Artykuł metodologiczny

Analiza uszkodzeń nabłonka wywołanych zakażeniem Entamoeba histolytica

DOI:

10.3791/51668

⸱

12 czerwca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 2Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, 3Agency for Knowledge Commercialization, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie człowieka przez Entamoeba histolytica prowadzi do amebii, głównej przyczyny biegunki w krajach tropikalnych. Zakażenie jest inicjowane przez interakcje patogenu z komórkami nabłonka jelitowego, powodując otwarcie kontaktów komórka-komórka, a w konsekwencji biegunkę, po której czasami następuje zakażenie wątroby. W tym artykule przedstawiono model do oceny wczesnych interakcji gospodarz-patogen, aby lepiej zrozumieć patogenezę amebiozy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entamoeba histolytica jest czynnikiem wywołującym ludzką amebię, główną przyczyną biegunki i ropnia wątroby w krajach tropikalnych. Zakażenie jest inicjowane przez interakcję patogenu z komórkami nabłonka jelitowego. Ta interakcja prowadzi do zakłócenia struktur międzykomórkowych, takich jak połączenia ścisłe (TJ). TJ zapewnia uszczelnienie warstwy nabłonka w celu oddzielenia tkanki gospodarza od światła jelita. Ostatnie badania dostarczają dowodów na to, że zakłócenie TJ przez pasożytnicze białko EhCPADH112 jest warunkiem wstępnym inwazji E. histolytica, której towarzyszy dysfunkcja bariery nabłonkowej. W związku z tym analiza mechanizmów molekularnych zaangażowanych w rozkład TJ podczas inwazji E. histolytica ma ogromne znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy amebiozy. W artykule przedstawiono prosty model, który pozwala na ocenę początkowych interakcji gospodarz-patogen oraz potencjału inwazji pasożyta. Parametry, które mają być analizowane, obejmują przeznabłonkowy opór elektryczny, oddziaływanie EhCPADH112 z receptorami powierzchni nabłonka, zmiany w ekspresji i lokalizacji markerów połączeń nabłonkowych oraz lokalizację cząsteczek pasożyta w komórkach nabłonkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entamoeba histolytica to jednokomórkowy pierwotniak odpowiedzialny za ludzką amebiasę, infekcję jelitową powodującą stan zapalny i biegunkę. E. histolytica zakaża do 50 milionów osób rocznie, ale tylko u około 10% zakażonych osób rozwijają się objawy związane z amebiazą1. Do zakażenia dochodzi po spożyciu skażonej żywności lub wody zawierającej cysty E. histolytica. W jelicie torbiele wytwarzają żywe trofozoity, które przylegają do mucyny okrężnicy i namnażająsię 2. Trofozoity zwykle tworzą torbiele, które są wydalane z kałem. W innych przypadkach i z nieznanych jeszcze przyczyn trofozoity przerywają warstwę nabłonka jelitowego i atakują leżące pod nią tkanki. W najgorszych przypadkach dostają się do krwiobiegu i wpływają na inne narządy, takie jak wątroba3.

Przerwanie bariery nabłonkowej wymaga przerwania transbłonowych struktur nabłonkowych, które utrzymują komórki połączone. Kontakty komórkowe nabłonka są tworzone przez wierzchołkowy kompleks połączeniowy składający się z połączeń ścisłych (TJ) i adherens (AJ) oraz desmosomów4. Najbardziej wierzchołkowymi połączeniami są TJ, a zatem są pierwszą barierą naruszoną przez E. histolytica i niektóre inne patogeny podczas inwazji gospodarza. TJ składają się z transbłonalnych receptorów adhezyjnych, takich jak klaudyny, okludyna i cząsteczki adhezji połączeniowej (JAM), które angażują się w homo- lub heterofilowe interakcje z receptorami sąsiedniej komórki. Są one wewnątrzkomórkowo związane przez cząsteczki rusztowania z rodziny zonula occludens (ZO), które łączą receptory adhezyjne z cytoszkieletem aktyny, aby zapewnić dalszą wytrzymałość mechaniczną nabłonka. TJ są odpowiedzialne za uszczelnienie tkanki jelitowej przed światłem jelita, zapobiegając nadmiernemu wyciekowi wody i substancji rozpuszczonej. W ten sposób, po tym, jak TJ zostanie zakłócony przez pasożyta, tkanki zostają zaatakowane. E. histolytica wydziela kilka cząsteczek, takich jak: (i) te zaangażowane w adhezję ameb do komórek docelowych5; (ii) czynniki błonowo czynne uczestniczące w zabijaniu komórek gospodarza przez egzocytozę, na przykład peptydy tworzące kanały jonowe, zwane amebapory6,7; oraz (iii) proteinazy, które degradują białka macierzy zewnątrzkomórkowej i pośredniczą w rozpadzie tkanek5,8,9.

Proteaza cysteinowa EhCP112 i cząsteczka adhezyjna EhADH112, które razem tworzą kompleks EhCPADH112, to dwa białka wirulencji E. histolytica, które odgrywają główną rolę w demontażu TJ 10. Żywe trofozoity, ich całkowite lizaty i wydzielane produkty indukują zmiany molekularne w kompleksie TJ i funkcjonalne zaburzenie bariery nabłonkowej. W tym badaniu wykazano, że EhCP112 i EhADH112 oddziałują z białkami okludyny i klaudyny-1, prowadząc do internalizacji i degradacji białek komórkowych, ułatwiając w ten sposób wejście E. histolytica przez szlak parakomórkowy.

Nasze dane oraz dane z innych grup11-17zdecydowanie sugerują konieczność specyficznych interakcji gospodarz-patogen, które umożliwiają inwazję pasożytów. Odkrycie molekularnych podstaw tych interakcji ma ogromne znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy amebiozy. Selektywne zaburzenie TJ przez trofozoity, charakteryzujące się zwiększoną przepuszczalnością parakomórkową, można zmierzyć poprzez zmniejszenie przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TER). Przenoszenie białek pasożytniczych w kierunku nabłonka gospodarza można określić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i konfokalnej mikroskopii laserowej, metody, która może również ujawnić kolokalizację czynników wirulencji ameb z nabłonkowymi markerami połączeniowymi wskazującymi na możliwe bezpośrednie interakcje. W tym artykule szczegółowo opisujemy, w jaki sposób komórki nabłonkowe i trofozoity są hodowane, zbierane i manipulowane w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen i ich konsekwencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zakładanie i utrzymywanie kultur E. histolytica

  1. Rosnąć aksenicznie (całkowicie wolne od wszelkich innych organizmów skażających) 1 x 105 trofozoitów szczepu Entamoeba histolytica HMl:IMSS klon A 18 w probówkach hodowlanych16 x 125 mm z nakrętkami teflonowymi (lub 1 x 106 trofozoitów w jednorazowej kolbie T-25) i 15 ml (lub 50 ml w kolbie T-25) podłoża TYI-S-33 (bulion TYI uzupełniony 3% mieszanką witamin diamentowych, 10% inaktywowanej termicznie surowicy dorosłego bydła, 0,5 j.m./ml penicyliny i 35 μg/ml streptomycyny)19 w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  2. Trofozoity należy zbierać w logarytmicznej fazie wzrostu, zwykle w odstępach 48-96 godzin (ryc. 1), schładzając probówki hodowlane przez 5-10 minut w łaźni lodowo-wodnej w celu uwolnienia trofozoitów przyczepionych do szklanej probówki hodowlanej.
  3. Przenieś kulturę do stożkowej probówki i odwróć ją kilka razy, aby rozproszyć komórki. Określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru (komora Neubauera) i przenieść inokulum do probówki hodowlanej zawierającej świeżą pożywkę TYI-S-33.
    1. Używaj małej liczby ameb na dłuższe okresy inkubacji (~3 x 105 komórek przez ~5 dni) i większej liczby na krótsze okresy (~1 x 10,6 komórek na ~1 dzień). Podczas gdy zliczone inokulacje są pożądane, ustalone kultury stają się przewidywalne, dzięki czemu możliwe jest oszacowanie ilości inokulacji.
    2. Miareczkowanie ilości trofozoitów, aby zoptymalizować liczbę komórek dla każdego eksperymentu.
    3. Utrzymuj równoległą zduplikowaną hodowlę, aby mieć kopię zapasową w przypadku niezamierzonego zanieczyszczenia lub pęknięcia rurki.
  4. Szczelnie zakryj probówki i inkubuj je w temperaturze 37 °C pod kątem 5° w poziomie.
  5. Regularnie sprawdzaj kultury poprzez oględziny, ponieważ nadmierny wzrost kultury może zawierać wiele zlizowanych komórek.

2. Ustanowienie i utrzymanie kultury MDCK

  1. Hodować komórki MDCK (Madin Darby Canine Kidney) typu I (wysoka odporność) w jednorazowych kolbach T-75 z 10 ml pożywki DMEM uzupełnionej penicyliną (100 j.m./ml), streptomycyną (100 mg/ml), insuliną (0,08 U/ml) i 10% surowicą cieląt noworodków w wilgotnej atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C.
  2. Aby podzielić komórki, sprawdź je pod odwróconym mikroskopem. Podziel komórki, gdy są ~ 85-100% zlewne.
  3. Użyj aspiratora próżniowego w sterylnym kapturze i sterylnej szklanej pipety Pasteura, aby usunąć pożywkę z kultury. Aby uniknąć skrobania komórek, odwróć kolbę do góry nogami i zasysaj pożywkę z dolnego rogu.
  4. Dozować 10 ml podgrzanego PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) do kolby T-75 (5 ml w przypadku kolby T-25) i delikatnie kołysać kolbą, aby przemyć komórki. Usunąć PBS przez aspirację próżniową. Wymagane jest dokładne mycie, ponieważ surowica hamuje trypsynę.
  5. Dozować 1,5 ml 0,05% trypsyny do kolby T-75 (w przypadku kolby T-25 użyć 0,5 ml) i delikatnie kołysać kolbą, aby pokryć warstwę komórek trypsyną.
  6. Inkubować przez 5-10 minut w inkubatorze (dokładny czas zależy od aktywności trypsyny).
  7. Sprawdź, czy komórki nie są oderwane, trzymając kolbę pod światło i poszukaj płynących komórek. Oderwanie komórek (zaokrąglone komórki) można również sprawdzić za pomocą mikroskopu. Często komórki uwalniają się szybciej po szybkim, delikatnym uderzeniu w bok kolby.
  8. Dodać 15 ml uzupełnionego DMEM do kolby T-75 (5 ml dla kolby T-25). Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 4 lub 5 razy.
  9. Aby rozmnażać komórki, rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:5 ze świeżo uzupełnionym DMEM. W tym momencie można również określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru, ale zwykle jest to konieczne tylko w przypadku dzielenia komórek na specjalne formaty dla niektórych testów.

3. Przygotowanie całkowitych lizatów trofozoitu

  1. Odłącz trofozoity od probówek hodowlanych, schładzając probówkę przez 5-10 minut w łaźni lodowato-wodnej. Przenieść kulturę w sposób aseptyczny do stożkowej probówki i odwirować przy 360 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant przez dekantację, dodać lodowaty PBS do osadu, kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu rozproszenia komórek i ponownie odwirować przy 360 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady podłoża TYI-S-33.
  2. Określ liczbę trofozoitów za pomocą hemocytometru.
  3. Liza trofozoitów w cyklach zamrażania i rozmrażania. Zamrozić odmierzone inokulum trofozoitów (600 000 trofozoitów/ml) rozcieńczone w lodowatym PBS, w ciekłym azocie przez 1 minutę. Rozmrozić próbkę w temperaturze 4 °C i energicznie przetrząsnąć. Powtórz zamrażanie i rozmrażanie 3 razy, aby zakończyć lizę komórek.
  4. Aktywuj proteazy obecne w lizatach za pomocą 0,02% β-merkaptoetanolu.

4. Przygotowanie produktów wydzielanych trofozoitem

  1. Wykonaj kroki od 3.1 do 3.2.
  2. Określ liczbę komórek i żywotność w tym momencie za pomocą hemocytometru i stosując test wykluczenia błękitu trypanowego20:
    1. Rozcieńczyć 9 x 106 trofozoitów w 3 ml lodowatego PBS i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pobrać 10 μl tej zawiesiny i dodać 1 μl 0,4% roztworu podstawowego błękitu trypanowego o pH 7,2.
    2. Użyj komory Neubauera do liczenia komórek w małym powiększeniu.
    3. Policz wszystkie komórki i oddziel liczbę niebieskich komórek, ponieważ niebieskie komórki wchłonęły barwnik i należy je uznać za martwe.
    4. Oblicz procent żywotnych komórek, dzieląc liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek i mnożąc przez 100.
  3. Przenieść stożkową rurkę zawierającą zawiesinę trofozoitów do inkubatora w temperaturze 37 °C na 2 godziny pod kątem poziomym pod kątem 5°.
  4. Aby zebrać wydzielane produkty, należy odwirować probówki o sile 360 x g przez 10 minut. Za pomocą jednorazowej i sterylnej strzykawki ostrożnie pobrać supernatant, unikając zanieczyszczenia próbek trofozoitami z osadu. Wyeliminuj wszelkie przeniesione komórki, przepuszczając supernatant przez membranę z octanu celulozy o wielkości 0,22 μm. Aktywuj proteazy za pomocą 0,02% β-merkaptoetanolu.
  5. Aby odrzucić przypuszczalne niepożądane zanieczyszczenie cząsteczkami uwolnionymi z martwych komórek, należy ponownie zastosować test wykluczania błękitu trypanowego pod kątem żywotności komórek. Żywotna i całkowita liczba komórek powinny być takie same, jak uzyskane w kroku 4.2. Jeśli tak nie jest, pobrany supernatant może zawierać nie tylko wydzielane białka i powinien zostać odrzucony.

5. Interakcja komórek MDCK z trofozoitami, lizatami trofozoitowymi lub produktami wydzielanymi

  1. Inkubować zlewające się monowarstwy komórek MDCK z żywymi trofozoitami (stosunek MDCK do ameby 1:1), lizatami trofozoitów (stosunek MDCK do ameby 1:2) lub wydzielanymi produktami (stosunek MDCK do ameby 1:10) w temperaturze 37 °C przez 2 i 30 minut (ryc. 2A).
  2. Umyj komórki nabłonka pięciokrotnie lodowatym PBS, aby wyeliminować niezwiązane cząsteczki lub trofozoity.

6. Przygotowanie próbek do immunofluorescencji

  1. Hodowla komórek MDCK na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w 24-dołkowym naczyniu do hodowli komórkowych. Sprawdź komórki pod mikroskopem odwróconym, aż osiągną 100% zbieżności. Następnie zastąpić pożywkę 1 ml świeżo uzupełnionej pożywki DMEM i przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na kolejne 24 godziny.
  2. Usunąć pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego i sterylnej szklanej pipety Pasteura i dodać 1 ml ciepłego PBS do każdej studzienki. Usuń PBS i powtórz pranie ze świeżym PBS. Uważaj, aby nie zeskrobać komórek z dna studzienki szklaną pipetą.
  3. Dodać trofozoity rozcieńczone w 1 ml ciepłego PBS w różnych warunkach: żywe trofozoity (T), całkowite lizaty trofozoitów (TL) i wydzielane produkty (SP).
    1. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze na 2 lub 30 minut.
    2. Przygotuj dwa warunki kontrolne: jeden o określonym czasie 0 min, w którym komórki MDCK nie powinny być inkubowane z E. histolytica, ale tylko z 1 ml ciepłego PBS; i drugi warunek jako kontrola przeciwciał drugorzędowych, w tym przypadku inkubacja MDCK z T, TL lub SP przez 2 lub 30 minut i pominięcie inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
  4. Umyj komórki nabłonka pięciokrotnie zimnym PBS, aby wyeliminować niezwiązane cząsteczki lub trofozoity.
  5. Utrwalić i przepuszczalnić komórki za pomocą 1 ml 96% etanolu przez 30 minut w temperaturze -20 °C.
  6. Aby usunąć etanol, wykonaj trzy szybkie płukania 1 ml PBS w temperaturze pokojowej.
  7. Wykonaj następujące czynności w wilgotnej komorze, aby uniknąć wysuszenia próbek:
    1. Użyj dowolnego dostępnego płaskiego pudełka, które można zamknąć i wypełnić mokrym ręcznikiem papierowym, na którym próbki można bezpiecznie umieścić. Na przykład puste pudełko na końcówki do pipet dobrze nadaje się do tego celu.
    2. Wewnątrz komory równomiernie ułożyć warstwę Parafilm i odpipetować 25 μl roztworu blokującego (0,5% BSA) dla każdego szkiełka nakrywkowego.
    3. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków za pomocą drobnych kleszczyków, ostrożnie usuń nadmiar płynu z krawędzi bibułą filtracyjną i umieść szkiełko nakrywkowe w kropli zawierającej roztwór blokujący (0,5% BSA) tak, aby komórki były skierowane w stronę roztworu blokującego. Inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych w PBS: mysi anty-EhCPADH112 IgM (mα-EhCPADH112; rozcieńczenie 1:10) i IgG królicze anty-ZO-1 (pα-ZO-1; rozcieńczenie 1:100).
  9. Umieścić świeży arkusz Parafilmu w wilgotnym pudełku i odpipetować 25 μl roztworu przeciwciał do każdego szkiełka nakrywkowego.
  10. Podnieść szkiełka nakrywkowe z roztworu blokującego, osuszyć nadmiar płynu na krawędziach za pomocą bibuły filtracyjnej i umieścić je w kroplach tak, aby komórki były skierowane w stronę roztworu przeciwciała. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  11. Umieścić każde szkiełko nakrywkowe w 24-dołkowym basenie (strona z komórkami na górze) i dodać 1 ml PBS.
    1. Przemyć pięć razy 1 ml PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek.
  12. Przygotować mieszaninę fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych w PBS: mysz anty-IgM kozła sprzężoną z FITC (rozcieńczenie 1:100) i kozia anty-IgG królika sprzężona z TRITC (rozcieńczenie 1:50).
  13. Umieścić świeży arkusz Parafilmu w wilgotnym pudełku i odpipetować 25 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdego szkiełka nakrywkowego.
  14. Przenieść próbki jak w ppkt 6.10 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności, aby uniknąć bielenia barwników fluorescencyjnych. Powtórz krok 6.11.1.
  15. W przypadku barwienia jądrowego inkubować przez 3 minuty z 200 μl 0,05 mM roztworu DAPI w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem. Powtórz krok 6.11.1.
  16. Aby zachować barwniki fluorescencyjne, umieść szkiełka nakrywkowe (komórki skierowane w dół) w 5 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu Vecta Shield na szklanych szkiełkach mikroskopowych. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci, aby uniknąć wyschnięcia próbki.
  17. W przypadku długotrwałego przechowywania szkiełka należy przechowywać w pudełku z szkiełkami mikroskopowymi w temperaturze -20 °C.
  18. Analizuj preparaty za pomocą mikroskopii konfokalnej przez przekroje stosu Z i płaszczyzny xz (ryc. 2A).

7. Inkubacja trofozoitów z inhibitorami proteazy lub specyficznym przeciwciałem

  1. Powtórz kroki od 3.1 do 3.2. Dla każdego warunku doświadczalnego inkubować 1 x 105 trofozoitów (zawieszonych w 50 μl PBS) z inhibitorami proteazy (1 mM Complete i 40 μg/ml E-64) lub 30 μg przeciwciała monoklonalnego przeciwko EhCPADH112 (mαEhCPADH112)21 przez 20 minut w 4 °C (Figura 2B). Preparaty te należy stosować do testów koinkubacji zgodnie z opisem w kroku 8.5.

8. Pomiar przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej (TER)

  1. Hodowla komórek MDCK na sterylnych przepuszczalnych podłożach transwell (wielkość porów 0,4 μm). W górnej komorze umieścić 100 μl zawiesiny komórkowej, a w dolnej komorze umieścić 600 μl uzupełnionej pożywki DMEM.
    1. Okresowo sprawdzaj poziom medium. W razie potrzeby można dodać świeże podłoże.
    2. Sprawdź komórki pod mikroskopem odwróconym, aż osiągną 100% zbieżności. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
    3. Aby poprawić przyczepność komórek (jeśli to konieczne), przed dodaniem zawiesiny komórek należy zrównoważyć filtry transwell przez noc w temperaturze 37 °C w DMEM.
  2. Wysterylizuj elektrody STX2 w okapie przez zanurzenie w etanolu, a następnie w sterylnym PBS na 15 minut każda, w świetle UV. Podłącz elektrody do woltoomomierza nabłonkowego EVOM i wybierz tryb rezystancji.
  3. Zebrać pożywkę z górnej komory każdej transwell i zebrać je. Pobrać 50 μl tej mieszaniny pożywek i połączyć ją z 50 μl zawiesiny trofozoitów (1 x 105 trofozoitów w PBS) lub tylko z PBS (kontrola). Użyj podobnej mieszanki dla każdego transwella.
  4. Dodać mieszaniny do górnej komory każdej transstułki zawierającej komórki MDCK. Warunki eksperymentalne obejmują komórki MDCK bez trofozoitów (kontrola), współhodowlę z trofozoitami lub z trofozoitami wstępnie inkubowanymi z inhibitorami proteazy lub mαEhCPADH112. Aby wyeliminować opór wytwarzany przez filtry, należy używać transwelli inkubowanych tylko z pożywką. Dla każdego warunku doświadczalnego należy użyć co najmniej trzech transwelli.
  5. Natychmiast zmierz TER, zanurzając elektrody STX2 w każdym transwellu.
    1. Upewnij się, że dłuższa elektroda dotyka dna dolnej komory, a krótsza elektroda jest pokryta medium w górnej komorze (patrz rysunek 2B).
    2. Upewnij się, że za każdym razem trzymasz elektrody prostopadle. To znacznie poprawi odtwarzalność. Unikaj przesuwania lub przechylania elektrody podczas pomiarów, ponieważ doprowadzi to do zmienności danych.
  6. Pomiar ten należy traktować jako początkową wartość TER. Następnie monitoruj TER przez następne 30 minut.
  7. Aby obliczyć końcową wartość TER, odejmij wartość TER tylko filtrów. Aby porównać wyniki różnych eksperymentów, znormalizuj każdy punkt danych do wartości początkowych, przyjmując je jako 100% (Rysunek 2B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby hodowla E. histolytica odniosła sukces, muszą być spełnione dwa ważne warunki: wzrost w warunkach aksonicznych i zbiór w fazie logarytmicznej. Wcześniej kultury E. histolytica były łatwo zakładane w połączeniu z niektórymi gatunkami bakterii lub trypanosomatidami22. Jednak w dzisiejszych czasach powszechna jest akseniczna hodowla tego pasożyta, co oznacza nieograniczoną subuprawę ameb w środowisku wolnym od metabolizujących bakterii, grzybów, pierwotniaków lub komórek metazoan. Dodatkowo,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu zbadania interakcji gospodarz-patogen in vitro podczas zakażenia nabłonka przez E. histolytica, kluczowa jest praca z dobrze znanymi kulturami zarówno komórek nabłonkowych, jak i trofozoitów. Na przykład, dawniej, kultury E. histolytica były zwykle zakładane w połączeniu z pewnymi gatunkami bakterii lub trypanosomatidami22,23. Jednak jednoczesna hodowla kultur E. histolytica przynosi efekt przeciwny do zamierzonego w badaniu interakcji gospodarz-patogen, ponieważ zaob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Instytutu Nauki i Technologii Dystryktu Federalnego (ICyTDF, 64/2012 dla EO) oraz Meksykańskiej Rady ds. Nauki i Technologii (Conacyt, 179895 do MS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Klon A Szpital IMSS, MeksykBez/liczbazjadliwych trofozoitów18 
TYI bulionBecton, Dickinson and Company
Merck
Merck
Merck
J.T. Baker
Reproquifin
SIGMA-Aldrich
SIGMA-Aldrich		211862
K35625437 626
21578
4873
3252-01
CAS 50-81-7
C7880
F-5879		3,45% peptonu biosatu BBL
58 mM glukozy
39 mM NaCl
5 mM KH2PO4
6,5 mM K2HPO4
16,3 mM kwas askorbinowy
8,1 mM L-cysteina
0,1 mM cytrynian żelazowo-amonowy, dostosuj pH 6,819
Surowica bydlęca dla dorosłychMicrolab , Labs., Mex.SU146Stosować w stężeniu 10% i inaktywować do 56 ° C przez 30 min
Diament  witamina  mieszanina- Tween 80In vitroSR-07Stosować w stężeniu 3%
Penicyliny Nad jeziorem,  Méx.34564SSA IV0,5 j.m./ml
Streptomycyny Nad jeziorem,  Méx.75757SSA IV35 &mikro; g/ml
Pyrex 15 ml probówki hodowlane z nakrętką z nakrętką fenolową wyłożoną PTFECorning-Pyrex9826-16X16 x 125 mm, pojemność 15 ml i nakrętki wykonane ze specjalnej formuły odpornej na działanie temperatury
Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkoweCorning-Costar3516Sterylne płytki, średnica studzienki 34,8 mm i obszar wzrostu 9,5 cm2.  Pierścienie na pokrywie zapobiegają zanieczyszczeniu krzyżowemu
25 cm2 kolba do hodowli komórkowychCorning-Costar430168Kolby z przechyloną szyjką
MDCK (nerka psa Madina Darby'ego) typ IKolekcja kultur typu amerykańskiegoCCL34Komórki nabłonka nerki wyhodowane między pasażem 60th a 90th
DMEM medium Gibco 12800-017Dulbecco's Modified Eagle Medium o wysokiej zawartości glukozy.
Surowica cielęca noworodkówIn vitroS-02Stosować w dawce 10%.   
Mieszanina penicyliny/streptomycyny In vitro A-01Roztwór podstawowy 10 000 U/&mikro; g/ml
Insulina   AMSA398MJ94SSA IVRoztwór podstawowy 100 j.m./ml
Roztwór trypsyny In vitroEN-0050,05% roztwór enzymatyczny bez wapnia i magnezu
75 cm2 kolba do hodowli komórkowychCorning-Costar430720Kolby z szyjką skośną do hodowli trofozoitów w podłożu TYI-S-33
Przepuszczalne nośniki TranswellCorning-Costar34700,4 &mikro; m Membrana poliestrowa, wkładka 6,5 mm w płytce 24-dołkowej, obszar wzrostu 0,3 cm2
24-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych   Corning-Costar3524Przezroczysty polistyren, poddany obróbce w celu optymalnego przylegania komórek, sterylizowany promieniowaniem gamma i certyfikowany jako niepirogenny
KompletnyRoche11836 153 001hamuje szerokie spektrum seryny, cysteiny i metaloproteaz. Stężenie końcowe 1 mM 
Trans-epoksysukcynylo-L-leucyloamido (4-guanidyno)butan (E-64)SIGMA-AldrichE3132Inhibitor proteazy cysteinowej, stężenie końcowe 40 &mikro; g/ml
pα ZO-1 Invitrogen402200IgG królik poliklonalny  przeciwciało  przeciw  syntetycznemu peptydowi w środkowym regionie ludzkiego białka m&alfa ZO-1
; EhCPADH112Domowe przeciwciałobez/ liczbyIgM mysiego przeciwciała monoklonalnego  przeciw  epitopowi 444-601 znajdującemu się na C-końcu EhCPADH11221,27FITC-koza
anty-mysia IgMZymed62-6811Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-znakowany kozią anty-myszą wtórną  przeciwciało
TRITC- kozie anty-królicze IgG (H+L)Zymed816114Izotiocyjanian tetrametylo-rodaminy (TRITC)  kozie przeciwciało anty-królicze IgG  przeciwciało drugorzędowe.
Światowy instrument precyzyjny elektrody STX2 102711Składa się ze stałej pary podwójnych elektrod o szerokości 4 mm i grubości 1 mm. Każda sztyft pary elektrod zawiera osad srebro/chlorek srebra do pomiaru napięcia oraz srebrną elektrodę do przepuszczania prądu. Do użytku z
woltoomomierzem nabłonkowym EVOM EVOMWorld Precision Instrument 12111Używaj w trybie rezystancyjnym i utrzymuj odłączony podczas pomiarów TER
Komora NeubaueraMEARIENFELD610610Hemocytometr 
Leica TCS_SP5_MOLeicaBez/numerycznaLaserowa mikroskopia konfokalna z oprogramowaniem Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN
VectashieldVector Laboratories, Inc.H-1000Pożywka montażowa do fluorescencji
4',6-diamino-2-fenyloindol (Dapi)SIGMAD-95420,05 mM stężenie końcowe
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)US BiologicalA-13100,5%  końcowe stężenie dla roztworu blokującego
koktajl inhibitorów proteazy Mini

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
  2. Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
  3. Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
  4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
  5. Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
  6. Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
  7. Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
  8. Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
  9. Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
  10. Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
  11. Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
  12. Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
  13. Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
  14. Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
  15. Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
  16. Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
  17. Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
  18. Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
  19. Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
  21. Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
  22. Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
  23. Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
  24. Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
  25. Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
  26. Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
  27. Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
  28. Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
  29. Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozpad po cze cis ychfunkcja bariery nab onkowejtransepitelialny op r elektrycznyanaliza immunofluorescencyjnamikroskopia konfokalnainterakcja paso yt gospodarzmarker ZO 1opracowanie inhibitorem proteazhodowla kom rek nab onkowych

Powiązane artykuły