Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Summary

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Abstract

jest wymagana do wielu funkcji limfocytów T, w tym migracji do miejsc zapalnych i tworzenia synaps immunologicznych z komórkami prezentującymi antygen. Limfocyty T osiągają regulowaną adhezję poprzez kontrolowanie właściwości adhezyjnych integryn, klasy cząsteczek adhezyjnych komórek składającej się z heterodimerycznych par białek transbłonowych, które oddziałują z cząsteczkami docelowymi na komórkach partnerskich lub macierzy zewnątrzkomórkowej. Najbardziej znaną integryną limfocytów T jest antygen związany z funkcją limfocytów (LFA)-1, składający się z podjednostek αL i β2, którego celem jest wewnątrzkomórkowa cząsteczka adhezyjna (ICAM)-1. Zdolność limfocytów T do kontrolowania adhezji wynika ze zdolności do regulowania stanów powinowactwa poszczególnych integryn. Sygnalizacja wewnętrzna na zewnątrz opisuje proces, w którym sygnały wewnątrz komórki powodują, że zewnętrzne domeny integryn przyjmują stan aktywowany. Znaczna część naszej wiedzy na temat tych złożonych zjawisk opiera się na badaniach mechanistycznych przeprowadzonych w uproszczonych systemach modelowych in vitro. Opisany tutaj test adhezji limfocytów T jest doskonałym narzędziem, które pozwala limfocytom T przylegać do cząsteczek docelowych w warunkach statycznych, a następnie wykorzystuje czytnik płytek fluorescencyjnych do ilościowego określenia adhezji. Test ten okazał się przydatny w definiowaniu substancji stymulujących adhezję lub hamujących, które działają na limfocyty, a także w charakteryzowaniu zaangażowanych zdarzeń sygnalizacyjnych. Chociaż opisano tutaj dla LFA-1 - adhezji za pośrednictwem ICAM-1; test ten można łatwo dostosować, aby umożliwić badanie innych oddziaływań adhezyjnych (np. VLA-4 - fibronektyna).

Introduction

T jest podstawowym procesem odpowiedzi immunologicznej¹. Jest niezbędny do interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka zdobiącymi ściany naczyń włosowatych, do skanowania komórek prezentujących antygen (APC) w węzłach chłonnych oraz do tworzenia synaps immunologicznych (IS) z komórkami docelowymi². Wymagania te różnią się funkcjonalnie i kinetycznie. Proces wynaczynienia limfocytów składa się z chemoprzyciągania, rolowania, mocnej adhezji i transmigracji. Przejście od zwijania do twardej adhezji wymaga od limfocytów T szybkiej reakcji na sygnał receptora sprzężonego z białkiem G. Ta odpowiedź daje interakcję liganda integryn....

Protocol

1. Powlekanie studzienek mikropłytek

Uwaga: Celem tego kroku jest pokrycie powierzchni polistyrenowych ICAM-1, które mają służyć jako ligandy dla limfocytów T LFA-1.

1. Przygotuj następujące rozwiązania:
   1. Przygotować roztwór powlekający, ponownie zawieszając rekombinowany ICAM-1 z roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO_4, 2 mM KH₂PO_4, pH 7,4) wzbogaconym w wapń (1 mM CaCl₂) i magnez (2 nM MgCl₂). Upewnij się, że końcowe stężenie ICAM-1 wynosi 10 μg/ml, sporządzony z roztworu podstawowego o stężeniu ....

Results

Poniżej znajduje się przykład testu adhezyjnego z użyciem pierwotnych limfocytów T stymulowanych różnymi stężeniami przeciwciał anty-CD3. Przydatna jest znajomość fluorescencji nieumytych komórek (tj. całkowitego obciążenia). Niestymulowane komórki służą jako kontrola negatywna, a komórki traktowane PMA są kontrolą pozytywną dla przeciwciał anty-CD3. Komórki posiane w niepowlekanych studzienkach służą jako kontrola ICAM-1. W typowym eksperymencie odsetek przylegających komórek poddanych działaniu PMA wynosi od 4.......

Discussion

Istnieje kilka testów do badania sygnałów aktywacji LFA-1 i adhezji limfocytów T¹². Cytometria przepływowa służy do pomiaru stanów powinowactwa LFA-1 w żywych komórkach przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, które wiążą się selektywnie z zgiętym lub wydłużonym LFA-1. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie bierze ona pod uwagę zachłanności integryn. Testy migracji są przydatnymi narzędziami, ale mierzą migrację, a nie nędzną adhezję w określonym punkcie czasowym. Modele mysie do badania migracji limfoc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Czytnik płytek	BioTek	Synergy H1 Hybrydowa
pipeta wielokanałowa	Fisher	21-377-829
96-dołkowa mikropłytka z dnem optycznym	Corning Costar	3603
Rekombinowany ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Przeciwciała anty-CD3	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
Sondy molekularne	CFSE	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS zawierające wapń i magnez	Gibco
Limfocyty obwodowe	np. mysz lub człowiek
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266
Chlorek wapnia	Oprogramowanie Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5	BioTek	Wersja 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
Probówki wirówkowe o pojemności 15 i 50 ml	Fisher	352099, 352070
Jednorazowe plastikowe pipety Pasteura	Kolby	13-711-7M
T-75	Fisher	50-754-1366
Zestaw do wzbogacania limfocytów T RosetteSep	StemCell Technologies	15061