Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Podsumowanie

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi <30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Streszczenie

Poprzednio opisane metody izolacji mitochondriów za pomocą wirowania różnicowego i/lub wirowania gradientowego Ficoll wymagają od 60 do 100 minut. Opisujemy metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji ssaków przy użyciu komercyjnego dysocjatora tkanek i filtracji różnicowej. W tym protokole ręczna homogenizacja została zastąpiona standaryzowanym cyklem homogenizacji dysocjatora tkankowego. Pozwala to na jednolitą i spójną homogenizację tkanki, co nie jest łatwe do osiągnięcia przy ręcznej homogenizacji. Po dysocjacji tkanek homogenat jest filtrowany przez nylonowe filtry siatkowe, które eliminują powtarzające się etapy wirowania. Dzięki temu izolację mitochondriów można wykonać w czasie krótszym niż 30 minut. Ten protokół izolacji daje około 2 x 10¹⁰ żywotnych i kompetentnych do oddychania mitochondriów z 0,18 ± 0,04 g (mokrej masy) próbki tkanki.

Wprowadzenie

Mitochondria istnieją w każdej komórce ciała z wyjątkiem czerwonych krwinek i biorą udział w wielu ważnych procesach komórkowych i metabolicznych^1-4. Ze względu na te wiele funkcji uszkodzenie mitochondriów może mieć szkodliwe skutki³. W celu zbadania funkcji i dysfunkcji mitochondriów opisano kilka metod izolacji mitochondriów. Najwcześniejsze opublikowane opisy izolacji mitochondriów pochodzą z lat czterdziestych XX wieku,^5-8. Pierwsza udokumentowana próba wykazała izolację mitochondriów poprzez rozdrobnienie tkanki wątroby w moździerzu, a następnie odwirowanie w roztworze soli z niską prędkością^5,8. Później inne grupy rozszerzyły pierwotną procedurę i wykazały frakcjonowanie tkanek w oparciu o wirowanie różnicowe^6-8. Te wczesne metody stanowiły podstawę obecnych technik, które często obejmują homogenizację i/lub wirowanie różnicowe^9-15. Liczba etapów homogenizacji i wirowania różni się w zależności od protokołu. Te powtarzające się kroki wydłużają czas izolacji mitochondriów i ostatecznie zmniejszają żywotność. Ponadto ręczna homogenizacja może powodować uszkodzenie mitochondriów i niespójne wyniki, jeśli nie jest odpowiednio kontrolowana^10,16.

Ostatnio użyliśmy homogenizacji i wirowania różnicowego, aby wyizolować mitochondria do przeszczepu do tkanki mięśnia sercowego^17,18. Ta długa procedura izolacji trwała około 90 minut, w związku z czym możliwość zastosowania klinicznego tej metody była ograniczona. Aby umożliwić ostre zastosowanie terapeutyczne w leczeniu klinicznym i chirurgicznym, opracowaliśmy procedurę szybkiej izolacji mitochondriów, którą można wykonać w czasie krótszym niż 30 minut.

Główne zalety tego protokołu to, że standaryzowana dysocjacja tkanek pozwala na jednolitą i konsekwentną homogenizację tkanki, co nie jest łatwe do osiągnięcia przy ręcznej homogenizacji. Ponadto zastosowanie filtracji różnicowej zamiast wirowania różnicowego eliminuje czasochłonne i powtarzalne etapy wirowania, co pozwala na szybszą izolację wysoce oczyszczonych, żywotnych i kompetentnych do oddychania mitochondriów.

Zdolność do izolowania żywotnych i kompetentnych do oddychania mitochondriów w czasie krótszym niż 30 minut pozwala na kliniczne zastosowanie. Ten protokół izolacji może być stosowany w chirurgii pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG) i innych procedurach terapeutycznych.

Protokół

Przygotowanie

1. Przygotować 1 M roztwór podstawowy K-HEPES (doprowadzić pH do 7,2 za pomocą KOH).
2. Przygotować 0,5 M roztwór podstawowy K-EGTA (doprowadzić pH do 8,0 za pomocą KOH).
3. Przygotować 1 m KH₂PO₄ roztwór podstawowy.
4. Przygotować 1 M MgCl₂ roztwór podstawowy.
5. Przygotować bufor homogenizujący (pH 7,2) 300 mM sacharozy, 10 mM K-HEPES i 1 mM K-EGTA. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
6. Przygotować bufor oddechowy 250 mM sacharozy, 2 mM KH₂PO_4, 10 mM MgCl_2, 20 mM K-HEPES bufor (pH 7,2) i 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
7. Przygotować 10 x PBS roztwór podstawowy, rozpuszczając 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na₂HPO₄ i 2,4 g KH₂PO₄ w 1 l podwójnie destylowanego_H2O(pH 7,4).
8. Przygotować 1 PBS przez pipetowanie 100 ml 10 PBS do 1 l podwójnie destylowanego_H2O.
9. Przygotuj subtylizynę A, odważając 4 mg subtylizyny A do probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
10. Przygotuj bulion BSA, odważając 20 mg BSA do 1,5 ml probówki do mikrofuge. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

Izolacja mitochondrialna (Rysunek 1)

1. Bezpośrednio przed izolacją rozpuścić subtylizycynę A w 1 ml buforu homogenizującego.
2. Bezpośrednio przed izolacją rozpuścić BSA w 1 ml buforu homogenizującego.
3. Zebrać dwie świeże próbki tkanek za pomocą stempla do biopsji o średnicy 6 mm i przechowywać w 1x PBS w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.
4. Przenieść dwa 6-milimetrowe stemple tkanki do probówki C do dysocjacji zawierającej 5 ml lodowatego buforu homogenizującego.
5. Homogenizuj tkankę, umieszczając rurkę dysocjacyjną C na dysocjatorze tkankowym i wybierz wstępnie ustawiony cykl izolacji mitochondriów (homogenizacja 60 sekund).
6. Wyjmij rurkę C dysocjacji do wiadra na lód.
7. Dodać 250 μl roztworu podstawowego subtylizyny A do homogenatu, wymieszać przez inwersję i inkubować homogenat na lodzie przez 10 minut.
   1. Fakultatywnie w przypadku, gdy tkanka jest włóknista: Odwirować roztwór o stężeniu 750 x g przez 4 minuty.
8. Umieścić filtr siatkowy o wielkości 40 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie i wstępnie zwilżyć filtr buforem homogenizującym, a następnie przefiltrować homogenat do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.
9. Dodać 250 μl świeżo przygotowanego roztworu podstawowego BSA do filtratu i wymieszać przez inwersję.
   Uwaga: Pomiń ten krok, jeśli wymagane jest oznaczanie białka mitochondrialnego.
10. Umieścić filtr o wielkości 40 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie i wstępnie zwilżyć filtr buforem homogenizującym, a następnie przefiltrować homogenat do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.
11. Umieścić filtr 10 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie i wstępnie zwilżyć filtr buforem homogenizującym, a następnie przefiltrować homogenat do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.
12. Przenieść filtrat do dwóch wstępnie schłodzonych probówek do mikrofugowania o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 9 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
13. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić i połączyć granulki w 1 ml lodowatego buforu oddechowego.

Test ATP

Uwaga: Aby określić aktywność metaboliczną izolowanych mitochondriów, można przeprowadzić test luminescencji ATP przy użyciu zestawu do testowania ATP. Protokół, odczynniki i wzorce zostały dostarczone w zestawie testowym. Podsumowanie procedury opisano poniżej.

1. Wyrównaj odczynniki z zestawu do RT.
2. Przygotować 10 mM roztwór podstawowy ATP, rozpuszczając liofilizowany granulat ATP w 1,170 μl podwójnie destylowanej wody. Przechowywać na lodzie roztwór podstawowy wzorca ATP i przygotowane próbki mitochondrialne.
3. Dodać 5 ml roztworu buforu substratowego do fiolki z liofilizowanym roztworem substratu. Delikatnie wymieszaj i umieść w ciemności.
4. Dodać 100 μl buforu oddechowego do wszystkich studzienek na czarnej, nieprzezroczystej płytce 96-dołkowej z dnem.
5. Dodać 10 μl mitochondriów z przygotowanych próbek do każdej studzienki czarnej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej. Uwaga: Próbki są platerowane w trzech egzemplarzach. Dołączyć wiersz dla norm i trzy studzienki dla kontroli ujemnej (bufor oddechowy).
6. Dodać 50 μl roztworu do lizy komórek ssaków do wszystkich studzienek, w tym wzorców i kontroli.
7. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 125 obr./min.
8. Podczas inkubacji należy przygotować wzorce ATP w stężeniach 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM i 0,0001 mM ATP z 10 mM roztworu podstawowego ATP. Przechowuj standardy na lodzie.
9. Po inkubacji dodać 10 μl wzorców ATP do odpowiednich studzienek, jak wskazano na mapie płytkowej. Uwaga: Normy są wykonywane w dwóch egzemplarzach.
10. Do każdej studzienki dodać 50 μl odtworzonego roztworu substratu.
11. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej przez 5 minut przy 125 obr./min.
12. Otwórz oprogramowanie Gen5 1.11 na komputerze połączonym ze spektrofotometrem.
13. W sekcji "Utwórz nowy element" kliknij "Eksperymentuj".
14. Kliknij "Protokół domyślny". Kliknij "OK".
15. W lewej kolumnie wybierz "Protokół", a następnie "Procedura".
16. Wybierz "Opóźnienie". Ustaw wartość 00:10:00. Kliknij "OK".
17. Wybierz "Czytaj". Wybierz "Luminescencja" z menu rozwijanego. Dostosuj inne ustawienia do następujących: Typ odczytu Punkt końcowy, Czas integracji 0:01.00 MM:SS.ss, Zestawy filtrów 1, Otwór emisyjny, Pozycja optyki u góry, Czułość 100, Przesunięcie pionowe górnej sondy 1,00 mm.
18. Gdy płyta jest gotowa do analizy, kliknij ikonę "Przeczytaj płytę" w górnym wierszu. Kliknij "Czytaj". Gdy spektrofotometr się otworzy, umieść płytkę w tacy z dołkiem A1 w lewym górnym rogu. Otworzy się pudełko z temperaturą. Kliknij "Czytaj". Uwaga: Wyższe wartości korelują ze zwiększonym poziomem ATP i wyższą aktywnością metaboliczną.

Wyniki

Schemat przedstawiający kolejne kroki procedury izolacji mitochondriów z wykorzystaniem dysocjacji tkanki i filtracji różnicowej pokazano na Rysunku 1. Całkowity czas trwania procedury wynosi mniej niż 30 min.

Próbki tkanki pobrano za pomocą 6 mm wycinaka do biopsji. Masa tkanki wynosiła 0,18 ± 0,04 g (masa mokra). Liczba wyizolowanych mitochondriów, określona poprzez zliczanie cząstek, wyniosła 2,4 x 10¹⁰ ± 0,1 x 10¹⁰ mitochondriów dla mięśnia szkieletow...

Dyskusja

Aby skutecznie wyizolować mitochondria przy użyciu tego protokołu, konieczne jest przechowywanie wszystkich roztworów i próbek tkanek na lodzie, aby zachować żywotność mitochondriów. Nawet gdy są utrzymywane na lodzie, izolowane mitochondria będą wykazywać spadek aktywności funkcjonalnej w czasie¹⁹. Zalecamy, aby wszystkie rozwiązania i dodatki były wcześniej przygotowane. Subtylizyna A jest wstępnie ważona i przechowywana w porcjach 4 mg w probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i przechowywana w temperat...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sacharoza	Sigma Aldrich	84100
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Substilsin A	Sigma Aldrich	P5380
BSA	Sigma Aldrich	A7906
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite System oznaczania luminescencji, zestaw do oznaczania 1,000	Perkin Elmer
50 ml Probówki stożkowe	BD	352098
40 μ m Filtry nylonowe	BD	352340
Rurka C GentleMACS	Miltenyl Biotech	120-005-331
1,5 ml Probówka Eppendorf	Fisher Scientific	05-408-129
Dziurkacz do biopsji 6 mm	Miltex	33-36
10 μ m Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Wirówka Eppendorf 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
Dysocjator GentleMACS	Miltenyl Biotech	130-093-235
Płytki 96-dołkowe, poddane hodowli tkankowej	VWR	82050-732
Wytrząsarka orbitalna Rotomax 120	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode   Czytnik mikropłytek	BioTek
Multisizer 4 Licznik redlic	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm System	Hansatech Instruments
	Fisher Scientific	267110