Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51666

⸱

24 czerwca 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek przy użyciu pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej za pomocą konfokalnej mikroskopii wirującego dysku. Umożliwia to szczegółowe obserwacje procesów komórkowych w żywych kardiomiocytach.

Streszczenie

Pierwotne kardiomiocyty noworodków szczurów są przydatne w podstawowych badaniach układu krążenia in vitro, ponieważ można je łatwo wyizolować w dużej liczbie podczas jednej procedury. Ze względu na postęp w technologii mikroskopowej, stosunkowo łatwo jest uchwycić obrazy żywych komórek w celu zbadania zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym, przy minimalnych obawach dotyczących fototoksyczności komórek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykonywać obrazy poklatkowe żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów za pomocą konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej w celu modulacji właściwości komórki. Zastosowanie dwóch różnych typów wirusów ułatwia osiągnięcie odpowiedniej szybkości transdukcji i poziomów ekspresji dla dwóch różnych genów. Dobrze wyostrzone obrazy żywych komórek można uzyskać za pomocą systemu autofokusa mikroskopu, który utrzymuje stabilną ostrość przez długi czas. Stosując tę metodę, można analizować funkcje egzogennie modyfikowanych białek ulegających ekspresji w hodowanych komórkach pierwotnych. Dodatkowo system ten może być wykorzystany do badania funkcji genów poprzez wykorzystanie siRNA, a także modulatorów chemicznych.

Wprowadzenie

Pierwotne kardiomiocyty noworodków szczurów od dawna są używane do badania funkcji kardiomiocytów in vitro1. Łatwo je odizolować od szczeniąt szczurów za pomocą kilku dobrze znanych metod2-4. Najczęstsza metoda wykorzystuje kolagenazę lub trypinę do trawienia tkanki łącznej serca przed izolacją komórek. Naukowcy opracowali również metody izolowania kardiomiocytów od dorosłych gryzoniw wieku 5-8 lat, a także od nowonarodzonych myszy9,10.

Ten protokół opisuje metodę izolowania kardiomiocytów od nowonarodzonych szczurzych szczeniąt, wykorzystując dwuetapową procedurę trawienia enzymatycznego. Trypsynę najpierw stosuje się O/N w temperaturze 4 °C, a następnie oczyszczoną kolagenazę w temperaturze 37 °C. Inkubacja tkanki serca z trypsyną O/N w temperaturze 4 °C zmniejsza liczbę etapów niezbędnych do pobrania komórek w porównaniu z metodami wykorzystującymi sekwencyjne inkubacje w ciepłym roztworze enzymu2. Ponadto, dzięki zastosowaniu oczyszczonej kolagenazy zamiast surowych enzymów, można wyeliminować zmienność między partiami, zapewniając w ten sposób lepszą odtwarzalność.

Badania funkcjonalne konkretnego białka często wykorzystują system ekspresji białek przy użyciu adenowirusa11-13 i/lub lentiwirusa14-16. [UWAGA OSTRZEGAWCZA] Produkcja i manipulacja wirusem powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi NIH.

Adenowirus nie integruje się z genomem gospodarza. Ma bardzo wysoką skuteczność transdukcji w większości typów komórek, w tym w komórkach dzielących się i niedzielących się, a także w komórkach pierwotnych i ustalonych liniach komórkowych. To sprawia, że adenowirus jest wiarygodnym wektorem ekspresji genów. Wysoki poziom białka kodowanego przez wektor adenowirusa rozwija się w ciągu 48 godzin po transdukcji i może utrzymywać się przez kilka tygodni17. Jednak jedną z wad stosowania adenowirusa do ekspresji białek jest to, że opracowanie rekombinowanego adenowirusa jest zarówno skomplikowane, jak i czasochłonne. Ta wada wyjaśnia częściowo, dlaczego wielu badaczy zwraca się do lentiwirusów w celu rekombinowanej ekspresji genów. W przeciwieństwie do konstruktów adenowirusowych, generowanie konstruktu lentiwirusowego jest szybkie i łatwe. Chociaż lentiwirusy mają na ogół niższą skuteczność transdukcji niż adenowirusy, zarówno w komórkach dzielących się, jak i niedzielących się, integrują się z genomem gospodarza. W związku z tym ekspresja transdukowanego genu jest bardziej stabilna w przypadku lentiwirusów niż w przypadku adenowirusów.

Ze względu na postęp technologiczny w dziedzinie mikroskopii, znacznie łatwiej jest uchwycić obrazy żywych komórek wyrażających rekombinowane białka. Dzieje się tak nawet przy szybkościach akwizycji wideo. Dzięki temu badacz może określić, w jaki sposób poszczególne zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania wpływają funkcjonalnie na komórkę w czasie rzeczywistym. Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem ma kilka kluczowych cech, które sprawiają, że jest to optymalna technika obrazowania żywych komórek18,19. Wirujący dysk Yokogawa pozwala na znacznie szybszą akwizycję obrazu, przy jednoczesnym wykorzystaniu znacznie mniejszej mocy lasera niż punktowe skaningowe mikroskopy konfokalne. Obie te szczególne cechy wynikają z obracającego się dysku, który zawiera liczne otwory konfokalne, przez które laser przechodzi jednocześnie do próbek. Podczas akwizycji sam dysk obraca się szybko i nieprzerwanie18-20. Dzięki zastosowaniu systemu autofokusa mikroskopu stabilna ostrość jest utrzymywana przez długi czas. Dzięki temu naukowcy mogą wykonywać dobrze wyostrzone obrazy żywych komórek. Pozyskane obrazy są odtwarzane jako plik filmowy. Obrazy są analizowane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ21,22, FIJI23 lub innego dostępnego na rynku oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja kardiomiocytów noworodków szczurów

  1. Jako pożywkę hodowlaną należy użyć zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco i minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną/streptomycyną (P/S). Dodaj bromodeoksyurydynę (BrdU) do pożywki, aby zapobiec wzrostowi fibroblastów przez pierwsze 2 dni po izolacji.
Podłoże bazoweFBS (Sieć UsługowaBrdU (mM)Wskaźnik P/S (U/ml)
selekcjaDMEM (DMEM)10%020
Pierwszy dzieńDMEM (DMEM)10%0,110
Następnego dniaDMEM/MEM5 proc.0,110
Dalsza kulturaDMEM/MEM5 proc.010

Tabela 1: Pożywka dla kardiomiocytów noworodków szczurów. Użyj tej pożywki do hodowli kardiomiocytów noworodków szczurów. DMEM/MEM to mieszanina 1:1 DMEM i pożywki MEM.

1.1) Izolacja kardiomiocytów, Dzień 1 (Szacowany wymagany czas, około 1 godziny)

UWAGA: W przypadku pracy z noworodkami gryzoni, zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi uniwersyteckimi i zasadami ustalonymi przez programy opieki nad zwierzętami oraz przestrzegaj instytucjonalnie zatwierdzonych protokołów dla zwierząt. Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Yale Animal Resource Center.

  1. Przygotować odczynniki i narzędzia: niezawierający wapnia i magnezu zrównoważony roztwór soli Hanka (CMF HBSS), 30 ml x 2, 10 ml x 2, na lodzie; 1 mg trypsyny, rozpuszczonej w 2 ml CMF HBSS, na lodzie; narzędzia w autoklawie; 70% etanol (EtOH) w zlewce o pojemności 250 ml; cztery wysterylizowane plastikowe naczynia o średnicy 10 cm, trzy do izolacji serc i jedna do trypsynizacji.
  2. Zamów 1 miot 1-dniowych i 2-dniowych szczeniąt szczurów (około 10 młodych) wraz z matką u dystrybutora zwierząt doświadczalnych.
  3. Dzień 1, Przenieś młode do małej klatki i poddaj matkę eutanazji za pomocą koktajlu ketaminy/ksylazyny (ketamina, 200 ml / 10 g i ksylazyna 20 ml / 10 g) przedawkowania.
  4. Weź jedno szczenię i wysterylizuj całe jego ciało za pomocą 70% EtOH. Odetnij głowę szczeniaka dobrze utrzymanymi ostrymi nożyczkami chirurgicznymi na wysterylizowanym plastikowym naczyniu o średnicy 10 cm w miejscu odizolowanym od innych szczeniąt.
    UWAGA: Aby pobrać próbki tak szybko, jak to możliwe, najlepiej jest użyć najszybszej i najskuteczniejszej metody zakończenia życia gryzonia. Dekapitacja, jeśli jest właściwie stosowana przez wykwalifikowanych specjalistów z dobrze utrzymanym sprzętem, może skutkować mniejszym strachem i niepokojem u zwierzęcia oraz być szybsza i bardziej praktyczna niż inne formy eutanazji. Jest to zgodne z zaleceniami Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych Wytyczne dotyczące eutanazji zwierząt.
  5. Usuń bijące serce za pomocą wysterylizowanych narzędzi i umieść serce w 30 ml chłodzonego lodem CMF HBSS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. UWAGA: Wyjmij serca tak szybko, jak to możliwe i natychmiast połóż je na lodzie. Po usunięciu serc z ciała wszystkie zabiegi należy wykonywać na lodzie.
  6. Zbierz 5 serc w 30 ml schłodzonego lodem CMF HBSS, a pozostałe 5 serc w kolejnych 30 ml schłodzonego lodem CMF HBSS. Zakręć rurką, aby wypłukać serca. UWAGA: Po tym kroku wykonaj wszystkie procedury w okapie z przepływem laminarnym.
  7. Odrzuć supernatant i przenieś serca do nowego wysterylizowanego plastikowego naczynia o średnicy 10 cm na lodzie. UWAGA: Uważaj, aby nie zasysać serc aspiratorem.
  8. Usuń duże naczynia i/lub niepożądane tkanki. Dodaj 10 ml schłodzonego lodem CMF HBSS do naczynia, aby opłukać serca.
  9. Przełóż wszystkie serca do nowego wysterylizowanego plastikowego naczynia o średnicy 10 cm na lodzie. Zmielić serca nożyczkami na mniej niż 1 mm3 na lodzie.
  10. Dodać 9 ml schłodzonego CMF HBSS. Dodać 1 ml schłodzonej trypsyny rozpuszczonej za pomocą CMF HBSS (końcowe 50 μg/ml).
  11. Uszczelnij naczynie folią parafilmową i przykryj folią aluminiową, a następnie umieść na noc w chłodni (4 °C).

1.2) Izolacja kardiomiocytów, Dzień 2 (Szacowany wymagany czas, około 4 godzin)

  1. Przygotować odczynniki i narzędzia: 50 ml stożkowa probówka x 2; 2 mg inhibitora trypsyny, rozpuszczona w 1 ml CMF HBSS, na lodzie; 1500 jednostek kolagenazy rozpuszczonej w 5 ml Leibovitz L-15, w temperaturze pokojowej (RT); Leibovitz L-15, rozpuszczony w 1 litrze wysterylizowanej wody i przefiltrowany przez filtr 0,22 mikrona, 8 ml w temperaturze pokojowej; 10 mg/ml (32,6 mM) BrdU w wodzie; P/S; DMEM + 10% FBS; MEM; dwie plastikowe naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 10 cm; Naczynia ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm.
  2. Dzień 2, Przygotowanie potraw pokrytych żelatyną. Dodaj 1 ml 0,1% roztworu żelatyny, aby pokryć naczynie ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm do eksperymentu obrazowego. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C przez kilka godzin, a następnie odessać i wyrzucić roztwór żelatyny przed użyciem.
    UWAGA: Naczynie ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm nadaje się do eksperymentu obrazowego przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Do ekstrakcji białek z pierwotnych kardiomiocytów w celu wykrycia ekspresji białek za pomocą western blotting (WB) można użyć 0,1% pokrytych żelatyną plastikowych naczyń do hodowli komórek.
  3. Przenieś całą tkankę serca trawioną przez trypsynę przez noc z buforem do stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie w wysterylizowanym kapturze. Dodać 1 ml inhibitora trypsyny do CMF HBSS (końcowe 182 ug/ml). Zamknij szczelnie pokrywę stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  4. Inkubować probówkę przez około 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu ogrzania tkanki i buforowania do temperatury 30-37 °C. Dodać 5 ml kolagenazy w Leibovitz L-15 (końcowe 94 jednostki/ml). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, delikatnie wstrząsając (wytrząsarka 170-200 obr./min w inkubatorze o temperaturze 37 °C).
    UWAGA: Ten krok można wykonać na zewnątrz okapu z przepływem laminarnym. Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w RT.
  5. Zdezynfekuj zewnętrzną część stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 70% EtOH i umieść ją w wysterylizowanym kapturze.
  6. Rozcieraj tkanki za pomocą automatycznej pipety z pipetowaniem z prędkością 3 ml/s 20 razy. Pozostawić resztki tkanek do osadzenia się na 3 minuty i przefiltrować supernatant za pomocą sitka komórkowego o ciśnieniu 70 μm.
    UWAGA: Do rozcierania można użyć pipety o standardowym rozmiarze 10 ml.
  7. Dodać 5 ml leibovitz L-15 do pozostałych grudek tkanki, a następnie rozcierać i ponownie przefiltrować supernatant. Umyj sitko do komórek 2 ml Leibovitz L-15.
  8. Umieść przefiltrowany roztwór komórkowy w kapturze na 20 – 60 minut, aby kolagenaza mogła strawić częściowo zdegradowany kolagen.
  9. Komórki osadu w ilości 100 x g przez 5 min. Ponownie zawiesić komórki w 20 ml DMEM zawierającym 10% FBS i wysokim stężeniu P/S (20 U/ml).
  10. Wstępnie płytkie komórki na dwóch 10 cm plastikowych szalkach do hodowli komórek przez 1 godzinę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w celu selekcji kardiomiocytów. UWAGA: Fibroblasty łatwiej przyczepiają się do dna naczynia niż kardiomiocyty.
  11. W oczekiwaniu przygotuj DMEM zawierający 10% FBS, P/S (10 U/ml) i 0,1 mM BrdU. Dodać 1 ml 10 mg/ml BrdU do 325 ml DMEM zawierającego 10% FBS i P/S.
  12. Delikatnie zamieszać szalki i zebrać kardiomiocyty zawierające supernatant z dwóch 10 cm szalek.
    UWAGA: Większość kardiomiocytów będzie nadal unosić się w supernatancie po 1 godzinie inkubacji. Aby uniknąć zanieczyszczenia fibroblastami, które są lekko przyczepione do naczynia, nie należy zbierać supernatantu przez pipetowanie.
  13. Opcjonalnie> Policz komórki w supernatancie z 0,2% błękitem trypanowym i bez niego, aby sprawdzić żywotność komórek.
  14. Komórki osadu w ilości 100 x g przez 5 min. Ponownie zawiesić komórki w DMEM zawierające 10% FBS, P/S (10 U/ml) i 0,1 mM BrdU. Komórki płytkowe o wymiarach 2 x 105 komórek/półmisek w pokrytych żelatyną naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm do obserwacji za pomocą mikroskopu. UWAGA: Nie należy przeszkadzać komórkom po posiewie przez co najmniej 24 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  15. Dzień 3, zmień pożywkę 24 godziny po posiewie na DMEM/MEM zawierającą 5% FBS, P / S i 0,1 mM BrdU.
  16. Dzień 4, zmień podłoże 48 godzin po posiewie na DMEM/MEM zawierające 5% FBS i P/S.
    UWAGA: Zmieniaj podłoże co 2-3 dni za pomocą DMEM/MEM zawierającego 5% FBS i P/S.

2. Transdukcja lentiwirusowa

2.1) Pakowanie plazmidów lentiwirusowych

UWAGA: Proszę zapoznać się z innymi źródłami w celu uzyskania dalszych szczegółowych informacji na ten temat 24-26. Przygotowanie roztworu lentiwirusowego zajmie około 3 dni. Najlepiej jest stosować świeży roztwór lentiwirusowy, aby osiągnąć wyższą wydajność transdukcji. Równolegle rozpocząć pakowanie plazmidów lentiwirusowych i izolację kardiomiocytów noworodków szczurów. Zamiast używać polietylenoiminy (PEI) 27 do pakowania plazmidów lentiwirusowych, można użyć dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Przygotuj odczynniki i narzędzia; Komórki HEK 293T, 10 cm plastikowe szalki do hodowli komórek, roztwory plazmidów lentiwirusowych (pMDLg/pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, wektor przenoszący lentiwirusa, 1,0 mg/ml każda), 1 g/l PEI, pożywka bez surowicy, 20 mM chlorochina w wodzie, 10% wybielacz, 1% SDS w 70% EtOH
  2. Dzień 0, Płytka 2-2,5 x 106 komórek HEK 293T na 10 cm naczynie dzień przed transfekcją.
    UWAGA: Optymalna jest konfluencja 30-60% podczas transfekcji.
  3. Dzień 1, Przygotowanie roztworu do transfekcji PEI. Dodaj 30 ul 1 g/l PEI do 960 ul pożywki bez surowicy w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodaj 4 plazmidy do roztworu transfekcji PEI w probówce o pojemności 1,5 ml i wymieszaj, stukając.
Rozdział pkt. pkt. wirusa) pkt. pkt.
Nazwa plazmidunutaRozmiar (kbp)Objętość dodana (ml)Ilość końcowa w naczyniu 10 cm (mg)Końcowe stężenie w naczyniu 10 cm (pM)
Wektor transferu lentiwirusowegokoduje gen, który ma być zapakowany9-133,6-5,23,6-5,260
pMDLg/pRREwyraża HIV-1 GAG/POL8,81,761,76Rozdział 30
pRSV-Rev (wersjawyraża HIV-1 REV4.10,820,82Rozdział 30
pMD2.Gwyraża VSV G5,8Pytanie 1,16Pytanie 1,16Rozdział 30

Tabela 2: Ilość plazmidów do pakowania lentiwirusów. Użyj tych ilości plazmidu, aby transfekować komórki HEK293 w 10-centymetrowych naczyniach. Ostateczna ilość wektora przenoszącego lentiwirusa na szalkę może się różnić w zależności od jego wielkości, należy utrzymać końcowe stężenie na szalkę na poziomie 60 pM. Średnia masa cząsteczkowa jednej pary zasad dwuniciowego DNA wynosi 660 daltonów.

  1. Wyrzuć starą pożywkę z 10 cm szalki komórek HEK 293T i delikatnie dodaj 9 ml nowej pożywki (DMEM + 10% FBS, bez P/S).
  2. Delikatnie dodaj mieszaninę PEI-DNA kroplami na płytkę i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać z podłożem. Dodać 10 ul 20 mM chlorochiny (końcowe 20 uM) do 10 ml pożywki. UWAGA: Uważa się, że chlorochina zmniejsza degradację kompleksów transfekcyjnych zawierających plazmid poprzez częściową neutralizację pH w przedziałach lizosomalnych 28.
  3. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 6 godzin. Następnie usunąć pożywkę zawierającą mieszaninę PEI-DNA i dodać 10 ml nowej pożywki (DMEM + 10% FBS + 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), pH 7,4 + P/S). UWAGA: Po inkubacji wirus zostanie wyprodukowany w pożywce. Zasysające pipety i/lub końcówki Pasteura muszą być odkażone 10% wybielaczem. Powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego i potencjalnie skażony sprzęt należy zawsze odkażać 70% EtOH, niezależnie od tego, czy supernatant został rozlany, czy nie. Jeśli doszło do rozlania, konieczna jest dokładna dekontaminacja za pomocą 1% SDS w 70% EtOH.
  4. Dzień 2-3, inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 48-72 godziny. Dzień 4, zebrać roztwór lentiwirusa (przejdź do sekcji 2.2).
    UWAGA: Podłoże można zmienić po 48 godzinach od transfekcji. Dwukrotne zbieranie supernatantu wirusa przez 48 godzin i 72 godziny może doprowadzić do uzyskania roztworów wirusa o wyższym mianie.

2.2) Zbieranie roztworu lentiwirusowego i transdukcja

  1. Przygotuj odczynnik i narzędzia: 15 ml probówki stożkowe, 1 M HEPES, pH 7,4 (filtrowane 0,22 um)
  2. Dzień 4, Zebrać supernatant zawierający cząstki lentiwirusa (roztwór lentiwirusowy) za pomocą 10 ml wysterylizowanej strzykawki Luer-Lok, a następnie przefiltrować supernatant przez filtr 0,45 um do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 1/100 objętości 1 M HEPES pH 7,4 do przefiltrowanego roztworu lentiwirusowego (końcowe 10 mM).
    UWAGA: Do filtrowania należy używać wyłącznie filtrów z octanu celulozy lub polieterosulfonu (PES) (o niskim poziomie wiązania białka). Nie używaj filtrów nitrocelulozowych. Nitroceluloza wiąże białka powierzchniowe na otoczce lentiwirusowej i niszczy wirusa.
  3. Usunąć pożywkę z 3,5 cm szalek z kardiomiocytami noworodków szczurów, otrzymanych na ostatnim etapie sekcji 1.2, dodać 1 ml przefiltrowanego roztworu lentiwirusowego do szalki o średnicy 3,5 cm.
  4. Dodaj bromek heksadimetryny (końcowe stężenie 4-6 ug / ml).
    UWAGA: Bromek heksadimetryny może zwiększać skuteczność transdukcji lentiwirusa. Należy zoptymalizować stężenie bromku heksadimetryny.
  5. Inkubować naczynie przez 6 godzin w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C w celu transdukcji lentiwirusa, a następnie zmienić pożywkę na nową DMEM/MEM zawierającą 5% FBS i P/S. Naczynie do inkubacji w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
    UWAGA: Integrację genu egzogennego z genomem gospodarza przez lentiwirusa uważa się za zakończoną po upływie 72 godzin.
  6. Dzień 7: Użyj komórek z kroku 2.2.5 w następnym kroku. UWAGA: Ekspresję białka z plazmidu lentiwirusowego można potwierdzić za pomocą WB lub immunocytochemii (ICH) po 48-72 godzinach transdukcji w celu określenia względnego poziomu ekspresji (ryc. 1a i 1b).

2.3) Stężenie roztworu lentiwirusowego

UWAGA: Najlepiej jest używać świeżego roztworu lentiwirusowego, aby osiągnąć najwyższą skuteczność transdukcji, w przypadku, gdy miano roztworu lentiwirusowego nie jest wystarczająco wysokie, roztwór lentiwirusowy może być zagęszczony przez wytrącanie glikolu polietylenowego (PEG) 29.

2.3.1) Przygotowanie 4x roztworu PEG (32% PEG6000, 400 mM chlorek sodu (NaCl), 40 mM HEPES pH 7.4)

  1. Na 125 ml 4x roztwór PEG odważyć 40 g PEG6000, a następnie rozpuścić w 60 ml wody.
    UWAGA: Liczba po PEG to średnia masa cząsteczkowa (tj. średnia masa cząsteczkowa PEG6000 wynosi 6,000).
  2. Powoli dodawać 10 ml 5 M NaCl. Powoli dodawać 5 ml 1 M HEPES o pH 7,4. Dostosować pH do 7,4 za pomocą 2 M wodorotlenku sodu.
  3. Dodać wodę do 125 ml. Wysterylizować 4x roztwór PEG przez filtrację membranową z filtrem 0,22 um i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2.3.2) Koncentracja lentiwirusa

  1. Przefiltrować supernatant transdukowany lentiwirusem do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą filtra 0,45 μm.
  2. Dodać 4x roztwór PEG w stosunku 1:3 (roztwór PEG:supernatant = 1:3). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 16-48 godzin.
  3. Wirować przy 2.600 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min. Odwirować przy 2.600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Odwirować przy 2.600 x g w temperaturze 4 °C.
  4. Ostrożnie wyrzucić supernatant, aby uniknąć naruszenia osadu. Zawiesić osad w podłożu bez surowicy, używając 1/2 do 1/25 objętości pierwotnej objętości supernatantu.
  5. Stosować bezpośrednio lub zamrozić za pomocą ciekłego azotu, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C

3. Transdukcja adenowirusowa

UWAGA: Proszę zapoznać się z innymi źródłami w celu uzyskania informacji o metodach budowy i rozmnażania konstruktów adenowirusowych 13. Zasysające pipety i/lub końcówki Pasteura muszą być odkażone 10% wybielaczem. Zawsze odkażaj powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego i potencjalnie skażony sprzęt 70% EtOH, niezależnie od tego, czy supernatant został rozlany. Jeśli doszło do rozlania, konieczna jest dokładna dekontaminacja za pomocą 1% SDS w 70% EtOH.

  1. Miareczkowanie adenowirusa o 50% dawki zakaźnej w hodowli tkankowej (TCID50)
    UWAGA: Przed transdukcją konieczne jest miareczkowanie roztworu podstawowego adenowirusa. TCID50 jest jedną z najlepszych metod miareczkowania roztworu wirusowego. Ponieważ metoda ocenia miano na podstawie zdolności zakaźnej komórek HEK 293T, obliczony TCID50 odzwierciedla rzeczywistą infekcyjność zasobu adenowirusa. PFU (jednostki tworzące płytkę nazębną) są proporcjonalne do TCID50 ze współczynnikiem około 0,56 30.
    1. Przygotowanie komórek i narzędzi: Komórki HEK 293T, 10-centymetrowe szalki do hodowli komórkowych, 96-dołkowa płaska płytka do hodowli komórek, 8-kanałowa pipeta wielokanałowa
    2. Przygotuj 70-90% zlewających się komórek HEK 293T w jednym 10 cm naczyniu.
    3. Przeprowadzić wstępne rozcieńczenie 1:10-4 zapasu wirusa. Dodaj 50 ul DMEM + 10% FBS do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórek z płaskim dnem. Dodać 25 μl wstępnie rozcieńczonego wywaru wirusowego do pierwszego rzędu, od A do H.
    4. Dobrze wymieszaj i przenieś 25 ul z pierwszego rzędu studzienek do drugiego rzędu za pomocą 8-kanałowej pipety wielokanałowej. Powtórzyć rozcieńczenie roztworu wirusa w stosunku 1:3 do każdego rzędu studzienek do 11 rzędu włącznie i wyrzucić ostatnie 25 ul.
    5. Rozcierać komórki HEK 293T w 10 ml DMEM + 10% FBS. Dodaj 50 ul roztworu komórkowego do każdej studzienki z rzędów od 1 do 12.
    6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 11-13 dni. Dodaj 50 ul DMEM + 10% FBS po 4-5 dniach i 7-8 dniach powlekania.
    7. Zmierz efekty cytopatyczne w każdym dołku po 11-13 dniach od zakażenia.
pkt. pkt. pkt. pkt.
alejka123456789101112
Rząd Addddddddd　　　
Rząd Bddddddddd　　　
Rząd Cddddddddd　　　
Rząd Dddddddd　　　　　
Rząd Eddddddddddd　
Rząd Fddddddd　　　　　
Rząd Gdddddddd　　　　
Rząd Hddddddddddd　
liczba dołków dodatnich w rzędzie888888865cyfra arabskacyfra arabska0
Stosunek dodatnich studzienek na rząd11111110,750,630,250,250

d Wyświetlanie ponad 50% efektów cytopatycznych
Wykazywanie poniżej 50% lub brak efektów cytopatycznych

Tor 1, rozcieńczenie 31x104; tor 2, rozcieńczenie 32x104; ... ; tor 11, rozcieńczenie 32x1011; tor 12, kontrola.
S = suma stosunków dołków dodatnich na wiersz
= 1+1+1+1+1+1+1+1+0,75+0,63+0,25+0,25 +0= 8,875
TCID50 = 3 x 104 x 3 x (8,875-0,5) = 2,97 x 108
Identyfikator TCID50/ml = 5,94 x 109

Tabela 3: Przykład zakażonej płytki 96-dołkowej po 10 dniach inkubacji. Zmierz efekty cytopatyczne w każdym dołku i zsumuj proporcje dodatnich dołków na rząd.

  1. Obliczać miano według wzoru Kaerbera 31,
    TCID50 = (rozcieńczenie pierwszego pasa) x (rozcieńczenie)(S-0,5)
    S = suma stosunków dołków dodatnich na wiersz
    UWAGA: Dla tego protokołu TCID50 = (30000) x (3)(S-0,5). Ponieważ w tym protokole stosuje się 50 ul roztworu wirusowego, podziel TCID50 przez 0,05, aby obliczyć TCID50 / ml.

3.2) Transdukcja adenowirusowa

formułaprzykład
MOI = PFU wirusa / liczba komórek100 (MOI) = 6 (ml) x 5,94 x 106 (TCID50/ml) x 0,56 /
2 x 105 (komórki)

PFU jest proporcjonalny do TCID50 ze współczynnikiem około 0,56,
Miano wirusa, na przykład = 5,94 x 109 (TCID50/ml) = 5,94 x 106 (TCID50/μl)
Przykład: Dodać 6 ml wywaru wirusa o mianie 5,94 x 109 (TCID50/ml) do naczynia zawierającego 2 x 105 komórek, aby uzyskać MOI równy 100.

Tabela 4

  1. Obliczyć wymaganą ilość roztworu adenowirusa na podstawie jego miana (PFU/ml, cząsteczka wirusa/ml lub TCID50/ml). Użyj wzoru, aby obliczyć MOI (wielokrotność infekcji).
  2. Dodać obliczoną ilość roztworu wirusa do podłoża pozbawionego surowicy (patrz Tabela 5). Dobrze wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
Rozdział szt. szt.
MOI (Urząd Miasta)Objętość z zapasów (ml)Objętość do dodania pożywki wolnej od surowicy (ml)Objętość do dodania do potrawy (ml)
13Rozdział 197cyfra arabska
33Rozdział 1976
103Rozdział 19720
Rozdział 303Rozdział 19760
1006Rozdział 194200

Tabela 5

  1. Dzień 7, Weź naczynie otrzymane w ostatnim kroku sekcji 2.2 i zastąp pożywkę 750 ul nowego DMEM / MEM zawierającego 5% FBS i P / S.
    UWAGA: Zmniejszenie objętości medium podczas transdukcji do około 50% pierwotnej objętości ma kluczowe znaczenie dla wysokiej wydajności transdukcji.
  2. Dodaj rozcieńczony roztwór wirusa do naczynia. Naczynie do inkubacji przez 4-8 godzin w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Następnie zastąp je świeżym podłożem.
  3. Naczynie do inkubacji przez 24–48 godzin w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. W dniach 8-9 użyj komórek do eksperymentu obrazowania żywych komórek. UWAGA: Ekspresję białka z plazmidu adenowirusowego można potwierdzić za pomocą WB lub ICH po 24-48 godzinach transdukcji w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka (Figura 1c i 1d).

4. Obrazowanie żywych komórek

4.1) Akwizycja obrazu za pomocą konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem z komorą o kontrolowanej temperaturze i systemem środowiskowym CO2 (opcjonalnie)

  1. Włączyć system kontroli temperatury co najmniej 1 godzinę przed akwizycją, tak aby wszystkie urządzenia osiągnęły równowagę do 37 °C przed rozpoczęciem akwizycji. Włącz system konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem (komputer do obsługi, mikroskop, jednostka wirującego dysku, kamera CCD, lasery, fluorescencyjne źródło światła, normalne źródło światła, zmotoryzowany stolik i automatyczne migawki).
    UWAGA: Do osiągnięcia pełnej równowagi temperaturowej wszystkich urządzeń potrzeba więcej niż 1 godzina.
  2. W razie potrzeby zmień pożywkę w naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm na żądaną pożywkę do akwizycji. Umieść czaszę na stoliku konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem w komorze o kontrolowanej temperaturze.
    UWAGA: Ze względu na aberrację sferyczną zapewniającą optymalną obserwację pod mikroskopem idealne jest użycie szklanej płytki o dnie 3,5 cm ze szkłem nakrywkowym nr 1,5 (o grubości około 0,16–0,19 mm). Jeśli używany obiektyw jest wyposażony w kołnierz korekcyjny, można skorygować obrazy uzyskane przy użyciu okularów nakrywkowych o grubości mniejszej niż 0,17 mm. Ponadto czerwień fenolowa ma lekką fluorescencję. Czasami lepiej jest użyć pożywki wolnej od czerwieni fenolowej, takiej jak DMEM bez czerwieni fenolowej. Jeśli nie ma urządzenia do kontrolowania stężenia CO2 na stoliku mikroskopu, lepiej jest użyć niezależnego od CO2 medium lub medium buforowanego przez HEPES do długotrwałego obrazowania poklatkowego.
  3. Wybierz drogę światła do okularów.
  4. Włącz migawkę źródła światła w jasnym polu. Dostosuj ostrość do komórek pod mikroskopem przez okulary. Wyłącz migawkę źródła światła w jasnym polu.
  5. Włącz migawkę fluorescencyjnego źródła światła. Znajdź komórki wyrażające białka fluorescencyjne pod mikroskopem przez okulary. Wyłącz migawkę fluorescencyjnego źródła światła.
  6. Opcjonalnie> Naciśnij przycisk aktywacji, aby uzyskać idealny system ustawiania ostrości przed mikroskopem, aby włączyć idealny system ustawiania ostrości, aby utrzymać stałą ostrość podczas akwizycji poklatkowej.
  7. Zmień drogę światła do mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Dostosuj odpowiednio ustawienia akwizycji za pomocą oprogramowania operacyjnego, sprawdzając obrazy wyświetlane na ekranie. (np. ostrość, moc lasera, czas ekspozycji, wzmocnienie kamery CCD i przesunięcie)
  8. Ustaw ustawienia akwizycji obrazu fluorescencyjnego za pomocą oprogramowania operacyjnego. Przykład: Wybierz "Zmień kanały za pomocą ścieżek światła" i "Kanał 1: EGFP", aby uzyskać sygnał fluorescencyjny z EGFP dla kanału pierwszego.
  9. Ustaw częstotliwość między punktami czasowymi, konfigurując ustawienia poklatkowe w celu robienia zdjęć poklatkowych za pomocą oprogramowania operacyjnego. Przykład: Aby uzyskać jeden punkt czasowy co 5 minut, wybierz z menu rozwijanego opcję "Minuty na punkt czasowy" i wprowadź wartość 5 w polu tekstowym.
    UWAGA: Wybierz "Maksymalna prędkość", aby nagrać film z rzeczywistą prędkością. Jeśli ekspresja białka fluorescencyjnego jest niska, fluorescencja może szybko wyblaknąć podczas akwizycji poklatkowej. W takim przypadku lepiej jest zmniejszyć liczbę punktów czasowych akwizycji.
  10. Rozpocznij akwizycję poklatkową, klikając przycisk "start", aby uzyskać sekwencję obrazów.
    UWAGA: Lepiej nie korzystać z funkcji akwizycji wielopunktowej. Może to spowodować utratę ostrości lub ruchu pola obrazowania podczas obrazowania poklatkowego.

4.2) Analiza pozyskanych obrazów

UWAGA: Pozyskane obrazy mogą być odtwarzane jako plik filmowy i analizowane za pomocą oprogramowania do analizy.

  1. Wybierz pozyskane obrazy, które mają zostać dołączone do filmu. W razie potrzeby przytnij interesujące obszary z obrazów i wybierz interesujące punkty czasowe, aby zmniejszyć rozmiar pliku filmu za pomocą oprogramowania operacyjnego.
  2. Eksportuj obrazy jako plik filmowy w formacie AVI lub MOV. Wybierz format filmu z menu rozwijanego "Format" i czas wymagany dla gotowego filmu, a następnie kliknij "Eksportuj". UWAGA: Obrazy poklatkowe robione w jednym punkcie czasowym co 5 minut mogą być odtwarzane jako film z szybkością 10 klatek na sekundę, czyli 3 000 razy szybciej niż rzeczywista szybkość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować tę technikę, w celu ekspresji białek znakowanych EGFP (enhanced green fluorescent protein) w komórkach wykorzystano lentiwirus kodujący Cx43 (Connexin43) znakowany EGFP lub zmutowaną formę Cx43 32, natomiast do wyłączenia sygnalizacji FGF w komórkach użyto adenowirusa kodującego FGFR1DN (fibroblast growth factor receptor 1 dominant negative) 33-35. Trzy dni po izolacji kardiomiocytów, wyizolowane komórki poddano transdukcji lentiwirusem w celu ekspresji białek znakowanych EGFP. Nastę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kardiomiocyty pierwotne wyizolowane od nowonarodzonych szczurów od dawna są wykorzystywane do badania funkcji kardiomiocytów in vitro. Protokół ten opisuje metodę izolacji kardiomiocytów noworodków od młodych szczurów przy użyciu dwuetapowej metody trawienia enzymatycznego, najpierw trawienia trypsyną O/N w temperaturze 4 °C, a następnie oczyszczonej kolagenazy. Jedną z zalet stosowania etapu oczyszczonej kolagenazy jest to, że ten sam gatunek enzymu jest używany do wszystkich izolacji. Tak więc jakość i ilość i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Alengo Nyamay'antu i dr Ilse Timmerman za ich porady dotyczące opakowań lentiwirusowych. Praca ta jest wspierana przez American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 Nożyczki do dekapitacjiAutoklaw WPI501749przed użyciem
1 Cienkie nożyczki do izolacji serca i siekaniaAutoklaw WPI14393przed użyciem
2 Kleszczyki drobnoziarniste (Dumont nr 5)AutoklawSigmaF6521
3 Sterylizowane naczynia plastikowe 10 cmSigmaCLS430165Do izolacji serca
3,5 cm Szklane dno Naczynia hodowlaneMatTekP35G-1.5-20-CDo końcowego posiewu kardiomiocytów do przyszłego obrazowania żywych komórek. Mikro-Naczynia firmy ibidi są akceptowalną alternatywą.
3,5 cm Naczynia hodowlane ze szklanym dnemMatTekP35G-0.17-14-CDo TIRF lub obrazu o wysokiej rozdzielczości
Roztwór etanolu, 70% (v/v) w wodzieSigmaE7148
2% ŻelatynaSigmaG1393
1 Sterylizowane plastikowe naczynie 10 cmSigmaCLS430165Do trypsynizacji
Folia aluminiowaDowolna marka
ParafilmSigmaP7543
Dwie 10 cm plastikowe naczynie do hodowli komórkowychSigmaCLS430165Do wyboru
AutopipetaDrummond Scientific4-000-300Do rozcierania
Licznik
Celometr, automatyczny licznik komóreknexcelomDo sprawdzania i liczenia komórek
Mikroskop i hematocytometrDowolna markaAby sprawdzić i policzyć komórki
Niebieski roztwór trypanu, 0,4%invitrogen15250-061
Inkubator CO2SanyoMCO-19AIC
Wytrząsarka orbitalna inkubacyjnaSigmaZ673129Aby wstrząsnąć tkanką serca kolagenazą w temperaturze 37 & stopni; C przy 170-200 obr./min
10 mg/ml roztwór BrdUBD Pharmingen550891
DMEM, invitrogen o wysokiej zawartości glukozy41965039Wymieszaj podłoże zgodnie z protokołem i podgrzej przed użyciem
MEMinvitrogen31095029Wymieszaj podłoże zgodnie z protokołem i ogrzej przed użyciem
Płodowa surowica bydlęcainvitrogen26140079
Penicylina-streptomycyna (10 000 j./ml) invitrogen15140-122
Sekcja 2 Transdukcja
3 Plazmidy
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
Wektor przenoszenia lentiwirusa, pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM (pożywka bez surowicy)invitrogen31985070
Odczynnik
polietylenoimina" Max", (MW 40 000) - liniowy PEI o wysokiej sile działania (odpowiednik Mw 25 000 w wolnej formie podstawowej) Polysciences24765-2Można go zastąpić X-tremeGENE 9 firmy Roche
X-tremeGENE 9Roche6365779001zastąpić PEI jako odczynnik do transfekcji
ChlorochinaSigmaC6628Rozpuść się w wodzie i przygotuj 100 mM roztwór podstawowy. Zahamowanie zakwaszenia endosomalnego można osiągnąć za pomocą 10-100 μ M Chlorochina.
HEPESSigmaH3375
10 ml strzykawka Luer-Lok, sterylizowanaBD309604
0,45 μ m filtrySigmaF8677Używaj wyłącznie filtrów z octanu celulozy lub polieterosulfonu (PES) (o niskim poziomie wiązania białek). Nie używaj filtrów nitrocelulozowych. Nitroceluloza wiąże białka powierzchniowe na otoczce lentiwirusowej i niszczy wirusa.
Bromek heksadimetrynySigmaH9268Rozpuść w wodzie i przygotuj 8 mg / ml roztworu podstawowego, a następnie przefiltruj go w celu sterylizacji.
Glikol polietylenowy 6,000Sigma81260
Chlorek soduSigmaS9888
Wodorotlenek soduSigmaS5881
Sekcja 3 Transdukcja
Komórki HEK 293TATCCCRL-11268
Około 10 cm szalki do hodowli komórkowychSigmaCLS430165
96-dołkowa mikropłytka z pokrywką, płaskie dno, hodowla tkankowa, sterylnaBD Falcon353072Do miareczkowania
Pipeta wielokanałowa, 10-100 μ l, 8-kanałowyeppendorf3122 000.035
Sekcja 4 Obrazowanie
Wirujący dysk mikroskop konfokalnyPerkinElmerL7267000
Komora z kontrolowaną temperaturą DowolnamarkaAby utrzymać temperaturę na poziomie 37 & stopni; C
A System środowiskowy CO2Dowolna markaOpcjonalnie w celu utrzymania optymalnego stężenia CO2
> CO2 Niezależna pożywka, bez invitrogenu glutaminy18045-054   Do długiego obrazowania poklatkowego
DMEM, wysoki poziom glukozy, HEPES, bez czerwieni fenolowejinvitrogen21063-029Do długotrwałego obrazowania poklatkowego
przed użyciemkomóreklentiwirusowapakującedo transfekcjiadenowirusoważywych komórek

Bibliografia

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transdukcja adenowirusowaobrazowanie poklatkoweprotokół izolacji komórekbiałko z etykietą EGFPdominujący negatywny FGFRszalki z szklanym dnemsystem autofokusa
Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.