Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym

Summary

Ten manuskrypt opisuje protokół, który stosuje kompleksowe profilowanie do analizy programów transkrypcyjnych indukowanych w określonych jądrach mózgowych gryzoni zgodnie z paradygmatami behawioralnymi. W niniejszym artykule podejście to zostało zilustrowane w kontekście profilowania genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę, z wykorzystaniem mikroprzepływowych macierzy qPCR.

Abstract

Kodowanie doświadczeń w mózgu i konsolidacja długotrwałych wspomnień zależy od transkrypcji genów. Identyfikacja funkcji określonych genów w kodowaniu doświadczenia jest jednym z głównych celów neuronauki molekularnej. Co więcej, funkcjonalne powiązanie zdefiniowanych genów z określonymi zachowaniami ma implikacje dla zrozumienia podstaw zaburzeń neuropsychiatrycznych. Indukcję solidnych programów transkrypcyjnych zaobserwowano w mózgach myszy po różnych manipulacjach behawioralnych. Podczas gdy niektóre elementy genetyczne są wykorzystywane cyklicznie po różnych manipulacjach behawioralnych i w różnych jądrach mózgu, programy transkrypcyjne są ogólnie unikalne dla bodźców indukujących i struktury, w której są badane^1,2.

W tej publikacji opisano protokół solidnego i wszechstronnego profilowania transkrypcyjnego z jąder mózgowych myszy w odpowiedzi na manipulację behawioralną. Protokół ten został zademonstrowany w kontekście analizy dynamiki ekspresji genów w jądrze półleżącym po ostrym doświadczeniu z kokainą. Po zdefiniowanym doświadczeniu in vivo docelowa tkanka nerwowa jest preparowana; następnie oczyszczanie RNA, odwrotna transkrypcja i wykorzystanie macierzy mikroprzepływowych do kompleksowej analizy qPCR wielu docelowych genów. Protokół ten jest nastawiony na kompleksową analizę (obejmującą 50-500 genów) ograniczonych ilości materiału wyjściowego, takiego jak małe próbki mózgu, a nawet pojedyncze komórki.

Protokół jest najkorzystniejszy do równoległej analizy wielu próbek (np. pojedynczych komórek, dynamicznej analizy po perturbacjach farmaceutycznych, wirusowych lub behawioralnych). Jednak protokół może również służyć do charakterystyki i zapewnienia jakości próbek przed badaniami całego genomu za pomocą mikromacierzy lub RNAseq, a także walidacji danych uzyskanych z badań całego genomu.

Introduction

Dynamiczna organizacja mózgu umożliwia elastyczność poznawczą i behawioralną. Doświadczenia są kodowane poprzez modyfikacje struktury i siły połączeń między neuronami w mózgu³. Ta "plastyczność zależna od doświadczenia" jest wynikiem indukcji określonych wzorców ekspresji genów, które dostarczają białek niezbędnych do modyfikacji struktury i siły synaptycznej⁴. Identyfikacja sieci regulacyjnych genów pośredniczących w tworzeniu wspomnień długotrwałych jest centralnym założeniem neuronauki molekularnej, z oczekiwaniem, że identyfikacja dominujących elementów programów transkrypcyjnych zapewni wgląd w podstawowe zasady regulujące tworzenie pamięci, a także cele w leczeniu zaburzeń neurodegeneracyjnych i neuropsychiatrycznych. Programy transkrypcyjne rozwijają się w określonych czasowo falach, z których każda koduje geny o innym charakterze, które są ważne dla różnych etapów realizacji wyniku zdarzenia sygnalizacyjnego^1,2. Dlatego ważne jest, aby zająć się dynamiką transkrypcji w szczegółowej skali czasowej, aby zidentyfikować pełny zestaw indukowanych genów i uzyskać wgląd w ich potencjalną funkcję zgodnie z dynamiką ich indukcji.

Uzależnienie od narkotyków to silna forma plastyczności zależnej od doświadczenia, spowodowana długotrwałym wpływem narkotyków na obwody nerwowe w mózgu^5,6. Początkowe, ostre narażenie na narkotyki może prowadzić do rozwoju uzależnienia i przejścia do przewlekłego używania. Informacje kontekstowe są kluczowym elementem w rozwoju uzależnienia. Sygnały środowiskowe związane z narkotykami mają duże znaczenie w umysłach osób nadużywających narkotyków. Informacje kontekstowe przypominające osobie nadużywającej narkotyków o wcześniejszych doświadczeniach związanych z narkotykami mogą wywołać nawrót głodu narkotykowego nawet po długich okresach abstynencji od kontaktu z narkotykami^7,8. Stąd wielkie wyzwanie kliniczne w uzależnieniu – skłonność osób uzależnionych do nawrotów nawet długo po ustąpieniu objawów odstawienia⁹.

Behawioralne uwrażliwienie na kokainę to prosty model doświadczenia z kokainą, przydatny w badaniu mechanizmów uzależnienia od narkotyków. W tym szeroko badanym modelu długotrwałego uczulenia wywołanego przewlekłym narażeniem na narkotyki, gryzonie są najpierw przyzwyczajane do iniekcji z soli fizjologicznej (dootrzewnowej; IP) w nowym środowisku (otwarta komora polowa, w której monitorowana jest ich aktywność lokomotoryczna); następnie otrzymują codzienne zastrzyki kokainy w otwartych komorach polowych, podczas gdy ich aktywność jest monitorowana¹⁰ (ryc. 1). Ten paradygmat behawioralny zazwyczaj skutkuje silnym uwrażliwieniem na zachowania lokomotoryczne (8-12 razy powyżej aktywności wyjściowej)¹¹, które utrzymuje się przez okres miesięcy po zaprzestaniu wstrzykiwania kokainy, co świadczy o tworzeniu się wszechobecnego śladu pamięciowego po doświadczeniu narkotykowym.

Obwody neuronalne nagrody, naturalnie zaangażowane we wzmacnianie zachowań niezbędnych dla sukcesu gatunku (np. karmienie, seks), są wykorzystywane przez narkotyki do wzmacniania zachowań związanych z narkotykami^12,13. Mechanizmy molekularne i komórkowe, dzięki którym nasila się doświadczanie nadużywania narkotyków, wydają się być podobne do mechanizmów leżących u podstaw tworzenia wspomnień deklaratywnych lub semantycznych w innych strukturach mózgu¹⁴. W związku z tym solidność modelu uwrażliwiania behawioralnego sprawia, że jest on atrakcyjnym systemem modelowym do badania mechanizmów plastyczności zależnej od doświadczenia.

Jądro półleżące (NAc) jest centralnym integratorem obwodu nagrody w mózgu i jest szeroko związane z rozwojem uzależnienia^5,6. Powstawanie uzależnienia zależy od transkrypcji nowych białek w jądrze półleżącym, a po doświadczeniu z kokainą obserwuje się silną indukcję wyraźnie ustrukturyzowanych programów transkrypcyjnych w NAc^15-19. Ostra odpowiedź transkrypcyjna na ekspozycję na kokainę może funkcjonować na wielu poziomach w celu przystosowania się do silnego bodźca indukcyjnego i ukierunkowania produkcji nowych białek, które są odpowiedzialne za zmiany strukturalne i elektrofizjologiczne wywołane ekspozycją na narkotyk ^6,19-22.

Aby promować badania nad molekularnymi mechanizmami plastyczności zależnej od doświadczenia w mózgu, opisano protokół kompleksowej analizy dynamiki transkrypcji w próbkach tkanki mózgowej po manipulacji behawioralnej. Protokół jest zilustrowany w kontekście doświadczeń behawioralnych badanych w laboratorium Citri – behawioralnego uwrażliwienia na kokainę, wykorzystującego dynamiczne układy mikroprzepływowe do analizy transkrypcyjnej. Opisany protokół nie ogranicza się oczywiście do badania jądra półleżącego w kontekście uwrażliwienia behawioralnego, ale może być zastosowany do dużej liczby paradygmatów behawioralnych i regionów mózgu. W rzeczywistości protokół ten może być stosowany do tkanek ciała poza mózgiem, a różne doświadczenia lub manipulacje organizmu mogą być badane.

Protokół jest z grubsza podzielony na cztery kroki. W pierwszym kroku zwierzę poddawane jest paradygmatowi behawioralnemu; w drugim etapie tkanka jest mikropreparowana; w trzecim kroku – mRNA jest oczyszczane, poddawane odwrotnej transkrypcji i sondowane, a w ostatnim etapie dane są analizowane.

W kontekście badania dynamiki transkrypcji, dokładny czas i definicja doświadczenia są prawdopodobnie najważniejszymi parametrami eksperymentalnymi do kontrolowania. Z tego powodu naszym preferowanym modelem behawioralnym jest behawioralne uwrażliwienie na kokainę, system, który umożliwia wysoki poziom kontroli eksperymentatora nad parametrami doznania. Dostępne są dodatkowe paradygmaty behawioralne, które umożliwiają precyzyjne wyczucie czasu i odnoszą się do różnych modeli plastyczności zależnej od doświadczenia lub tworzenia pamięci. Modele te obejmują warunkowanie strachu²³, ostre wzbogacenie środowiska^24,25, eksplorację nowych^obiektów26 oraz doświadczenie wizualne po mrocznym wychowaniu²⁷. Mimo to, behawioralne uwrażliwienie na kokainę jest konsekwentnie silną manipulacją behawioralną, tworzącą wysoce wszechobecny ślad pamięciowy, który utrzymuje się przez miesiące po doświadczeniu z kokainą.

Mózg jest dzielony na sekcje, a następnie następuje manualna mikrodysekcja jądra półleżącego. Z naszego doświadczenia wynika, że ręczna mikrodysekcja z szybko przygotowanych wycinków mózgu zapewnia najbardziej niezawodną i szybką metodę ekstrakcji tkanki istotnej dla paradygmatu behawioralnego, a wraz z doświadczeniem granice tkanki stają się oczywiste i łatwo rozpoznawalne. Alternatywnie można przygotować drobne plastry, a następnie przeprowadzić mikrodysekcję laserową. Chociaż metoda ta umożliwia precyzyjne wyznaczenie obszaru zainteresowania, jest powolna (co grozi utratą labilnego mRNA), żmudna i wymaga kosztownego dedykowanego sprzętu (mikroskopu wyposażonego w zestaw do wychwytywania laserowego). Protokół zdefiniowany w niniejszym dokumencie może być również dostosowany do analizy transkrypcji pojedynczej komórki, poprzez ręczne aspiracje cytoplazmy wizualnie zidentyfikowanych komórek za pomocą pipet plastrowych²⁹. Ważne jest, aby pamiętać, że opisany protokół zapewnia średnią populacji, podczas gdy jest wysoce prawdopodobne, że w większości przypadków tylko subpopulacja komórek w tkance jest faktycznie zaangażowana w reagowanie na doświadczenie. Interesujące jest profilowanie transkrypcji w sposób selektywny w określonych populacjach komórek reagujących na doświadczenie, ale dyskusja na temat tych podejść wykracza poza obecny zakres.

W przypadku oczyszczania mRNA, odwrotnej transkrypcji i zapytania qPCR, tkanka jest niszczona przez przepuszczenie jej przez cienkie igły, a następnie użycie dostępnych na rynku zestawów (więcej informacji znajdziesz w Tabeli 8). Wybór jest podyktowany doświadczeniem w stosowaniu tych metodologii, które zapewniają niezawodną ekstrakcję wysokiej jakości RNA i solidne wyniki z dalszych zastosowań.

Chociaż protokół jest opisany dla qPCR o wysokiej przepustowości z wykorzystaniem dynamicznych tablic, próbki mogą być badane pod kątem ekspresji genów za pomocą PCR punktu końcowego, qPCR o niskiej przepustowości, mikromacierzy ekspresji genów lub głębokiego sekwencjonowania. Preferowanie wysokoprzepustowego qPCR z wykorzystaniem dynamicznych macierzy wynika z faktu, że mRNA uzyskane z jąder mózgu zgodnie z paradygmatami behawioralnymi ma często ograniczone ilości. Tablice dynamiczne stanowią platformę, która umożliwia wydajną, kompleksową analizę transkryptów z dużej liczby równoległych próbek w jednym eksperymencie. Po początkowym nabyciu systemu mikroprzepływowego (zwykle zakupie instytucjonalnym), eksperymenty są stosunkowo niedrogie w prowadzeniu. Po tej analizie można przeprowadzić dalsze przeszukiwanie próbek przy użyciu bardziej kosztownych platform w celu poszukiwania nowych transkryptów (za pomocą mikromacierzy lub RNAseq), przy czym dynamiczne tablice stanowią kompleksowe odniesienie dla zapewnienia jakości. Wreszcie, do analizy danych stosuje się standardowe podejścia. Szczegółowe wskazówki dotyczące kwestii, które mogą się pojawić, zostaną omówione w tekście protokołu.

Ten protokół jest najbardziej odpowiedni dla badaczy zainteresowanych dokładnym zbadaniem swojego systemu, badaniem wielu warunków i replikacji. Protokół jest również najbardziej odpowiedni dla badaczy, którzy już udoskonalili (poprzez eksperymenty z mikromacierzą lub RNAseq) na podzbiorze 50-500 genów będących przedmiotem zainteresowania, które są zainteresowani wielokrotnym badaniem.

Protocol

UWAGA: Protokół jest zgodny z wytycznymi Uniwersytetu Hebrajskiego w Jerozolimie.

1. Przygotowanie roztworu ACSF

1. Przygotować roztwór ACSF zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przygotować 1 l w czystości ddH₂O (>18 MΩ), doprowadzając osmolarność do ~300 mOsm/L z odpowiednim dodatkiem wody lub NaCl.

2. Wyposażenie i konfiguracja pomieszczenia

Sprzęt do monitorowania zachowań lokomotorycznych wywołanych przez kokainę składa się z komór behawioralnych (50 x 45 cm) połączonych z wewnętrznym źródłem światła, wentylatorem i kamerą (lub czujnikami podczerwieni), oraz wyposażonych w wewnętrzną skrzynkę z pleksiglasu (30 x 30 cm), w której myszy mogą się swobodnie poruszać, podczas gdy ich poruszanie się jest monitorowane. Testy behawioralne należy przeprowadzać od 1 godziny po włączeniu świateł do 1 godziny przed wyłączeniem światła, w regularnym cyklu światła/ciemności. Zwierzęta powinny być szkolone konsekwentnie o tej samej porze każdego dnia.

1. Podłącz kamerę lub system podczerwieni do odpowiedniego systemu w celu monitorowania i rejestrowania zachowań lokomotorycznych myszy.
2. Wyczyść komory po każdej próbie środkiem dezynfekującym dostarczonym przez mysz i/lub odczynnikiem usuwającym zapachy, aby zapobiec odchyleniu sygnałów węchowych i zapewnić właściwą dezynfekcję.

WAŻNE: Podczas obchodzenia się z myszami bądź cichy, spokojny i ostrożny.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Trzymaj 5 samców myszy C57BL6 (6-12 tygodni; ~25-35 g wagi) w klatce, w pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i swobodnym dostępem do jedzenia i wody, zgodnie ze standardami i wymaganiami lokalnych wytycznych i protokołów Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami. Przed rozpoczęciem eksperymentu zważ myszy i zapisz dane. Kokaina jest później podawana w zależności od wagi myszy.
2. Przenieś wszystkie klatki zawierające myszy do pokoju behawioralnego 30 minut przed rozpoczęciem pierwszej próby.
3. Przyzwyczaj wszystkie myszy użyte w eksperymencie do obsługi przez eksperymentatora, wstrzykiwania i monitorowania w konfiguracji zachowania. Osiąga się to poprzez 3 kolejne codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe 250 μl soli fizjologicznej, jak opisano poniżej.
4. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie 250 μl soli fizjologicznej. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy umieścić mysz w komorze behawioralnej w celu monitorowania aktywności lokomotorycznej przez 15 minut. Powtarzaj tę czynność przez 3 kolejne dni, codziennie o tej samej godzinie.
5. Czwartego dnia podziel myszy na dwie grupy. Przygotować podstawowy roztwór kokainy o stężeniu 2 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej. Grupie doświadczalnej należy podać pojedyncze wstrzyknięcie roztworu kokainy (końcowe 20 mg/kg) w zależności od masy ciała myszy (np. dla myszy o wadze 25 g – wstrzyknąć 250 μl, podczas gdy mysz o wadze 30 g otrzyma 300 μl). Podawać sól fizjologiczną grupie kontrolnej. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy umieścić mysz na 20 minut w komorze behawioralnej w celu monitorowania aktywności lokomotorycznej (zazwyczaj monitorowane są pierwsze 15 minut).
6. Po wstrzyknięciu kokainy należy złożyć myszy w ofierze w różnych punktach czasowych (0, 1, 2, 4, 8 i 24 godziny po wstrzyknięciu). Co ważne, należy upewnić się, że myszy referencyjne (0 punkt czasowy) nie otrzymają w tym dniu żadnego zastrzyku. Ze względu na jego znaczenie konieczne jest uwzględnienie powtórzeń grupy referencyjnej.

4. Rozwarstwienie jądra półleżącego

1. Znieczulić myszy izofluranem w odpowiednim czasie po wstrzyknięciu kokainy/soli fizjologicznej. Izofluran musi być bezpośrednio odprowadzany z pomieszczenia. Dlatego zabieg powinien być wykonywany w dygestorium chemicznym.
2. Monitoruj głębokość znieczulenia, testując odruch tylnej stopy. Uszczypnij łapę, aby wywołać reakcję wycofania się zwierzęcia. Zwierzę, które wykazuje odruch, nie jest w znieczuleniu chirurgicznym i nie jest w stanie do eutanazji.
3. Ekstrakcja mózgu:
   1. Poddaj mysz eutanazji przez ścięcie.
   2. Usuń skórę powyżej środka czaszki i przetnij czaszkę ostrymi nożyczkami.
   3. Włóż nożyczki w miejscu, w którym rdzeń kręgowy wchodzi do mózgu (otwór wielki) i wykonaj dwa boczne cięcia.
   4. Od tego samego miejsca wykonaj długie nacięcie strzałkowe wzdłuż szwu strzałkowego. Po dotarciu do opuszki węchowej przypnij w lewo i w prawo.
   5. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń czaszkę, mocno chwytając każdą połowę czaszki i ciągnąc na bok, uważając, aby nie naciskać na mózg ani go nie uszkodzić.
   6. Usuń mózg podczas przecinania nerwów czaszkowych za pomocą odwróconej szpatułki z mikro łyżką.
4. Umieść mózg w lodowatym roztworze ACSF na 1-2 minuty, aby schłodził się i stwardniał.
5. Usuń mózg z ACSF, odchodnij nadmiar płynu ręcznikiem papierowym, utwórz koronalne cięcie między móżdżkiem a resztą mózgu i przyklej mózg, z częścią rostralną skierowaną do góry, do etapu wibratomu.
6. Cięcie NAc:
   1. Utrzymuj roztwory ACSF w lodowatych temperaturach w komorze krojenia wibratomu. Sekcja w odległości 200 μm do momentu, gdy jądro półleżące (NAc) zostanie wyraźnie zidentyfikowane zgodnie z atlasem mózgu myszy Paxinos i Franklina (około 1,8 mm przed Bregmą; należy zwrócić uwagę na kształt ciała modzelowatego, położenie i kształt spoidła przedniego i komór, a także ogólną morfologię odcinka mózgu). W tym momencie utwórz dwie sekcje o wielkości 400 μm, z których zostanie wycięty NAc.
   2. Pod stereoskopem użyj cienkiego ostrza, aby wyciąć obszar NAc z plastrów. Definicja NAc jest zgodna z atlasem mózgu myszy Paxinos i Franklina i może być wygodnie wypreparowana w odpowiednich sekcjach przez cztery szybkie ruchy ostrza po tkance. (Rysunek 2).
   3. Natychmiast umieścić skrawki NAc w 900 μl odczynnika do lizy Trizol w probówce mikrowirówkowej i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.

5. Ekstrakcja RNA i odwrotna transkrypcja cDNA

1. Rozmrozić probówki zawierające skrawki jądra półleżącego w odczynniku do lizy trizolu w temperaturze pokojowej i homogenizować lizat za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do igły 25 G, aż tkanka zostanie całkowicie zhomogenizowana (co najmniej 15-20 razy). Pierwsze kilka rund jest trudnych i wymaga dociśnięcia tkanki do ścianki rurki w celu rozbicia jej na małe kawałki, które mogłyby dostać się do końcówki igły.
2. Aby zapewnić homogenizację, odpipetuj lizat do mini kolumny wirowej QIAshredder i odwiruj przy 12 000 x g przez 1 minutę.
3. Odpipetować lizat do nowej probówki do mikrowirówki i wyekstrahować RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
4. Zmierz stężenie RNA, przeanalizuj integralność i jakość za pomocą bioanalizatora lub równoważnego sprzętu. Użyj 100-500 ng RNA dla każdej rundy przygotowania cDNA z losowymi starterami heksameru.

6. Projektowanie podkładów i testowanie podkładów

1. Wybór dobrych starterów: Aby uzyskać optymalną parę starterów do qPCR transkryptów mRNA, postępuj zgodnie z poniższymi wymaganiami (ryc. 3):
   1. Zaprojektuj podkłady zawierające nie więcej niż 17-28 zasad. Unikaj powtórzeń nukleotydów, ponieważ sprzyjają one niewłaściwemu torowaniu.
   2. Projektuj podkłady o temperaturze topnienia (T_m) w zakresie 56-68°C (optymalnie 60-64°C). T_m w parze starterów powinny znajdować się w odległości nie większej niż 1 °C od siebie.
   3. Należy pamiętać, że rozmiar produktu powinien wynosić od 80 do 150 pz.
   4. Upewnij się, że co najmniej jeden ze starterów zakrywa połączenie ekson-ekson lub amplikon zawiera duży intron (rozpiętość intronu), aby uniknąć amplifikacji zanieczyszczeń genomowego DNA.
   5. Użyj niezawodnego oprogramowania opartego na Primer3 (przykłady patrz Tabela 2) w celu ulepszenia projektu podkładu.
2. Testowanie starterów: W celu zapewnienia swoistości i skuteczności starterów należy przeprowadzić kontrolną reakcję qPCR:
   1. Użyć próbki dodatniej (zawierającej matrycę cDNA dla wszystkich istotnych par starterów) i miareczkować cDNA (np. osiem trzykrotnych rozcieńczeń od początkowego stężenia ~10 ng) w zduplikowanych równoległych reakcjach. Dołącz kontrolę bez szablonu, która kontroluje zanieczyszczenie w roztworach używanych do reakcji.
   2. Oblicz wydajność podkładu, korzystając ze wzoru: (10^{(−1/nachylenie)}-1) × 100, tak aby krzywa optymalnego nachylenia wynosiła − 3,333 (tj. 10^{(− 1/3,333)} = 2) (Rysunek 4).
   3. Określ specyficzność wzmocnienia. Specyficzne wzmocnienie jest wykazywane przez pojedynczy wyraźny pik wspólny dla wszystkich krzywych topnienia amplifikowanych produktów, podczas gdy amplifikacja poza celem wydaje się oczywistym odchyleniem od pojedynczego dużego piku.

7. Analiza qPCR

1. Przedwzmacniacz:
   1. Kompleksowa analiza qPCR opiera się na równoległym odpytywaniu o graniczne ilości RNA z dużą liczbą par starterów. Dlatego niezbędny jest etap wstępnego wzmocnienia. Na tym etapie cDNA przechodzi 14-18 cykli wstępnej amplifikacji z mieszaniną wszystkich starterów, które zostaną wykorzystane do odpytywania próbki w przyszłości (do 800 par starterów).
   2. Rozcieńczyć wszystkie startery w TE (low EDTA) do 50 μM w celu specyficznego wzmocnienia celu (STA).
   3. Zebrać razem 1 μl podwielokrotności wszystkich 50 μM zestawów starterów, które mają być włączone do reakcji STA, do 800 testów.
   4. Przygotować wstępną mieszankę i próbki do STA zgodnie z opisem w tabeli 3. Dopuszczaj błędy, przygotowując mieszaninę dla 110% liczby próbek, które muszą zostać amplifikowane.
   5. Podwielokrotność 3,75 μl mieszanki wstępnej STA dla każdej próbki. Dodaj 1,25 μl cDNA do każdego.
   6. Wirować, aby wymieszać reakcje i odwirować przez 10 sekund.
   7. Umieść reakcje STA w termocyklerze i cykluj zgodnie z tabelą 4.
2. Leczenie egzonukleazą I (ExoI):
   1. Rozcieńczyć Exo I, jak wskazano w Tabeli 5.
   2. Dodać 2 μl rozcieńczonego ExoI (4 U/μl) do każdej 5 μl reakcji STA, odwirować, odwirować (>6 000 x g) i umieścić w termocyklerze w temperaturze 37 °C na 30 minut, a następnie w temperaturze 80 °C na 15 minut.
   3. Rozcieńczyć produkty końcowe do odpowiedniego stężenia do badań. Użyj buforu TE (dodać 43 μl buforu TE do 7 μl próbki TSA).
   4. Rozcieńczone produkty STA należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.
3. Zestaw startera i próbki do qPCR:
   1. Przygotować próbki, jak pokazano w tabeli 6. Przygotuj mieszankę zgodnie z chipem wybranym do eksperymentu i dodaj odpowiednie próbki.
   2. Mieszać roztwory mieszanki próbek przez co najmniej 20 sekund i wirować (>6 000 x g) przez co najmniej 30 sekund. Przygotowane reakcje można przechowywać przez krótki czas w temperaturze 4 °C, aż wiór będzie gotowy do załadowania.
   3. Przygotować testy zgodnie z opisem w tabeli 7.
   4. Mieszaj mieszankę testową przez co najmniej 20 sekund i odwiruj (>6 000 x g) przez co najmniej 30 sekund, aby odwirować wszystkie składniki.
      WAŻNE: Dokładnie wymieszać i odwirować wszystkie próbki i roztwory testowe przed pipetowaniem do wlotów chipów. Niezastosowanie się do tego może spowodować pogorszenie jakości danych.
      UWAGA: Końcowe stężenie każdego startera wynosi 5 μM na wlocie i 500 nM w reakcji końcowej.
4. Gruntowanie i ładowanie układu IFC (zintegrowany obwód fluidyczny) Dynamic Array. Chip IFC posiada wloty dla próbek i testów, a także określone wloty (akumulatory) dla płynu z przewodu kontrolnego (oleju mineralnego) używanego do zwiększania ciśnienia w komorach mikroprzepływowych (rysunek 4A).
   1. Wstrzyknąć płyn z przewodu sterującego do każdego akumulatora na chipie.
   2. Usuń i wyrzuć niebieską folię ochronną ze spodu chipa.
   3. Umieść chip w odpowiednim kontrolerze IFC (kontroler MX dla 48.48 Dynamic Array IFC lub kontroler IFC HX dla 96.96 Dynamic Array IFC), a następnie uruchom skrypt Prime (113x) dla 48.48 Dynamic Array IFC lub skrypt Prime (136x) dla 96.96 Dynamic Array IFC, aby zalać chip.
   4. Po zakończeniu skryptu usuń zalany układ scalony z kontrolera IFC.
   5. Odpipetować 5 μl każdej mieszaniny testowej i 5 μl każdej mieszanki próbek do ich wlotów.
   6. Zwróć chip do kontrolera IFC.
   7. Korzystając z oprogramowania kontrolera IFC, uruchom skrypt Load Mix (113x) dla 48.48 Dynamic Array IFC) lub skrypt Load Mix (136x) dla 96.96 Dynamic Array IFC, aby załadować próbki i testy do chipa. Po zakończeniu skryptu Load Mix wyjmij załadowany układ z kontrolera IFC.
   8. Załaduj chip do termocyklera, utwórz nowy przebieg chipa (zgodnie z wytycznymi producenta), w tym analizę krzywej topnienia. Korzystając z oprogramowania termocyklera, upewnij się, że komory reakcyjne są prawidłowo rozpoznawane i pozwól reakcji przebiegać do końca.

8. Analiza danych

1. Zapewnienie jakości: Aby zapewnić jakość danych, należy zweryfikować jakość starterów, odnosząc się do krzywych rozcieńczenia (jak opisano powyżej). Monitoruj specyficzność amplifikacji, przeglądając krzywe topnienia amplikonów, których piki powinny być optymalnie wyrównane²⁹.
2. Wizualizacja: Do wizualizacji dużych ilości danych uzyskanych za pomocą wysokoprzepustowego qPCR należy użyć map cieplnych generowanych przez oprogramowanie, w których wyrażenie jest oznaczone kolorami według intensywności. Ponadto wyświetlaj dynamikę transkrypcji pojedynczych genów w postaci liniowych wykresów punktowych.
3. Publikacja: Publikując wyniki ekspresji genów, zaleca się przestrzeganie wytycznych MIQE dotyczących publikacji ilościowych eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym, szczegółowo określających minimalne informacje, które należy podać w eksperymencie qPCR, aby zapewnić jego przydatność, dokładność, prawidłową interpretację i odtwarzalność.

Results

Jakość wyników uzyskanych dzięki zastosowaniu tego protokołu zależy przede wszystkim od wielu parametrów. Właściwe planowanie eksperymentu spowoduje minimalne zakłócenia u myszy eksperymentalnych, tak że badane doświadczenie (w tym przykładzie narażenie na kokainę) będzie najbardziej dominującym doświadczeniem w ich najnowszej historii, a zatem zaowocuje solidnym i specyficznym programem transkrypcyjnym. Rycina 1 opisuje eksperymentalny plan behawioralnego uwrażliwienia na kokainę, określając punkty czas...

Discussion

Pomyślna charakterystyka ekspresji genów z tkanki mózgowej zgodnie z paradygmatami behawioralnymi zależy od: 1) Starannego obchodzenia się z myszami podczas paradygmatu behawioralnego; 2) Szybkie i precyzyjne wypreparowanie interesującej tkanki; 3) środki bezpieczne dla RNA w celu zapewnienia integralności RNA; oraz 4) Staranne planowanie starterów i układu eksperymentalnego, a także precyzja i dbałość o szczegóły w ramach przygotowań do analizy qPCR.

Celem opisanej procedury jest scharakteryz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virusol	Oriek Medical	J29D
Izofluran, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Uniwersalny mini zestaw	QIAGEN	73404
QIAshredder	QIAGEN	79654
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności	Invitrogen	AB-4368814
Bufor	TEKomora behawioralna Invitrogen	1355656
(MDF; 50 x 45 cm)			Samodzielna zmontowana
wewnętrzna skrzynka z pleksiglasu (30 x 30 cm)			Samodzielna
kamera i magnetowid	Campden Inst.	CMD-80051
Oprogramowanie do nagrywania multimediów	Noldus	NDS-NMR3-00M
Nożyczki do tęczówki	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	Bioanalizator 7000SMZ-2
	Agilent Technologies		Agilent 2100
Termocykler	Bio-Rad	1852048
Odwrócona szpatułka do mikrołyżek	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Układ dynamicznej matrycy do ekspresji genów 96,96	Fluidigm	Zobacz materiał BMK-M-96.96