi i powyżej serca (ryc. 1B).
8. Przenieść wycinek zarodka zawierający język (w celu orientacji tkanki) i okolicę szyi na nową 10-centymetrową płytkę zawierającą HBSS.
9. Usuń cewę nerwową i tkanki znajdujące się za przełykiem/tchawicą (ryc. 1C, przeciąć wzdłuż a).
10. Delikatnie pokrój plasterek tkanki wzdłuż obu stron języka (ryc. 1C, przeciąć wzdłuż b i b').
11. Zlokalizuj przełyk i tchawicę w przedłużeniu języka i wypreparuj język, pozostawiając obrzęk arytenoidalny (ryc. 1D, przecięty wzdłuż a) oraz tkankę po obu stronach przełyku/tchawicy (ryc. 1D, przecięty wzdłuż b i b').
12. Usuń przełyk i umieść tchawicę brzuszną stroną skierowaną do góry.
13. Wypreparuj niepożądane tkanki, takie jak grasica (ryc. 1E) i wszystkie tkanki znajdujące się bocznie do tętnic łuku gardłowego. W przypadku zarodków e13.5 lub e14.5 uwidocznij płaty tarczycy po obu stronach tchawicy (ryc. 1F; czerwone przerywane linie) i dalej wypreparuj płaty z tchawicy.
14. Przenieś wyizolowany region tchawicy e12,5 lub płaty tarczycy e13,5-e14,5 na płytkę hodowlaną o średnicy 35 mm zawierającą wstępnie podgrzaną pożywkę M199 uzupełnioną antybiotykami, glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą. Przenieś eksplantaty za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki filtra na mikropipecie P-200. W przypadku eksplantatów e12.5 odetnij koniec końcówki, aby poszerzyć otwór. UWAGA: Rutynowo, jeśli zarodki mają ten sam genotyp, wykonaj kroki 6 i 7 na wszystkich zarodkach, następnie 9-11, a na końcu 12 i 13.

3. Poszycie i hodowla eksplantatów tarczycy

1. Umyć eksplantaty przez kolejne przeniesienie do trzech dołków 24-dołkowej płytki zawierającej 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (= M199 uzupełnionej antybiotykami, glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą).
2. Posiewanie płatów tarczycy w mikroskopowych komorach hodowlanych z tworzywa sztucznego do mikroskopii powlekanej:
   1. Odessać pożywkę hodowlaną M199 z powlekanych komór.
   2. Ostrożnie przenieś eksplantaty tarczycy do komór hodowlanych za pomocą mikropipety i końcówek filtrujących. Umieść jedną eksplantację na środku każdej komory.
   3. Usunąć nadmiar pożywki i umieścić komorę hodowlaną w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C; 5% CO₂ ) na 2 godziny, aby eksplantaty mogły przyłączyć się do matrycy.
   4. Delikatnie dodaj od 200 do 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki.
   5. Inkubować w celu długotrwałej hodowli w inkubatorze do hodowli tkankowych.
3. Poszycie okolicy tchawicy lub płatów tarczycy na filtrach półporowatych:
   1. Wypełnić wymaganą liczbę studzienek 24-dołkowej płytką 330 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
   2. Umieść filtry (np. filtr miliporowy 0,4 μm) na pożywce, uważając, aby nie utknąć pęcherzyków powietrza poniżej filtra hodowlanego.
   3. Ostrożnie, za pomocą mikropipety i końcówek filtrujących, przenieś eksplantaty tarczycy z minimalną objętością pożywki na środek filtrów (maksymalnie 4/filtr).
   4. Usuń nadmiar pożywki i rozłóż eksplantaty za pomocą wolframowej igły.
   5. Inkubować w celu długotrwałej hodowli w inkubatorze do hodowli tkankowych. UWAGA: Zmieniaj pożywkę hodowlaną co drugi dzień pod okapem z przepływem laminarnym. Hoduj eksplantaty do 7 dni.

4. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego dla eksplantatów tarczycy

Usuń eksplantaty wyhodowane na filtrach (po kroku 2 poniżej) za pomocą igieł wolframowych lub cienkich kleszczyków i przenieś do płytki 24-dołkowej dla wszystkich etapów, z wyjątkiem pierwotnej (krok 5) i wtórnej (krok 7) inkubacji przeciwciał (płytka 96-dołkowa). W przypadku przylegających eksplantatów hodowanych w plastikowych komorach mikroskopowych, należy wykonać wszystkie czynności w komorach hodowlanych.

1. Odessać pożywkę hodowlaną M199 i utrwalić eksplant lodowatym 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut (500 μl w naczyniu 24-dołkowym i 300 μl w szkiełkach mikroskopowych).
2. Przemyć 2x 10 min w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris z Tritonem (TBST; 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100) w temperaturze pokojowej.
3. Eksplantaty należy natychmiast przetworzyć lub przechowywać w temperaturze -20 °C. UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C, należy odwodnić eksplantaty w metanolu, stopniowo zwiększając stężenie metanolu w TBST, aby osiągnąć 100% metanolu. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania barwienia immunologicznego (krok 4), ponownie nawodnij eksplantaty, stopniowo dodając TBST do metanolu.
4. Zastąp TBST roztworem blokującym (10% normalnej koziej surowicy w TBST) i inkubuj na kołysce piły morskiej przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.
5. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym (100-200 μl na warunek). Przenieś eksplantaty "filtrujące" z płytki 24-dołkowej do płytki 96-dołkowej. Inkubować eksplantaty z pierwszorzędowymi przeciwciałami na kołysce do piły morskiej przez noc w temperaturze 4 °C.
6. Następnego dnia wyrzuć pierwotny roztwór przeciwciała, przenieś eksplantaty "filtrujące" z powrotem do 24-dołkowej płytki i przemyj co najmniej pięć razy TBST na kołysku piły morskiej przez 45-60 minut każdy w temperaturze pokojowej.
7. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (np. Goat anty-X-Alexa Fluor w rozcieńczeniu 1:2,000) w TBST zawierającym 1% normalnej surowicy koziej i inkubować eksplantaty w tym rozcieńczeniu przez noc na bujaku do piły morskiej w temperaturze 4 °C i w ciemności. W celu barwienia przeciwstawnego jądrowego należy dodać 1 μg/ml bis-benzimidu (Hoechst) razem z roztworem przeciwciała drugorzędowego.
8. Następnego dnia wyrzuć wtórny roztwór przeciwciała i przemyj 5x TBST na kołysce piły morskiej przez 45-60 minut w temperaturze pokojowej. Podczas prania trzymaj eksplantaty w ciemności.
9. Wykonaj dodatkowe pranie w TBST, delikatnie mieszając przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.
10. Postfix wybarwione immunologicznie eksplantaty w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 10 min.
11. Myć 2x 10 min z TBST.
12. Eksplantaty należy stopniowo przenosić w 100% metanolu do długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C lub natychmiast poddać analizie. W przypadku eksplantatów hodowanych na filtrach i barwionych immunologicznie na 24-dołkowej płytce, przed analizą za pomocą mikroskopu wielofotonowego lub konfokalnego należy przenieść je do komory mikroskopowej (np. LabTek lub Ibidi) z TBST lub lepszym fluorescencyjnym podłożem montażowym.

5. Ekstrakcja RNA z tarczycy

Pracuj w środowisku wolnym od RNaz. Dlatego należy używać końcówek do pipet wolnych od kwasów nukleinowych i nukleaz oraz czyścić zarówno stół, jak i sprzęt z zanieczyszczeń i RNaz. Protokół ten opiera się na fenolu / chloroformie, wykonaj pierwsze kroki (od 1 do 7) pod maską chemiczną.

1. Homogenizować jeden eksplant tarczycy lub dwa płaty tarczycy za pomocą 300 μl roztworu do ekstrakcji RNA za pomocą jednorazowego tłuczka do probówki o pojemności 1,5 ml. Pomiędzy próbkami umyj tłuczek w 2% SDS, następnie w wodzie, a następnie w etanolu.
2. Dodać kolejne 100 μl roztworu do ekstrakcji RNA, wirować przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
3. Wiruj przez 30 sekund i dodaj 20 ng tRNA do każdej próbki.
4. Wirować przez 1 minutę i dodać 80 μl chloroformu.
5. Wirować energicznie przez 30 sekund i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wirować przez 15 minut przy 19 000 x g w wirówce z chłodzeniem (4 °C).
7. Ostrożnie przenieść bezbarwną górną fazę wodną do świeżej probówki zawierającej 20 μg glikogenu jako współstrącacza.
8. Odwiruj i dodaj 200 μl 100% alkoholu izopropanolowego.
9. Wiruj energicznie przez 15-30 sekund i pozwól RNA wytrącić się w temperaturze -20 °C przez 2-3 godziny lub w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.
10. Wirować przez 30 minut w temperaturze 19 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
11. Umyj granulat 450 μl zimnego 75% etanolu i odwiruj, aby usunąć osad.
12. Wirować przez 10 minut w temperaturze 19 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
13. Suszyć pellet pod maską przez 5 minut.
14. Zawiesić osad w 10 μl wody wolnej od RNaz i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
15. Oznaczenie stężenia RNA, przechowywać w temperaturze -80 °C lub dokonać odwrotnej transkrypcji w celu analizy ekspresji genów.

Wyniki

Naczynia tarczycowe (linia środkowa i UB, wraz z otaczającymi tkankami) oraz płaty tarczycy są wycinane z zarodków myszy odpowiednio na e12.5 i e13.5/e14.5 (Rysunek 1). Po jednym dniu w hodowli na filtrze, anlage linii środkowej jest widoczny (ryc. 2A) jako wydłużona tkanka rozciągająca się na wierzchu tchawicy. Stopniowo tworzy dwa płaty po każdej stronie tchawicy. Jeśli izolowane płaty tarczycy (e13.5 lub e14.5) zostaną wyhodowane, rozszerzą się, ulegną morfogenezie, a komórki nabłonko...

Dyskusja

W artykule opisano metodę preparowania i hodowli eksplantatów tarczycy (e12.5) lub płatów (e14.5) w celu zbadania i lepszego zrozumienia złożonych zdarzeń prowadzących do powstania tarczycy. Ze względu na podwójne pochodzenie anlagenu tarczycy (anlage w linii środkowej i dwa boczne ciała ultimobranchialne) oraz ich niewielkie rozmiary, mikropreparuje się fragment tkanki e12,5 zlokalizowany rostralnie do tętnic łuku gardłowego i zawierający tchawicę, ale nie przełyk. Jak pokazano, w ciągu czterech dni ten system hodowli w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
µ-slide 8 well, ibiTreat, hodowla tkankowa poddana zabiegowi, sterylna	proxylab	80826
Kolagen typu I, ogon szczura	Millipore	08-115
Fibronektyna z ludzkiego osocza	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Drut wolframowy	Goodfellow	LS237450
wkładka do płytki hodowlanej (średnica 12 mm)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-kadheryna	BD Biosciences	610182	1/1,000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261