Artykuł metodologiczny

Protokół SIVQ-LCM dla instrumentu ArcturusXT

DOI:

10.3791/51662

⸱

23 lipca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SIVQ-LCM to innowacyjne podejście, które wykorzystuje algorytm komputerowy, Przestrzennie Niezmienniczą Kwantyzację Wektorową (SIVQ), do sterowania procesem mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM). Przepływ pracy SIVQ-LCM znacznie poprawia szybkość i dokładność mikrodysekcji, dzięki czemu ma zastosowanie zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SIVQ-LCM to nowa metodologia, która automatyzuje i usprawnia bardziej tradycyjny, zależny od użytkownika proces laserowej sekcji. Ma ona na celu stworzenie zaawansowanej, szybko konfigurowalnej technologii platformy do analizy laserowej. W tym raporcie opisujemy integrację oprogramowania do analizy obrazów Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) z instrumentem ArcturusXT. System ArcturusXT zawiera zarówno laser na podczerwień (IR), jak i ultrafiolet (UV), co pozwala na preparowanie określonych komórek lub dużych obszarów. Głównym celem jest poprawa szybkości, dokładności i powtarzalności preparacji laserowej w celu zwiększenia przepustowości próbek. To nowatorskie podejście ułatwia mikrodysekcję zarówno tkanek zwierzęcych, jak i ludzkich w przepływach pracy badawczej i klinicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotnie opracowana w połowie lat 90-tych, laserowa mikrodysekcja (LCM) umożliwia użytkownikowi precyzyjne uchwycenie określonych komórek lub obszarów komórkowych z histologicznego wycinka tkanki za pomocą wizualizacji mikroskopowej 1,2. Wiele badań porównujących analizę molekularną LCM z zeskrobinami tkanek ilustruje wartość metody3-12. Ponadto dostępne są trzy publikacje dotyczące protokołu wideo na temat tej technologii, które są dostępne do oglądania 13,14. Jednak pomimo swojej udowodnionej wartości, LCM może być żmudny i pracochłonny, gdy celem zainteresowania jest rozproszona populacja komórek w heterogenicznym przekroju tkanki lub gdy wymagana jest duża liczba komórek do określonych dalszych zastosowań, takich jak proteomika. Obciążenie spoczywające na operatorze skłoniło nas do opracowania półautomatycznego podejścia do preparacji LCM poprzez połączenie potężnego algorytmu analizy obrazu, który kieruje procesem LCM15.

We współpracy z Uniwersytetem Michigan, nasze laboratorium w NIH rozszerzyło wcześniej opracowany i zgłoszony algorytm przestrzennie niezmiennej kwantyzacji wektorów (SIVQ) w taki sposób, aby umożliwić półautomatyczną automatyzację procesu selekcji tkanek nieodłącznie związanego z kierowaną mikrodysekcją, udostępniając w ten sposób narzędzie z myślą o patologu lub naukowcu życiowym. Przestrzennie niezmienna kwantyzacja wektorowa (SIVQ) to algorytm, który pozwala użytkownikowi po prostu "kliknąć" na interesującą go cechę histologiczną, aby utworzyć wektor pierścieniowy (cechę obrazu predykatu), który można wykorzystać do przeszukania całego obrazu histologicznego, dostosowując próg statystyczny w razie potrzeby16-21. Wynikowa mapa cieplna wyświetla jakość dopasowań do początkowej funkcji obrazu predykatu, a następnie jest konwertowana na jednokolorową (czerwoną) mapę adnotacji, którą można zaimportować do instrumentu LCM. Zautomatyzowane oprogramowanie selekcyjne, AutoScanXT, jest następnie wykorzystywane do rysowania mapy na podstawie adnotacji SIVQ, która prowadzi do wychwytywania komórek docelowych z próbki tkanki. Szczegółowy protokół poniżej opisuje implementację SIVQ w procesie mikrodysekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół został zastosowany zgodnie z zasadami NIH dotyczącymi korzystania z próbek tkanek ludzkich.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Przed rozpoczęciem należy pobrać próbki tkanek ludzkich zgodnie z protokołami Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB).
  2. Wybierz rodzaj bloku tkankowego/komórkowego i odpowiednią metodę przetwarzania [zatopiona w formalinie parafina (FFPE), zamrożona lub utrwalona w parafinie utrwalonej etanolem (EFPE)]. Utrwalanie formaliny zapewnia optymalną histologię, a następnie utrwalanie etanolu i błyskawiczne zamrażanie. Jednak metody utrwalania i przetwarzania tkanek mogą wpływać na ilość i jakość DNA, RNA i białek w dalszej analizie molekularnej i powinny być brane pod uwagę.
  3. Wytnij sekcje bloku tkankowego/komórkowego na wybrany typ szkiełka (szkło, szkło membranowe lub membrana z metalową ramą). Analiza SIVQ działa równie dobrze na wszystkich trzech typach szkiełek. Należy pamiętać, że metoda pseudoszkiełka nakrywkowego (opisana poniżej) z ksylenami i etanolem nie może być wykonywana na szkiełkach membranowych z metalową ramą, ponieważ szkiełko musi być odwrócone na stoliku.
  4. Wybierz barwnik tkankowy na bazie substancji chemicznej lub IHC, aby zidentyfikować interesujące komórki na tle. Należy pamiętać, że metody barwienia mogą również wpływać na jakość i ilość DNA, RNA i białek w tkance. Przetestuj tkankę po barwieniu, aby ocenić wyjściową jakość biomolekuł przed przystąpieniem do protokołu. SIVQ-LCM wykonano na szkiełkach tkankowych/cytologicznych wybarwionych: immunohistochemią (IHC) za pomocą DAB15, immunofluorescencją, szybką czerwienią, czerwienią de novo, błękitem toluidynowym oraz hematosyliną i eozyną (H&E) (dane niepublikowane).

2. Obrazowanie próbek

  1. Załaduj szkiełka na zmotoryzowany stolik przyrządu do mikrodysekcji i uruchom odpowiednie oprogramowanie. Zaznacz pola wyboru, aby wyznaczyć pozycje załadowanych slajdów i upewnić się, że przechwycone pliki obrazów mają być zapisane w formacie jpeg.
  2. Zoptymalizuj jakość obrazu, dostosowując jasność i ostrość obrazu na ekranie za pomocą pokrętła ręcznego ustawiania ostrości lub oprogramowania przyrządu do sekcji.
    1. Korzystając z przybornika obrazu w oprogramowaniu przyrządu do sekcji, ustaw odpowiednio jasność lampy i wzmocnienie kamery. Przykładowe wartości to jasność = 60 i wzmocnienie = 220, z dyfuzorem.
    2. Ustaw ostrość ręcznie lub za pomocą funkcji autofokusa w oprogramowaniu.
  3. Przechwyć miniaturowy obraz przeglądowy slajdu, aby zapewnić mapę drogową procesu sekcji.
    1. Aby uzyskać optymalną jakość obrazu odkrytego szkiełka, należy użyć dyfuzora znajdującego się pod kondensatorem na instrumencie lub dodać niewielką ilość (~30 μl) etanolu lub ksylenów, aby poprawić wskaźnik trwałości (pseudoszkiełko nakrywkowe). Podczas używania ksylenów należy pamiętać, że są one toksyczne i należy stosować odpowiednie środki bezpieczeństwa, w tym używać dygestorium i ochronnego fartucha laboratoryjnego, okularów i rękawic.
    2. NIE umieszczaj nasadki LCM na szkiełku, dopóki roztwór etanolu lub ksylenów nie zostanie całkowicie usunięty lub polimer na nasadce zostanie zniekształcony.
  4. Poruszaj się po slajdzie i rób obrazy obszarów do przeanalizowania w powiększeniu 10x, 20x lub 40x. W razie potrzeby popraw obraz za pomocą oprogramowania, takiego jak Autokorekta (w programie Microsoft Office Picture Manager), jak opisano wcześniej22. Obrazy muszą być zapisane w formacie jpeg, aby można je było ponownie zaimportować do oprogramowania do automatycznego wyboru.

3. Analiza algorytmiczna obrazu

  1. Przenieś przechwycone obrazy z instrumentu do mikrodysekcji do folderu SIVQ. Zainstaluj i otwórz pakiety oprogramowania ArcturusXT, AutoScan i SIVQ na komputerze podłączonym do instrumentu preparacyjnego. Aby uzyskać dostęp do oprogramowania SIVQ, skontaktuj się z dr Ulyssesem Balisem (ulysses@med.umich.edu).
  2. Otwórz SIVQ i załaduj przechwycony obraz (jpeg), który Cię interesuje.
  3. Przejdź do obszaru zainteresowania i/lub dostosuj rozmiar okien wyświetlacza (Viewport 5 i 6). W oprogramowaniu SIVQ Viewport 5 pokazuje obraz wstępnie przetworzony, a Viewport 6 pokazuje obraz po przetworzeniu16.
  4. Wybierz rozmiar wektora pierścienia i liczbę pierścieni, które mają być używane.
  5. Wybierz funkcję obrazu predykatu do przechwycenia, klikając ją prawym przyciskiem myszy w rzutni 6.
  6. Kliknij "skanuj", aby przeanalizować obraz.
  7. Dostosuj statystyczne prawdopodobieństwo dopasowania obrazu za pomocą dwóch przesuwanych pasków. Górny pasek dostosowuje ogólną specyficzność wektora i służy do wykluczania obszaru z początkowego skanowania (z czułością zdefiniowaną przez wybraną zmienną "Stat"), który może reprezentować nadmierny obszar uwzględniony. I odwrotnie, dolny suwak służy do zwiększenia czułości, po wykonaniu skanowania z zamiarem zwiększenia obszaru, który jest klasyfikowany jako dopasowanie. Obie te kontrolki suwaka wykorzystują zmienną "Stat" jako początkowy próg czułości linii bazowej.
  8. Aby zapisać obraz, kliknij "zapisz jako jpeg" (obraz jest teraz zapisany w folderze c:/vq_test
    9. ).
  9. Przeanalizuj obraz za pomocą algorytmu. Wynikiem analizy algorytmu musi być obraz z adnotacjami, aby można go było użyć w SIVQ-LCM. Obecnie obecna wersja silnika SIVQ core engine jest w fazie testów beta z oczekiwaniem, że pełna wersja produkcyjna (dostępna w pierwszym kwartale 2014 r.) będzie zawierać pełny zestaw narzędzi do tworzenia oprogramowania (SDK) i interfejs programowania aplikacji (API) w celu uproszczonej integracji generowanych przez użytkownika filtrów przestrzennych i dalszych etapów przetwarzania danych przepływu pracy z silnikiem dopasowywania pierścieni rdzeniowych. Ten pakiet SDK będzie dystrybuowany wraz z kompletnym zestawem dokumentacji.
    1. Upewnij się, że mapa cieplna SIVQ została zmieniona na jednolity czerwony kolor.
  10. Wyeksportuj obraz. Konieczne jest ponowne osadzenie współrzędnych pozycyjnych na obrazie jpeg po analizie za pomocą edytora szesnastkowego w celu wklejenia nagłówka pliku z oryginalnego obrazu instrumentu do sekcji. Odpowiednie dane można znaleźć między znacznikiem "Początek obrazu" (0xFF, 0xD8) a pierwszym znacznikiem "Zdefiniuj tabelę kwantyzacji" (0xFF, 0xDB).

4. Mikrodysekcja

  1. Umieść nasadkę LCM na środku obszaru zainteresowania, w którym obrazy zostały przechwycone do analizy SIVQ.
  2. Kalibracja i kontrola jakości (QC) laserów UV/IR oraz optymalizacja parametrów, w tym mocy, czasu trwania, lokalizacji lasera i prędkości cięcia UV (zgodnie z zaleceniami producenta). Wykonaj te kalibracje przed ponownym zaimportowaniem analizowanego obrazu.
  3. Otwórz AutoScanXT (oprogramowanie do automatycznego wyboru) i zaimportuj analizowany obraz z folderu c:/vq_test
    4. .
  4. Przeszkol oprogramowanie do automatycznego doboru, aby rozpoznawało adnotację SIVQ i tworzyło mapę sekcji.
    1. Aby utworzyć plik treningowy, wybierz cztery obszary zainteresowania (oznaczone "niebieskimi kółkami") na "czerwonej farbie" analizowanego obrazu SIVQ.
    2. Zaznacz obszary tła (oznaczone "czerwonymi kwadratami"), które nie mają być analizowane.
    3. Kliknij przycisk "Analizuj", aby wygenerować plik treningowy, który można zapisać do kolejnych zastosowań.
  5. Wykonaj mikrodysekcję za pomocą odpowiednich laserów na podczerwień (IR) i/lub ultrafiolet (UV).
    1. Skopiuj zaznaczone obszary na obraz "na żywo".
    2. W przyborniku "mikrodysekcja" wybierz odpowiednie przyciski przechwytywania podczerwieni lub cięcia UV.
  6. Po zakończeniu sekcji przenieś nasadkę LCM do stacji kontroli jakości i uchwyć obraz wypreparowanej tkanki/komórek. Innym podejściem jest umieszczenie nasadki na pustym obszarze zamka przed przeniesieniem go do stacji kontroli jakości, co pozwala użytkownikowi na robienie zdjęć w różnych powiększeniach.
  7. Uchwyć obraz obszaru zainteresowania tkanki po mikrodysekcji, aby dokładniej ocenić wydajność podnoszenia.
  8. Jeśli żądane komórki zostały pomyślnie wypreparowane, kliknij przycisk "obecny etap" w oprogramowaniu ArcturusXT i zdejmij nasadkę LCM, aby rozpocząć procedurę ekstrakcji molekularnej do dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przekrój tkanki piersi człowieka utrwalonej w FFPE poddano immunobarwieniu na cytokeratynę AE1/AE3 z zastosowaniem standardowego protokołu IHC23. Po barwieniu preparat tkankowy umieszczono na stole urządzenia ArcturusXT i rozpoczęto protokół SIVQ-LCM zgodnie z powyższym opisem. Ponieważ tkanka nie może zostać przykryta szkiełkiem przedstawkowym przed mikrodyssekcją, komórki zabarwione IHC+ mogą być trudne do rozróżnienia wizualnie (Rycina 1A). Aby zapewnić lepsze dopasowanie współczynnika zała...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół zastosowania SIVQ-LCM do mikrodysekcji komórek nabłonka wybarwionych immunologicznie z ludzkiej tkanki piersi FFPE. Zastosowanie algorytmu analizy obrazu, takiego jak SIVQ, skraca czas potrzebny na proces mikrodysekcji. Jest to potencjalnie ważny postęp w tej dziedzinie, ponieważ czas i wysiłek operatora jest zazwyczaj krokiem ograniczającym szybkość precyzyjnej sekcji komórek będących przedmiotem zainteresowania. W niniejszym protokole specjalnie dostosowaliśmy naszą procedurę do instrumentu Arctu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Michael R. Emmert-Buck jest wynalazcą patentów NIH obejmujących mikrodysekcję wychwytywania laserowego i otrzymuje płatności oparte na tantiemach za pośrednictwem Programu Transferu Technologii NIH.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka szklane z dodatnio naładowanym ładunkiemThermo Scientific4951Plus-001
Ksyleny, odczynnik ACS, ≥ 98,5% ksylenów + etylobenzen Sigma Aldrich247642UWAGA: PROSZĘ STOSOWAĆ ODPOWIEDNIE PROCEDURY BEZPIECZEŃSTWA.
Alkohol etylowy, U.S.P. 200 Proof, bezwodnyThe Warner-Graham Company6.505E+12UWAGA: PROSZĘ STOSOWAĆ ODPOWIEDNIE PROCEDURY BEZPIECZEŃSTWA.
Arcturus CapSure Macro LCM CapsLife TechnologiesLCM0211
ArcturusXT Laserowy instrument do mikrodysekcjiTechnologie żywotnościARCTURUSXT
AutoScanXT SoftwareLife TechnologiesOpcjonalny program do analizy obrazu dla laserowego urządzenia do mikrodysekcji ArcturusXT. Jest to oprogramowanie wymagane dla SIVQ-LCM.
Przestrzennie niezmienna kwantyzacja wektorowa (SIVQ)Uniwersytet MichiganTen pakiet narzędzi jest publicznie dostępny do współpracy akademickiej. W celu uzyskania dostępu do algorytmu SIVQ prosimy o kontakt z dr Ulyssesem Balisem [Ulysses@med.umich.edu]

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  2. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  3. Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
  4. El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
  5. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
  6. Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
  7. Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
  8. Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
  9. Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
  10. Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48(2011).
  11. Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13(2009).
  12. Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711(2013).
  13. Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
  14. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
  15. Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19(2011).
  16. Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13(2011).
  17. Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
  18. Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
  19. Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
  20. Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37(2011).
  21. Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
  22. Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
  23. Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Laserowa mikrodysekcja przechwytuj caprzestrzennie niezmiennicza kwantyzacja wektorowaoprogramowanie do analizy obrazulaser podczerwono ultrafioletowymikrodysekcja tkanekoprogramowanie do automatycznego wyboruprzetwarzanie obraz w JPEGprocedura ekstrakcji molekularnej

Powiązane artykuły