Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Summary

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Abstract

jest wymagana do wielu funkcji limfocytów T, w tym migracji do miejsc zapalnych i tworzenia synaps immunologicznych z komórkami prezentującymi antygen. Limfocyty T osiągają regulowaną adhezję poprzez kontrolowanie właściwości adhezyjnych integryn, klasy cząsteczek adhezyjnych komórek składającej się z heterodimerycznych par białek transbłonowych, które oddziałują z cząsteczkami docelowymi na komórkach partnerskich lub macierzy zewnątrzkomórkowej. Najbardziej znaną integryną limfocytów T jest antygen związany z funkcją limfocytów (LFA)-1, składający się z podjednostek αL i β2, którego celem jest wewnątrzkomórkowa cząsteczka adhezyjna (ICAM)-1. Zdolność limfocytów T do kontrolowania adhezji wynika ze zdolności do regulowania stanów powinowactwa poszczególnych integryn. Sygnalizacja wewnętrzna na zewnątrz opisuje proces, w którym sygnały wewnątrz komórki powodują, że zewnętrzne domeny integryn przyjmują stan aktywowany. Znaczna część naszej wiedzy na temat tych złożonych zjawisk opiera się na badaniach mechanistycznych przeprowadzonych w uproszczonych systemach modelowych in vitro. Opisany tutaj test adhezji limfocytów T jest doskonałym narzędziem, które pozwala limfocytom T przylegać do cząsteczek docelowych w warunkach statycznych, a następnie wykorzystuje czytnik płytek fluorescencyjnych do ilościowego określenia adhezji. Test ten okazał się przydatny w definiowaniu substancji stymulujących adhezję lub hamujących, które działają na limfocyty, a także w charakteryzowaniu zaangażowanych zdarzeń sygnalizacyjnych. Chociaż opisano tutaj dla LFA-1 - adhezji za pośrednictwem ICAM-1; test ten można łatwo dostosować, aby umożliwić badanie innych oddziaływań adhezyjnych (np. VLA-4 - fibronektyna).

Introduction

T jest podstawowym procesem odpowiedzi immunologicznej¹. Jest niezbędny do interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka zdobiącymi ściany naczyń włosowatych, do skanowania komórek prezentujących antygen (APC) w węzłach chłonnych oraz do tworzenia synaps immunologicznych (IS) z komórkami docelowymi². Wymagania te różnią się funkcjonalnie i kinetycznie. Proces wynaczynienia limfocytów składa się z chemoprzyciągania, rolowania, mocnej adhezji i transmigracji. Przejście od zwijania do twardej adhezji wymaga od limfocytów T szybkiej reakcji na sygnał receptora sprzężonego z białkiem G. Ta odpowiedź daje interakcję liganda integrynowego, która spowalnia i zatrzymuje toczącą się komórkę³. Natychmiastowa zmiana awidności integryny pośredniczy w tym procesie. Migracja wymaga dynamicznych interakcji między komórkami T a komórkami śródbłonka z powstawaniem zrostów na "przednim końcu" i pękaniem zrostów na "tylnym końcu" w odstępie około minuty między powstaniem a zerwaniem⁴. IS tworzy się w ciągu kilku minut, ale musi pozostać nienaruszony przez⁶ godzin.

Interesujące, jedna cząsteczka adhezyjna, antygen LFA-1 (LFA)-1, członek rodziny integryn, jest niezbędna dla wszystkich tych procesów⁵. LFA-1 pośredniczy w adhezji poprzez interakcje z kilkoma członkami nadrodziny immunoglobulin. Najszerzej przebadanym ligandem o najwyższym powinowactwie do LFA-1 jest międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna (ICAM)-1. Nieaktywowane krążące limfocyty wyrażają LFA-1 o niskim powinowactwie na powierzchni komórki, a zatem nie są w stanie przylegać do powierzchni pokrytych ICAM-1. Powinowactwo LFA-1 jest zmienne i regulowane przez kilka zdarzeń sygnalizacyjnych, takich jak aktywacja receptora sprzężonego z białkiem G, stymulacja cytokin i sygnały, w których pośredniczą receptory komórek T (TCR). Uzyskana w ten sposób forma LFA-1 o wysokim powinowactwie przenosi aktywację wewnątrzkomórkową do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poprzez interakcje z ICAM-1. Ten szlak jest określany jako sygnalizacja wewnętrzna-zewnętrzna⁷. Podobnie sygnalizacja przez LFA-1 z przestrzeni zewnątrzkomórkowej nazywana jest sygnalizacją zewnętrzną.

Wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne zaangażowane w sygnalizację wewnętrzną i zewnętrzną są głównym przedmiotem obecnych badań. Mała GTPaza Rap1 stała się ostatnio kluczowym składnikiem sygnalizacji inside-out, która jest wspólna zarówno dla ligacji TCR, jak i sygnalizacji cytokin⁸. Kluczową rolę Rap1 w aktywacji integryny podkreśla odkrycie, że nadekspresja Rap1 stymuluje zależną od integryny adhezję limfocytów T, podczas gdy adhezja limfocytów T jest blokowana przez ekspresję dominującego ujemnego Rap1⁹. Te postępy w naszym zrozumieniu regulacji integryny przez Rap1 zostały osiągnięte przy użyciu narzędzi in vitro. Wśród nich znajduje się opisany tutaj test adhezji statycznej.

Ogólnym celem tej metody jest zbadanie przyczepności limfocytów T do powierzchni pokrytych ICAM-1. Mówiąc dokładniej, służy do obiektywnego pomiaru i ilościowego określania powinowactwa LFA-1 do jego przeciwligandów w żywych komórkach w czasie rzeczywistym, w różnych warunkach. Technika ta wykorzystuje studzienki polistyrenowe pokryte ICAM-1 do naśladowania powierzchni komórkowych, z którymi oddziałują limfocyty T. Wiele wcześniej opisanych statycznych testów adhezji limfocytów T było eksperymentalnie złożonych. Testy te często wymagały znakowania radioaktywnie limfocytów T, wykorzystywały hodowane bydlęce komórki rogówki do stworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej jako substratu do adhezji limfocytów T lub wymagały niefizjologicznej stymulacji limfocytów T przez dłuższy czas w celu promowania adhezji komórek T¹⁰. Zastosowanie pomiarów fluorometrycznych do ilościowego oznaczania limfocytów T po inkubacji adhezyjnej jest bardziej czułą i dokładną metodą oznaczania ilościowego w porównaniu z cytometrią przepływową i mikroskopią, które są stosowane w wielu innych systemach testowych¹¹. Dodatkowo, analiza mikroskopowa lokalizacji integryny w pojedynczych komórkach nie pozwala na szeroką analizę populacyjną w taki sam sposób, jak pomiar fluorometryczny. Chociaż przeciwciała LFA-1 specyficzne dla stanu aktywacji są dostępne na rynku, przeciwciała te oferują niską czułość w porównaniu z opisaną tutaj metodą. Główną przewagą nad technikami alternatywnymi jest ich prostota i możliwość jednoczesnego badania wielu warunków eksperymentalnych. Rozważając tę metodę dla konkretnego zastosowania, należy wziąć pod uwagę, że limfocyty T powinny być wyselekcjonowane negatywnie, świeżo wyizolowane i oznaczone markerem fluorescencyjnym.

Protocol

1. Powlekanie studzienek mikropłytek

Uwaga: Celem tego kroku jest pokrycie powierzchni polistyrenowych ICAM-1, które mają służyć jako ligandy dla limfocytów T LFA-1.

1. Przygotuj następujące rozwiązania:
   1. Przygotować roztwór powlekający, ponownie zawieszając rekombinowany ICAM-1 z roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO_4, 2 mM KH₂PO_4, pH 7,4) wzbogaconym w wapń (1 mM CaCl₂) i magnez (2 nM MgCl₂). Upewnij się, że końcowe stężenie ICAM-1 wynosi 10 μg/ml, sporządzony z roztworu podstawowego o stężeniu 0,7 mg/ml i przechowywany w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
   2. Przygotować roztwór adhezyjny, wzbogacając PBS w 0,5% albuminę surowicy ludzkiej (lub bydlęcej) (HSA/BSA), 2 mM MgCl₂ i 1 mM CaCl₂.
   3. Przygotować roztwór do płukania, dodając 2 mM MgCl₂ i 1 mM CaCl₂ do PBS. Przed użyciem podgrzać wszystkie roztwory do temperatury 37 °C.
2. Przemyć 24 studzienki 50 μl roztworu myjącego. Obejmuje to nieumyte studnie, kontrole dodatnie (komórki poddane działaniu PMA) i ujemne (studzienki niepowlekane). Dla każdego warunku należy ustawić co najmniej trzy studzienki (potrójne).
3. Do każdej studzienki dodać 50 μl roztworu powlekającego. Nie dodawać do niepowlekanych studzienek kontrolnych. Inkubować przez godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
4. Delikatnie zassać roztwór powlekający, nie dopuszczając do tego, aby końcówka dotykała dna studzienek. Przemyć raz 50 μl roztworu myjącego.
5. Dodać 50 μl roztworu adhezyjnego i inkubować mikropłytkę przez jedną godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
6. Delikatnie odessać i przemyć raz 50 μl roztworu myjącego. Płytkę należy zużyć tego samego dnia, jednak możliwe jest przechowywanie jej w temperaturze 4 °C przez noc i użycie jej następnego dnia.

2. Izolacja limfocytów T z krwi

1. Dodać koktajl wzbogacający ludzkie limfocyty T w stężeniu 50 μl/ml krwi pełnej (np. na 3 ml krwi pełnej z antykoagulantem (heparyną, EDTA lub cytrynianem) dodać 150 μl koktajlu). Dobrze wymieszaj.
2. Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 3 ml krwi poddanej działaniu substancji i równą objętość PBS (bez wapnia i magnezu) wzbogaconego o 1% D-glukozę w temperaturze pokojowej. Delikatnie wymieszaj pipetą Pasteura.
4. Dodać 15 ml Ficoll-Paque PLUS do probówki wirówkowej.
5. Ostrożnie nałożyć 6 ml rozcieńczonej próbki krwi na podłoże do izolacji limfocytów.
6. Wirować przy 400 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C z odrywaniem.
7. Odciągnij górną warstwę za pomocą czystej pipety Pasteura, pozostawiając warstwę limfocytów nienaruszoną na granicy faz. Górna warstwa plazmy może zostać zachowana do późniejszego wykorzystania. Za pomocą czystej pipety Pasteura przenieś warstwę limfocytów do czystej probówki wirówkowej.
8. Dodać 3 objętości (9 ml) PBS do limfocytów. Zawieś komórki, delikatnie wciągając je i wyjmując z pipety Pasteura.
9. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.
10. Usunąć supernatant. Limfocyty należy teraz zawiesić w pożywce odpowiedniej do zastosowania. Przenieść komórki do kolby hodowlanej T-75 w 20 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny.

3. Przygotowanie komórek

Uwaga: Warunkiem wstępnym jest oznaczenie komórek odczynnikiem fluorescencyjnym. W tym protokole należy stosować ester sukcynimidylowy karboksylu fluoresceiny (CFSE), jednak dopuszczalną alternatywą są komórki eksprymujące białko zielonej fluorescencji (GFP).

1. Policz 2,4 x 10⁶ limfocytów T (1 x 10⁵ dla każdej studzienki) za pomocą hemocytometru.
2. Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej pozbawionej surowicy (głód surowicy). Inkubować komórki przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
3. Odwirowywać komórki przez 5 minut (400 x g). Odessać pożywkę i ponownie zawiesić w 1 ml PBS.
4. Dodać CFSE w rozcieńczeniu 1:1,000 (zapas do 5 mM). Przykryj światłem i inkubuj przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
5. Zatrzymać reakcję, dodając 10 ml PBS o temperaturze 37 °C i wirować w temperaturze 400 x g przez 5 minut.
6. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1,2 ml wstępnie podgrzanego roztworu adhezyjnego (1 x 10⁵ komórek na 50 μl).

4. Stymulacja komórek

Uwaga: Aby zainicjować adhezję, komórki muszą być stymulowane. W poniższym eksperymencie komórki są stymulowane przez TCR za pomocą przeciwciał sieciujących anty-CD3, jednak alternatywą może być rozpuszczalny SDF-1. W zależności od celu eksperymentów, przed lub w trakcie stymulacji można dodać różne odczynniki farmakologiczne, aby zbadać wpływ na adhezję komórkową. Octan mirystynianu forbolu (PMA) jest estrem forbolu, który jest strukturalnie podobny do drugiego przekaźnika diacyloglicerolu (DAG) i dlatego aktywuje wiele kinaz za TCR (głównie kinazą białkową C); Tutaj jest używany jako kontrola pozytywna.

1. Podgrzać mikropłytkę do temperatury 37 °C.
2. Podziel komórki na 8 pustych probówek o pojemności 1,5 ml (po 150 μl w każdej probówce), po jednej probówce na każdy warunek.
3. Traktuj komórki odpowiednio:
   1. Stymulować jedną probówkę PMA w stężeniu 10 ng/ml, aby służyła jako kontrola pozytywna. Utrzymuj trzy probówki w stanie niepoddanym obróbce, aby służyły jako kontrola stymulacji ("bez stymulacji"), kontrola niemytego ładowania ("bez mycia") i kontrola powłoki ICAM-1 ("niepowlekana").
   2. Stymuluj cztery probówki o różnych stężeniach przeciwciał anty-CD3 (0,1, 1, 5 i 10 μg/ml). Przejdź do następnego kroku bez opóźnień.
4. Podwielokrotność 50 μl stymulowanej komórki miesza się do każdej pustej studzienki. Ostateczna liczba komórek na studzienkę to 1 x 10⁵.
5. Umieścić mikropłytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15 min.
   Uwaga: Niektóre linie limfocytów T wymagają krótszego czasu stymulacji. W tym czasie komórki osiądą na dnie studzienek i przylgną do docelowych ligandów.

5. Wypłukiwanie nieprzylegających komórek

Uwaga: Celem tego kroku jest usunięcie komórek, które nie były w stanie nawiązać ścisłego kontaktu z powierzchniami pokrytymi ligandem. Na tym etapie należy użyć pipety wielokanałowej, aby upewnić się, że do wszystkich studzienek przyłożone są te same siły fizyczne. Ważne jest, aby wskazane studzienki kontrolne nie były myte, aby pomóc w obliczeniu procentu przylegających komórek.

1. Do każdej studzienki dodać 150 μl ciepłego roztworu adhezyjnego. Delikatnie potrząsaj płytką przez kilka sekund przed wyjęciem pożywki z dołków. Nie dotykaj końcówkami dna studzienek.
2. Powtórz ten krok trzy razy. Zmień kierunek pipety podczas pipetowania buforu do wewnątrz i na zewnątrz.

6. Określanie procentu przylegających komórek

Uwaga: W tym kroku używany jest czytnik płytek fluorescencyjnych do pomiaru intensywności fluorescencji w każdym dołku. Intensywność jest bezpośrednio skorelowana z liczbą przylegających komórek.

1. Włącz czytnik płytek. Otwórz oprogramowanie czytnika płyt, klikając ikonę skrótu na pulpicie.
   1. W menu "Zadanie" kliknij "Nowy", aby skonfigurować nowy protokół.
   2. Z menu "Akcje" wybierz opcję "Przeczytaj". Kliknij "Intensywność fluorescencji" i kliknij zakładkę "OK".
   3. Z menu rozwijanego wybierz "Długość fali wzbudzenia 485" i "Długość fali emisji 528". Kliknij zakładkę "OK".
   4. W menu opcji "Optyka" wybierz "Dół" i kliknij zakładkę "OK". Wróć do menu "Akcje" i ustaw temperaturę na 37 °C i kliknij "OK".
   5. Włóż mikropłytkę do czytnika płytek i kliknij "Uruchom". Wynik zostanie wyeksportowany do arkusza kalkulacyjnego Excel.
2. Obliczyć procent przylegających komórek, korzystając z następującego wzoru: Procent przylegających komórek = (średnia intensywność fluorescencji odczytana w umytych studzienkach)/(średnia intensywność fluorescencji odczytana w nieumytych komórkach) x 100%.

Results

Poniżej znajduje się przykład testu adhezyjnego z użyciem pierwotnych limfocytów T stymulowanych różnymi stężeniami przeciwciał anty-CD3. Przydatna jest znajomość fluorescencji nieumytych komórek (tj. całkowitego obciążenia). Niestymulowane komórki służą jako kontrola negatywna, a komórki traktowane PMA są kontrolą pozytywną dla przeciwciał anty-CD3. Komórki posiane w niepowlekanych studzienkach służą jako kontrola ICAM-1. W typowym eksperymencie odsetek przylegających komórek poddanych działaniu PMA wynosi od 4...

Discussion

Istnieje kilka testów do badania sygnałów aktywacji LFA-1 i adhezji limfocytów T¹². Cytometria przepływowa służy do pomiaru stanów powinowactwa LFA-1 w żywych komórkach przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się selektywnie z zgiętym lub wydłużonym LFA-1. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie bierze ona pod uwagę zachłanności integryn. Testy migracji są przydatnymi narzędziami, ale mierzą migrację, a nie nędzną adhezję w określonym punkcie czasowym. Modele mysie do badania migracji limfoc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Czytnik płytek	BioTek	Synergy H1 Hybrydowa
pipeta wielokanałowa	Fisher	21-377-829
96-dołkowa mikropłytka z dnem optycznym	Corning Costar	3603
Rekombinowany ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Przeciwciała anty-CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
Sondy molekularne	CFSE	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS zawierające wapń i magnez	Gibco
Limfocyty obwodowe	np. mysz lub człowiek
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266
Chlorek wapnia	Oprogramowanie Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5	BioTek	Wersja 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
Probówki wirówkowe o pojemności 15 i 50 ml	Fisher	352099, 352070
Jednorazowe plastikowe pipety Pasteura	Kolby	13-711-7M
T-75	Fisher	50-754-1366
Zestaw do wzbogacania limfocytów T RosetteSep	StemCell Technologies	15061